Name: Het testen van de locomotorische activiteit te circadiaanse ritmes Studie en parameters Sleep in Drosophila /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-28T17:30:00.000+00:00
Duration: 18 min 8 s
Description: Leer hoe je circadiane en slaapfenotypen in Drosophila karakteriseert door dagelijkse locomotorische activiteitsritmes te meten met DAM-monitoren. Deze methode onthult genetische en milieu-invloeden op het circadiane systeem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie ​​NIH34958 naar I. E en NS061952 naar JC

<ol><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Chen, W. F., Low, K. H., Lim, C., Edery, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermosensitive+splicing+of+a+clock+gene+and+seasonal+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Thermosensitive splicing of a clock gene and seasonal adaptation.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 72, 599-606 (2007).</li>
<li>Chiu, J. C., Vanselow, J. T., Kramer, A., Edery, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phospho-occupancy+of+an+atypical+SLIMB-binding+site+on+PERIOD+that+is+phosphorylated+by+DOUBLETIME+controls+the+pace+of+the+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The phospho-occupancy of an atypical SLIMB-binding site on PERIOD that is phosphorylated by DOUBLETIME controls the pace of the clock.</a> Genes Dev. 22, 1758-1772 (2008).</li>
<li>Dubruille, R., Murad, A., Rosbash, M., Emery, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+constant+light-genetic+screen+identifies+KISMET+as+a+regulator+of+circadian+photoresponses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">A constant light-genetic screen identifies KISMET as a regulator of circadian photoresponses.</a> PLoS Genet. 12, e1000787-e1000787 (2009).</li>
<li>Glaser, F. T., Stanewsky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+synchronization+of+the+Drosophila+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Temperature synchronization of the Drosophila circadian clock.</a> Curr Biol. 15, 1352-1363 (2005).</li>
<li>Helfrich-Förster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+control+of+morning+and+evening+components+in+the+activity+rhythm+of+Drosophila+melanogaster-+sex-specific+differences+suggest+a+different+quality+of+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Rhythms%22%5BJournal%5D)">Differential control of morning and evening components in the activity rhythm of Drosophila melanogaster- sex-specific differences suggest a different quality of activity.</a> J Biol Rhythms. 15, 135-154 (2000).</li>
<li>Hendricks, J. C., Finn, S. M., Pancleri, K. A., Chavkin, J., Williams, J., Sehgal, A., Pack, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rest+in+Drosophila+is+a+sleep-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rest in Drosophila is a sleep-like state.</a> Neuron. 25, 129-138 (2000).</li>
<li>Ho, K. S., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster%3A+an+insect+model+for+fundamental+studies+of+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster: an insect model for fundamental studies of sleep.</a> Methods Enzymol. 393, 772-793 (2005).</li>
<li>Koh, K., Evans, J. M., Hendricks, J. C., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+model+for+age-associated+changes+in+sleep%3A+wake+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A Drosophila model for age-associated changes in sleep: wake cycles.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103, 13843-13847 (2006).</li>
<li>Konopka, R. J., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clock+mutants+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Clock mutants of Drosophila melanogaster.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 68, 2112-2116 (1971).</li>
<li>McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+systems+in+Drosophila%3A+a+synthesis+of+time+and+space%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene expression systems in Drosophila: a synthesis of time and space.</a> Trends Genet. 20, 384-391 (2004).</li>
<li>Osterwalder, T., Yoon, K. S., White, B. H., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditional+tissue-specific+transgene+expression+system+using+inducible+GAL4%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A conditional tissue-specific transgene expression system using inducible GAL4.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98, 12596-12601 (2001).</li>
<li>Rosato, E., Kyriacou, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+locomotor+activity+rhythms+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analysis of locomotor activity rhythms in Drosophila.</a> Nature Protocols. 1, 559-568 (2006).</li>
<li>Sehadova, H., Glaser, F. T., Gentile, C., Simoni, A., Giesecke, A., Albert, J. T., Stanewsky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+entrainment+of+Drosophila%27s+circadian+clock+involves+the+gene+nocte+and+signaling+from+peripheral+sensory+tissues+to+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Temperature entrainment of Drosophila's circadian clock involves the gene nocte and signaling from peripheral sensory tissues to the brain.</a> Neuron. 64, 251-266 (2009).</li>
<li>Zimmerman, J. E., Raizen, D. M., Maycock, M. H., Maislin, G., Pack, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+video+method+to+study+Drosophila+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep%22%5BJournal%5D)">A video method to study Drosophila sleep.</a> Sleep. 31, 1587-1598 (2008).</li>
<li>Zordan, M. A., Benna, C., Mazzotta, G. Monitoring and analyzing Drosophila circadian locomotor activity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZordan%2C+MA+%22In+Circadian+Rhythms+Methods+and+Protocols%22">In Circadian Rhythms Methods and Protocols</a>. Rosato, E. , Methods in Molecular Biology series. Humana. Totowa, New Jersey. (2007).</li>
</ol>

