Name: Een Ex-ovo Chicken Embryo Cultuur systeem geschikt voor Imaging en microchirurgie toepassingen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-23T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Leer een ex-ovo kippenembryocultuurmethode voor embryogenesestudies met volledige optische toegankelijkheid. Dit systeem maakt micro-injectie, echografie en microchirurgie mogelijk voor ontwikkelingsbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Ex-ovo-Cultuur Protocol: <ol><li> Incubeer bevruchte kippeneieren <ol class="lroman"><li> Bevruchte kippeneieren kan worden opgeslagen bij 13 ° C tot 5 dagen vóór de incubatie zonder inleiding ontwikkeling. Een rode wijn cooler kan handhaven deze temperatuur. </li><li> Incubeer de eieren stompe kant naar boven in een 60% constante luchtvochtigheid incubator met continue rocken bij 37,5 ° C gedurende 72 uur. </li></ol></li><li> Bereid hangmatten (figuur 1a) <ol class="lroman"><li> Vul ¾ van 9 oz plastic bekers met warm steriel water. Een regelmatige 9 oz beker heeft een top diameter van 8 cm. Wij vonden dat dit formaat het meest geschikt is voor lange tijd de cultuur toepassing hier gepresenteerd. </li><li> Snij ongeveer 20 cm vastklampen wrap. Brengen de omtrek op de top van de beker door het plaatsen van een rubberen band om. Plastic moet worden verspreid op de top van het water. Snijd de overtollige plastic rond de band. We vonden vastklampen wrap het meest geschikt voor deze toepassing, omdat het voorkomt aanhechting van de dooier, resulterend in de dooier splitsen tijdens het transport. </li><li> Veeg de kunststof met kimwipes (Kimberly-Clark, Inc), bevochtigd met 70% ethanol. </li></ol></li><li> Verwijder de eieren van incubator na 72 uur incubatie. </li><li> Steriliseren eieren door af te vegen oppervlak met 70% ethanol bevochtigd kimwipes. </li><li> Horizontaal leggen de eieren 1-2 minuten voor een goede positionering van het embryo (Figuur 1b). Een eierdoos kan worden gebruikt voor het leggen van eieren horizontaal. Embryo's zal draaien naar de top na 1-2 minuten. </li><li> Transfer embryo's op hangmatten aseptisch in een laminaire stroming kap. <ol class="lroman"><li> Met behulp van een scherpe rand (zoals de rand van een metalen emmer of een glazen beker), tik het ei tot er een klein deukje aan de onderkant van het ei (figuur 1c). Vergeet niet, is het embryo geplaatst op de bovenzijde. </li><li> Zet duimen in tegenovergestelde zijden van de deuk en trek de schelpen uit elkaar horizontaal (figuur 1d). </li><li> Leg de dooier met embryo als albumine op de hangmat (figuur 1e). Albumine zal zorgen voor een demping omgeving rond de dooier aan schokken veroorzaakt door het bewegen van het systeem zo goed als geeft voeding aan de embryo voor een lange culturele praktijken op te nemen. Water onder de hangmat zorgt voor de embryo zal parallel blijven aan de grond tijdens het transport en dienen als een geleider van warmte tijdens de beeldvorming als een water circulatie verwarming wordt gebruikt. </li><li> Het embryo moet nu al worden geplaatst op de top als de overdracht goed is uitgevoerd. Zo niet, gebruik een onscherp, steriele object (dwz Blunt tip van gesloten gebogen schaar) en directioneel strelen de dooier zodanig dat het embryo draait naar de top. </li><li> Plaats een diameter van 10 cm Petrischaal op de top van de beker voor het embryo afdichting. </li></ol></li><li> Plaats een kopje cultuur in de couveuse ingesteld op 37,5 ° C. Als een draagbare incubator wordt gebruikt, het plaatsen van 01-02 september oz cups gevuld met gedestilleerd water houdt de luchtvochtigheid op ~ 60% (zie figuur 1f). </li><li> Als het kweken van embryo's buiten embryonale dag 7, moet verpletterd eierschaal stukken worden verspreid over de periferie van het embryo als een bron voor calcium bot-ontwikkeling en rijping. </li></ol> Bijkomende uitrusting voor buiten incubator beeldvorming / manipulatie: Een circulerend waterbad werd gebouwd in huis om incubatietemperaturen houden terwijl imaging of manipulatie (figuur 3). Een waterbad dat de beker past is aangesloten via juiste grootte slang aan op een water reservoir. Een weerstand verwarmt het water in het reservoir die handmatig wordt geregeld door het volgen van de watertemperatuur. Een waterpomp circuleert het water. Beknopte beschrijving geeft imaging gemak via ultrasongraphy / florescent microscopie (figuur 3). <img src="/files/ftp_upload/2154/2125fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Voorbereiding van de hangmat en de overdracht van kippen embryo's hangmatten. <img src="/files/ftp_upload/2154/2125fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Representatieve resultaten -. Andere fase kippenembryo's gegroeid via ex ovo cultuur techniek Embryo's van HH 17 vanaf kan worden geteeld via deze techniek. <img src="/files/ftp_upload/2154/2125fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Schematische en representatieve foto's van de water circulatie systeem dat wordt gebruikt in combinatie met de ex-ovo-cultuur systeem om embryo's te houden op de ontwikkeling ideale temperatuur. 2. Geselecteerde toepassingen: I. micro-injectie Deze embryo cultuur is geschikt voor micro-injectie toepassingen waar oplossingen moeten worden geïnjecteerd om vasculatuur voor contrast op basis van beeldvorming (dwz fluorescentie microscopie, micro-berekende topografie enz.) (figuur 4). Hieronder vindt u de micro-injectie protocol: <ol><li> Bereid de injectie apparaat komttus <ol class="lroman"><li> Fashion 0,75 ID glazen capillaire buisjes getrokken in afgeschuinde tip micronaaldjes met behulp van een microforge. Omvang van de benodigde tip hangt af van doel ader gewenste diameter / debiet. </li><li> Verbind de spuit met 0,03 inch ID silicone. </li><li> Laad de slang met de oplossing te injecteren en sluit de micronaaldjes op de buis. </li><li> Plaats de micronaaldjes op de micromanipulator en spuit spuit houder of injectiepomp. </li></ol></li><li> Voeg steriel water in de beker daarmee het embryo te verhogen. We hebben ervaren dat voor een goede penetratie van de naald in een bloedvat (dwz vitelline schip), horizontale penetratie nodig is. Dit vereist het embryo om op hetzelfde vlak als de randen van de beker. <ol class="lroman"><li> Haal de rubberen band die de plastic onder het embryo. </li><li> Til de ene kant van het plastic en voeg wat steriel water om de beker. </li><li> Bevestig de rubberen band op het plastic opnieuw. </li></ol></li><li> Injecteer de oplossing voor een embryonale vat. In onze ervaring, als oplossing wordt geïnjecteerd met een vitelline schip, micronaalden die nodig is om grote ongeveer 1 / 10 e van het schip diameter om een efficiënte perfusie te onderhouden zonder dat bloeden zijn. <ol class="lroman"><li> Pomp de oplossing voor de micronaaldjes zodat er geen vorming van luchtbellen. </li><li> Lijn het puntje van de microneedle op de geselecteerde schip. Voor vitelline schepen, zal het selecteren van een vork ruimte geven maximale ruimte om het schip binnen te dringen. </li><li> Duw de naald naar het schip. Het schip zal eerst intrekken. Zodra de naald doordringt, start perfusie. De kleur van het stromende bloed moet veranderen met de perfusie. Als kleurverandering is niet gezien, kan de naald zijn doorgedrongen uit van het schip. In dat geval langzaam intrekken van de microneedle tegelijkertijd pompoplossing tot kleurverandering in het vat wordt gezien. Zodra de perfusie is voltooid, trekken de microneedle uit van het schip. </li></ol></li></ol><img src="/files/ftp_upload/2154/2125fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4: micro-injectie van een fluorescerende kleurstof in het vaatstelsel van een ex-ovo gekweekt kippenembryo. II. Microchirurgische Procedure - linker atrium Ligatie Deze ex-ovo-cultuur setup is ideaal voor het uitvoeren van chirurgische toepassingen te kippenembryo's, omdat het voorziet in volledige toegankelijkheid van de embryo. Hieronder is het protocol voor een voorbeeld techniek, linker atrium ligatie (LAL) (figuur 5). De procedure wordt uitgevoerd ongeveer 24 uur in de cultuur periode (HH24): <ol><li> Bereid overhandse knopen ~ 0,5 mm diameter met 10-0 nylon chirurgisch hechtdraad. </li><li> Met fijne tang, lokaal verwijder de chorion en allantoïs membranen over het embryo en til het embryo van de rug te draaien deze verticaal zodanig dat de linker kant van het embryo zichtbaar is. </li><li> Met behulp van fijne tang, verwijdert u het hartzakje over het linker atrium. </li><li> Lijn de knoop over het linker atrium en vastschroeven. De knoop moet worden gebonden om ~ 75% van de oorspronkelijke bloedtoevoer naar de linkerkant te verbieden. Snijd de randen van de knoop met microscissors en verwijder voorzichtig en gooi overtollige hechtdraad. </li><li> Terug Draai het embryo in de oorspronkelijke stand (rechts boven). </li><li> Sham controles zullen betrekking hebben op de dezelfde procedure, maar de hechting zal gewoon worden doorgegeven en niet gebonden. Effectieve LAL behandeling (75% vernauwing) zal bevestigd worden 24 uur na de operatie, en gediskwalificeerd embryo's zullen worden uitgesloten. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2154/2154fig5.jpg" alt="Figuur 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5:. A-controle en een linker atrium geligateerd kippenembryo pijl geeft de linker atria, dat is ongeveer 75% kleiner in de geligeerde embryo.

<ol><li>Zamir, E. A., Czirok, A., Cui, C., Little, C. D., Rongish, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesodermal+cell+displacements+during+avian+gastrulation+are+due+to+both+individual+cell-autonomous+and+convective+tissue+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mesodermal cell displacements during avian gastrulation are due to both individual cell-autonomous and convective tissue movements.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19806-19811 (1980).</li>
<li>Ehrman, L. A., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+regulation+in+the+heart+forming+region+of+avian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Lack of regulation in the heart forming region of avian embryos.</a> Dev Biol. 207, 163-175 (1999).</li>
<li>Clark, E. B., Hu, N., Rosenquist, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+conotruncal+constriction+on+aortic-mitral+valve+continuity+in+the+stage+18%2C+21+and+24+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Effect of conotruncal constriction on aortic-mitral valve continuity in the stage 18, 21 and 24 chick embryo.</a> Am J Cardiol. 53, 324-327 (1984).</li>
<li>deAlmeida, A., McQuinn, T., Sedmera, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+ventricular+preload+is+compensated+by+myocyte+proliferation+in+normal+and+hypoplastic+fetal+chick+left+ventricle%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Increased ventricular preload is compensated by myocyte proliferation in normal and hypoplastic fetal chick left ventricle.</a> Circ Res. 100, 1363-1370 (2007).</li>
<li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+DNA+into+chick+embryos+by+in+ovo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation.</a> Methods. 24, 43-48 (2001).</li>
<li>Butcher, J. T., McQuinn, T. C., Sedmera, D., Turner, D., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitions+in+early+embryonic+atrioventricular+valvular+function+correspond+with+changes+in+cushion+biomechanics+that+are+predictable+by+tissue+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Transitions in early embryonic atrioventricular valvular function correspond with changes in cushion biomechanics that are predictable by tissue composition.</a> Circ Res. 100, 1503-1511 (2007).</li>
<li>McQuinn, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+ultrasonographic+imaging+of+avian+cardiovascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">High-frequency ultrasonographic imaging of avian cardiovascular development.</a> Dev. Dyn. 236, 3503-3513 (2007).</li>
<li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+procedure+for+the+long-term+cultivation+of+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos.</a> Dev Biol. 41, 391-394 (1974).</li>
</ol>

Optische toegang en experimenten in het aviaire embryo&#39;s is een uitdaging vanwege beperkingen van de eierschaal. Window beperkt aanzienlijk het aantal microvaten toegankelijk voor injectie en microchirurgische benadering 8. Als gevolg daarvan alleen maar vroege embryo&#39;s kunnen worden gemanipuleerd en continue observatie is niet mogelijk. Begin van de ex-ovo culturen met behulp van Petri schalen waren slechts beperkt bruikbaar vanwege de ontoereikende controle op de oppervlaktespanning op het ...

<table><tbody><tr><td>Vruchtbare eieren van witte Leghorn-kippen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Model GB1, Avery Incubators, Hugo CO</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saran Wrap</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elastieken</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Warm steriel water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastic beker van 9 oz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petrischaal van 100 mm diameter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1602N thermische lucht</td><td>GQF Manufacturing</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceïne-geconjugeerd dextran (2 MDa, 1% w/v in fosfaatgebufferde zoutoplossing)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Glassworx, Inc, St Louis MO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glazen capillaire buisjes (0,75 mm ID)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>Model M3301L</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentiemicroscopie</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Z20</td><td></td></tr><tr><td>Fijne 55-pincet</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10-0 nylon chirurgisch hechtmateriaal</td><td>Ethicon Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slangen</td><td>VWR international</td><td></td><td>1mm OD</td></tr><tr><td>3 mL spuit</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;L pipetteerder en pipetpunten</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

een ex-ovo chicken embryo cultuur systeem geschikt voor imaging en microchirurgie toepassingen

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Het begrijpen van de relatie tussen genetische en microenvironmental factoren die de normale en misvormde embryonale ontwikkeling te stimuleren van fundamenteel belang is voor het ontdekken van nieuwe therapeutische strategieën. De vooruitgang in imaging technologie in staat hebben gesteld kwantitatief onderzoek van de organisatie en de rijping van het lichaam plan, maar later stadium embryonale morfogenese is minder duidelijk. Kippenembryo&#39;s zijn een aantrekkelijk gewervelde dier modelsysteem voor deze toepassing vanwege het gemak van cultuur en chirurgische manipulatie. Vroege embryo&#39;s kunnen worden gekweekt voor een korte tijd op filtreerpapier ringen, die volledig optische toegang voor mobiele patronen en het lot studies 1,2 mogelijk maakt. Het bestuderen van geavanceerde ontwikkelingsprocessen zoals hart-morfogenese zijn traditioneel uitgevoerd door een raam van de eischaal 3-5, maar deze techniek beperkt optische toegang vanwege venster grootte. We hebben eerder ontwikkelde een eenvoudige methode om de cultuur gehele embryo&#39;s ex-ovo op zeshoekige wegen boten voor maximaal 10 dagen, die een hoge resolutie imaging ingeschakeld via echografie 6,7. Deze culturen waren moeilijk te vervoeren, het beperken van de aard van de imaging tools beschikbaar zijn voor live-experimenten. We hebben hier aanwezig zijn een verbeterde shell-minder cultuur-systeem met een kosten-effectieve, draagbare klimaatkamer. Eieren waren gebarsten op een hangmat gemaakt door een polyurethaan membraan (klampen wrap) langs de omtrek aangebracht op een plastic bekertje gedeeltelijk gevuld met steriel water. De afmetingen van de omtrek en de diepte van de hangmat waren zowel kritisch naar de oppervlakte spanning te behouden, terwijl de mechanica van de hangmat en water onder hielp dempen trillingen veroorzaakt door het transport. Een kleine footprint circulerend waterbad werd ook ontwikkeld om constante temperatuurbeheersing tijdens experimenten mogelijk te maken. Tonen we de mogelijkheid om embryo&#39;s in de cultuur op deze wijze gedurende ten minste 14 dagen zonder morfogenisch defect of vertraging en dit systeem gebruiken in verschillende microchirurgische en imaging toepassingen.

In dit artikel presenteren we een eenvoudige methode om op lange termijn in staat stellen<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Aviaire embryo cultuur. Deze techniek is ideaal voor longitudinale experimenten die volledig optische toegankelijkheid en / of steriel vervoer in aviaire embryo&#39;s.

Een Ex-ovo Chicken Embryo Cultuur systeem geschikt voor Imaging en microchirurgie toepassingen

Het begrijpen van de relaties tussen genetische en micro-omgevingsfactoren die zowel de normale als de misvormde embryonale ontwikkeling aansturen, is fundamenteel voor ...

In het X ovo kweeksystem voor kiजenembryo's maakt het voorbereiden van shell-less ki’enembryoculturen het onderzoek naar embryogenese mogelijk. De procedure begint met het verkrijgen en incuberen van bevruchte kippeneieren bij 37,5 °C gedurende 72 uur. Er worden hangmatjes voorbereid om de eidooiers met de groeiende embryo's in vast te houden.Vervolgens kunnen de eidooiers naar hangmatjes worden overgebracht, waarna de embryogenese buiten de schaal wordt voortgezet. Deze techniek kan worden toegepast voor micro-injecties in de vasculatuur, ultrasonografie en microchirurgie, en de resultaten kunnen laten zien hoe embryo's zich ontwikkelen onder normale en verstoorde omstandigheden. Hallo, mijn naam is Akshay Shaker en ik ben een masterstudent in het laboratorium voor cardiovasculaire ontwikkelings-bioengineering onder leiding van Jonathan Butcher in de afdeling Biomedical Engineering aan Cornell University.Het belangrijkste voordeel van onze techniek ten opzichte van eerdere methoden, zoals in ovo eikweek, is dat deze volledige optische toegang tot het embryo biedt en eenvoudig te transporteren is zonder schade aan te richten. Hallo, mijn naam is Char Hin. Ik ben postdoctoral onderzoeker bij het Cardiovascular Developmental Bioengineering Laboratory, het Jonathan Chu Lab van de afdeling Biomedical Engineering van Cornell University.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen binnen het vakgebied van de ontwikkelingsbiologie, zoals de wijze waarop hartdefecten ontstaan tijdens de embryogenese. Steriliseer alle materialen door ze af te nemen met 70% ethanol voordat u met deze procedure begint. Vul ter start van de procedure een plastic beker van negen ounce voor drie kwart met warm steriel water.Herhaal dit voor zoveel bekers als nodig is. Een standaard beker van 250 ml heeft een bovenranddiameter van acht centimeter, wat de meest geschikte maat is voor de hier gepresenteerde toepassing van verlengde kweek. Snijd vervolgens een stuk vershoudfolie van 20 centimeter lang af.Dek de bovenkant van de plastic beker van negen ounce, gevuld met warm steriel water, af met een stuk vershoudfolie en gebruik een elastiekje om de folie op zijn plaats te houden. Vershoudfolie is het meest geschikt voor deze toepassing, omdat het voorkomt dat de dooier blijft plakken, wat zou kunnen leiden tot het scheuren van de dooier. Tijdens het transport moet de folie zodanig worden uitgespreid dat deze het wateroppervlak raakt.Snijd het overtollige plastic rond de band af en veeg het plastic schoon. Met Kim-wipes bevochtigd met 70% ethanol zijn de hangmatten nu klaar om de embryo's te ondersteunen. Bevruchte kippeneieren kunnen tot vijf dagen voor de incubatie worden bewaard bij 13 °C.Zonder de ontwikkeling te activeren, kan een koeler voor rode wijn deze temperatuur handhaven zodat de eieren klaar zijn voor kweek. Activeer de ontwikkeling van het embryo door de eieren met één zijde naar boven 72 uur lang te incuberen in een incubator met een constante luchtvochtigheid van 60% en continu schudden bij 37,5 °C. Wanneer de eieren klaar zijn, worden ze uit de incubator gehaald.Steriliseer de eieren door ze af te vegen met Kim wipes gedrenkt in 70% ethanol. Leg de eieren één tot twee minuten horizontaal op hun zij in een eierdoos voor een juiste positionering van het embryo. Werk met maximaal zes eieren tegelijk, aangezien het proberen te kraken van meer dan zes eieren tegelijkertijd problematisch kan zijn.Dit kan ertoe leiden dat de kamer-temperatuur te lang wordt aangehouden, wat de levensvatbaarheid kan beïnvloeden. Na één tot twee minuten is het embryo naar de bovenkant van het ei gegleden. Om elk embryo naar een hangmat over te brengen, dient er aseptisch gewerkt te worden in een laminaire flowkast.Kraak eerst voorzichtig de onderzijde van het ei met een scherpe rand, zoals de rand van een metalen emmer of een glazen bekerglas. Houd er rekening mee dat het embryo zich aan de bovenzijde bevindt. Scheid de twee helften van de eierschaal voorzichtig door ze met twee duimen naar de zijkanten te trekken.Plaats vervolgens het embryo, de dooier en het albumen op de hangmat. Het albumen zorgt voor een dempende omgeving rond de dooier die schokken door bewegingen van het systeem absorbeert. Daarnaast biedt het albumen voeding aan het embryo tijdens de lange kweekperiode.Als de overdracht van het embryo correct is uitgevoerd, moet het embryo zich al aan de bovenzijde bevinden. Als het embryo zich aan de onderzijde bevindt, gebruik dan een gesloten gebogen naald, een klein schaartje of een ander soortgelijk stomp instrument om de dooier voorzichtig te verschuiven, zodat deze om zijn as draait en het embryo naar boven beweegt. Indien embryo's langer worden gekweekt dan tot embryonale dag zeven, strooi dan fijngemalen stukjes eierschaal rond de periferie van het embryo als calciumbron voor de botontwikkeling en rijping.Nadat de overdracht van het embryo is voltooid, plaatst u een Petrischaal met een diameter van 10 centimeter bovenop het bekertje om het embryo af te sluiten. Plaats de hangmat in de incubator die is ingesteld op 37,5 °C. Indien een draagbare incubator wordt gebruikt, plaatst u daarnaast één tot twee bekertjes van negen ounce gevuld met water in de incubator.Om de luchtvochtigheid op ongeveer 60% te houden, ontwikkelen de embryo's zich verder en kunnen ze worden gebruikt voor micro-injectie in microsurgische toepassingen. Deze embryocultuur is geschikt voor micro-injectietoepassingen waarbij oplossingen in het vaatstelsel moeten worden geïnjecteerd. Bereid eerst de injectieapparatuur voor, beginnend met de naalden, waarbij glazen capillaire buisjes met behulp van een micro-forge worden uitgetrokken tot micronaalden met een schuine punt.De grootte van de tip is afhankelijk van de gewenste stroomsnelheid. Sluit de micronaaldspuit aan op siliconen slang met een binnendiameter van 0,03 inch. Vul de spuitslang met de te injecteren oplossing en verbind de micronaald van de spuit met de slang.Plaats de micronaald op de micromanipulator en de spuit in de spuithouder of spuitpomp. Zodra de injectie-opstelling gereed is, worden de embryo's opgehaald. Horizontale penetratie van de naald is vereist voor een correcte insteek van de naald in een bloedvat, zoals een vitaal vat.Het embryo moet daarom op hetzelfde niveau liggen als de randen van het bekertje waarin het zich bevindt. Om het embryo te verhogen, verwijdert u het elastiekje dat de vershoudfolie ter ondersteuning van het embryo vasthoudt. Til voorzichtig één zijde van de folie op en voeg wat water toe aan het bekertje zonder het embryo te veel te bewegen.Plaats vervolgens het elastiekje opnieuw op het plastic. Nu het embryo is opgetild, kan de oplossing in een embryonaal bloedvat worden geïnjecteerd. Let op dat bij het injecteren in een vitaal bloedvat de grootte van de micronaald ongeveer 1/10 van de diameter van het bloedvat moet zijn.Om een efficiënte perfusie te behouden zonder bloedingen te veroorzaken, pompt u eerst de oplossing in de micronaald zodat er geen lucht binnenin gevangen blijft. Richt vervolgens de punt van de micronaald op een geselecteerd vat voor vitale vaten. Het selecteren van een gebied geeft een maximaal oppervlak voor het targeten van het vat.Zodra het injectiegebied is bepaald, wordt de naald in het vat geduwd. Het vat trekt eerst terug. Zodra de naald penetreert, wordt de perfusie gestart; de kleur van het stromende bloed verandert tijdens de perfusie.Als de kleurverandering niet zichtbaar is, kan de naald door het vat zijn geduwd. Trek in dat geval de micronaald langzaam terug terwijl u gelijktijdig oplossing pompt, totdat er een kleurverandering in het vat zichtbaar is. Wanneer de perfusie voltooid is, trekt u de micronaald voorzichtig uit het vat. Deze embryocultuur is ook geschikt voor microsurgische toepassingen zoals ligatie van het linker atrium, wat op de vierde dag van incubatie wordt uitgevoerd.Bereid eerst de knopen voor met een diameter van 0,5 millimeter van 10 nul nylon chirurgisch hechtmateriaal. Verwijder met een fijne pincet de chionische en LAN-toïsche membranen van het embryo. Til het embryo aan de achterzijde op en roteer het verticaal, zodat de linkerzijde van het embryo nu bovenop ligt en toegankelijk is.Verwijder daarna het pericardium boven het linker atrium. Plaats de knoop over het linker atrium en trek deze strak door hem aan de zijkanten vast te houden en te trekken. Met een pincet moet de knoop zo worden aangetrokken dat ongeveer 75% van de oorspronkelijke bloedstroom naar de linkerkant wordt geblokkeerd. Knip de uiteinden van de knoop af met microscharen en verwijder vervolgens voorzichtig de overtollige hechtdraad.Draai tot slot het embryo terug naar de oorspronkelijke oriëntatie met de rechterkant bovenop. Hier worden embryo's in verschillende stadia getoond die ex ovo zijn gekweekt zoals zojuist gedemonstreerd; een watercirculatieverwarmer kan de omgevingscondities gedurende langere tijd in stand houden, wat mogelijk vereist is tijdens beeldvorming en microchirurgische toepassingen.Kuikenembryo's die ex ovo zijn gekweekt, zijn geschikt voor micro-injectie. In dit experiment werd een fluorescerende kleurstof geïnjecteerd in de vasculatuur van een ex ovo gekweekt kuikenembryo. De ex ovo gekweekte kuikenembryo's zijn geschikt voor microchirurgie.In dit experiment werd een procedure voor ligatie van het linker atrium uitgevoerd op een ex ovo gekweekte kiजembryo. Zodra men de techniek beheerst, kan het kweken van ex ovo kousemembryo's in ongeveer vijf minuten per embryo worden voltooid. Na het bekijken van deze video zou men een goed begrip moeten hebben van hoe ex ovo kiजemembryocultures kunnen worden aangemaakt die geschikt zijn voor beeldvormings- en microchirurgische toepassingen, en voor situaties waarin het transport van culturen noodzakelijk is.

an-ex-ovo-chicken-embryo-culture-system-suitable-for-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video toont nieuwe cultuur, een methode waarbij kippenembryo's zich buiten het ei gekweekt tot 24 uur. Deze methode stelt je in staat om te studeren vroege ontwikkeling (primitieve streep tot 14 som.), Een periode die overeenkomt met E7-9 in de muis. Toepassingen van deze techniek zijn onder elektroporatie, in situ hybridisatie en immunohistochemie.

Methode voor Cultuur van Early kippenembryo&#39;s ex vivo (Nieuwe Cultuur)

Het kuiken chorion-membraan (CAM) is een uniek, natuurlijk immunodeficiënte ondersteunende cultuur omgeving om angiogenese en tumorigenese studie. Deze video artikel demonstreert de verschillende stappen in het...

Kuiken Ex ovo Cultuur en Ex ovo CAM test: Hoe het echt werkt

This video demonstrates the ex vivo culture and imaging of oculomotor slices from transgenic mouse embryos. The embryos are isolated and embedded in agarose. Using a vibratome, slices containing the oculomotor nuclei and eyes are obtained. The slices are maintained in culture and imaged using a fluorescence microscope.

Ex Vivo Culture and Imaging of Oculomotor Slices from Transgenic Mouse Embryos

Slice culturen vergemakkelijken de manipulatie van embryo-ontwikkeling van gen-en farmacologische verstoringen. Wel moet kweekomstandigheden ervoor te zorgen dat de normale ontwikkeling kan gaan binnen de verminderde omgeving van de plak. We tonen een protocol dat normale ontwikkeling ruggenmerg vergemakkelijkt men gedurende ten minste 24 uur.

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Cultuur Protocol

Progenitorceltransplanten mitose is een kritische parameter van neurogenese. Veel van onze kennis van neurale voorlopercellen mitose is gebaseerd op de analyse van vaste weefsel. Live-beeldvorming in de embryonale hersenen plakjes is een veelzijdige techniek om mitose te beoordelen met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie in een gecontroleerde omgeving.

Live-Imaging van mitose in het ontwikkelen van muis embryonale Cortex

Het bekijken en toegang krijgen tot het kippenembryo tijdens de ontwikkeling kan een uitdaging zijn. We hebben een ex ovo methode ontwikkeld die eenvoudig, kosteneffectief is en gemakkelijk kan worden gebruikt in een klaslokaal of onderzoeksomgeving. Deze methode biedt toegang tot het embryo tot in de late stadia van de embryonale ontwikkeling (HH 40).

Geoptimaliseerd Ex-ovo Het kweken van kippenembryo's tot geavanceerde stadia van ontwikkeling

Hier presenteren we een nieuwe techniek om kuikenembryo's ex ovo te kweken voor time-lapse beeldvorming met behulp van doorgelaten licht en fluorescentiemicroscopie. De ondergedompelde filterpapiersandwich is een variant van de bekende filterpapierdragertechniek1 die het mogelijk maakt om kuikenembryo's volledig ondergedompeld in een vloeibaar kweekmedium te kweken.

Een Ondergedompeld Filter Paper Sandwich voor de lange termijn Ex Ovo Time-lapse beeldvorming van Early kippenembryo's

Dit protocol beschrijft drie methoden voor het verkrijgen en gebruiken van 5 tot 8 dagen oude kippenembryo's en hun chorioallantoic membrane (CAM) als een in vivo model om contrastverbeterde ultrasone beeldvorming en microbubbel-gemedieerde medicijnafgifte te bestuderen.

De voorbereiding van Chicken Ex Ovo Embryo's en Chorioallantoic Membrane Vessels als In Vivo Model voor Contrast-Enhanced Ultrasound Imaging en Microbubble-Gemedieerde Drug Delivery Studies

Het algemene doel van dit artikel is om te beschrijven hoe te presteren in ovo intracellulaire injectie van exogene materialen in kippenembryo's. Deze aanpak is zeer nuttig om de ontwikkelingsbiologie van kippenembryo's te bestuderen.

In Ovo Intravasculaire injectie in kippenembryo's

Dit protocol is ontwikkeld om de mechanische eigenschappen van neuraal plaatweefsel tijdens de neurulatie van kuikenembryo's longitudinaal te monitoren. Het is gebaseerd op de integratie van een Brillouin-microscoop en een incubatiesysteem op het podium, waardoor live mechanische beeldvorming van neuraal plaatweefsel in ex ovo gekweekte kuikenembryo's mogelijk wordt.

Monitoring van de mechanische evolutie van weefsel tijdens het sluiten van de neurale buis van kuikenembryo's

Leer een ex-ovo kippenembryocultuurmethode voor embryogenesestudies met volledige optische toegankelijkheid. Dit systeem maakt micro-injectie, echografie en microchirurgie mogelijk voor ontwikkelingsbiologisch onderzoek.

Een Ex-ovo Chicken Embryo Cultuur systeem geschikt voor Imaging en microchirurgie toepassingen

Meer video's verkennen