In dit protocol beschrijven we de procedures voor het meten van Drosophila locomotorische activiteit ritmes, een betrouwbare gedrags-output van vliegen circadiane klokken die wordt gebruikt als standaard uitlezen van de klok functie. Deze test is gebruikt in grootschalige schermen voor de nieuwe klok mutanten (bijv. Konopka en Benzer 1971;. Dubruille et al. 2009) en wordt voortdurend gebruikt voor het ontleden en klokfunctie te begrijpen in vivo. Het is ook gebruikt om te slapen waak cyclus studie in vliegt, hoewel recente rapporten suggereren dat de digitale video-analyse is veel betrouwbaarder bij het ​​kwantificeren van de slaap dan met behulp van de locomotorische activiteit ritmes (Zimmerman et al.. 2008). Bij het gebruik van de locomotorische activiteit ritmes in slaap te analyseren, het percentage van de slaap in de dag hebben de neiging om te overschatten. Om ervoor te zorgen het succes en de reproduceerbaarheid van dit protocol, is het essentieel om te vliegen test die vergelijkbaar zijn in leeftijd, genetische achtergrond, en gefokt onder dezelfde voorwaarden, zoals gedrags-fenotypen in fruitvliegen, zoals circadiane ritmiek en slaap / rust-activiteit zijn erg gevoelig al deze factoren. Bij gebruik van meerdere incubators voor een experiment, is het belangrijk om ervoor te zorgen dat alle couveuses zijn op de verwachte temperatuur, omdat sommige circadiane parameters kunnen veranderen als functie van de temperatuur. Een woord van voorzichtigheid bij het overwegen van de aankoop van incubators voor het werken met vliegen, ze zijn niet allemaal gelijk geschapen. Terwijl we aarzelen om een ​​bepaalde eenheid zijn er vele opties aan te bevelen. Een goede bron voor het vinden van bedrijven die incubators verkopen voor Drosophila het werk wordt gegeven aan &lt;www.flybase.org&gt;. Sommige bedrijven verkopen zelfs &quot;Drosophila circadiane &#39;incubators, waarin extra functies beschikbaar zijn, zoals nu al de bedrading voor de Trikinetics systeem en temperatuur aanloop (bijv. TriTech). Belangrijke functies omvatten de mogelijkheid om overdag licht-controle en een goede temperatuur in de fysiologische bereik van Drosophila (~ 15-30 ° C). Prijzen en maten van incubators variëren veel, maar met de nieuwere activiteit monitoren van Trikinetics, zelfs kleine incubators kan een groot aantal van deze apparaten tegemoet te komen. Ook, hoewel incubators met vocht controle kan worden gebruikt, toegevoegd element is niet nodig zolang je een kleine pan plaats met water om de luchtvochtigheid (50-70% is prima) te geven. Tot slot, hoewel we regelmatig FaasX en Insomniac te gebruiken voor data-analyse in dit protocol, zijn er alternatieve programma&#39;s en software beschikbaar (Rosato en Kyriacou 2006), bijvoorbeeld ClockLab (ActiMetrics), Brandeis Rhythm Package (D. Wheeler, Baylor College of Medicine, Houston ), en MAZ (Zordan et al. 2007)..

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; activiteitsmonitor (DAM)</td><td>Trikinetics Inc.; Waltham, MA</td><td>DAM2 of DAM5</td><td>DAM2-monitoren zijn compacter, waardoor er meer in één incubator passen</td></tr><tr><td>Interface-unit voor de stroomvoorziening (voor DAM-systeem)</td><td>Trikinetics Inc.; Waltham, MA</td><td>PSIU9</td><td>Inclusief PS9-1 AC-stroomvoorziening</td></tr><tr><td>Lichtcontroller</td><td>Trikinetics Inc.; Waltham, MA</td><td>LC6</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex glazen buizen</td><td>Trikinetics Inc.; Waltham, MA</td><td>PGT5, PGT7 en PGT10</td><td></td></tr><tr><td>Plastic dopjes voor activiteitsbuizen</td><td>Trikinetics Inc.; Waltham, MA</td><td>CAP5</td><td>Garen kan worden gebruikt in plaats van plastic dopjes.</td></tr><tr><td>Software voor gegevensverzameling van het DAM-systeem</td><td>Trikinetics Inc.; Waltham, MA</td><td></td><td>Versies beschikbaar voor zowel Mac als PC</td></tr><tr><td>FaasX-software</td><td>Centre National de la Recherche Scientifique</td><td></td><td>Alleen voor Mac</td></tr><tr><td>Insomniac 2.0-software</td><td>University of Pittsburgh School of Medicine</td><td></td><td>Draait op Matlab. Kan worden gebruikt op zowel PC als Macintosh.</td></tr><tr><td>Omgevingsincubator met temperatuur- en dag-nachtregeling, bijv. Percival incubator</td><td>Percival Scientific, Inc.</td><td>I-30BLL</td><td>Afmetingen binnenruimte: Breedte: 65cm; Hoogte: 86cm; Diepte: 55cm</td></tr><tr><td>Omgevingsincubator met temperatuur- en dag-nachtregeling, bijv. DigiTherm verwarmings-/koelincubator met circadiane tijdgestuurde verlichting en tijdgestuurde temperatuur</td><td>Tritech Research, Inc.</td><td>05DT2CIRC001</td><td>Afmetingen binnenruimte: Breedte: 36m; Hoogte: 56m; Diepte: 28cm</td></tr><tr><td>APC Smart-UPS 2200VA 120V (Noodstroomvoorziening)</td><td>APC</td><td>SU2200NET</td><td>Uitgangsvermogen van 1600 Watts</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>TissuePrep paraffinepellets</td><td>Fisher Scientific</td><td>T565</td><td>Smeltpunt 56&amp;#x00B0;C-57&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Blokverwarmer</td><td>VWR international</td><td>12621-014</td><td></td></tr></tbody></table>

het testen van de locomotorische activiteit te circadiaanse ritmes studie en parameters sleep in drosophila</em

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

De meeste vormen van leven vertonen de dagelijkse ritmes in cellulaire, fysiologische en gedragsmatige verschijnselen die worden aangedreven door endogene circadiane (≡ 24 uur), een pacemaker of klokken. Storingen in het menselijke circadiane systeem worden geassocieerd met tal van ziektes of aandoeningen. Veel vooruitgang in de richting ons begrip van de mechanismen die ten grondslag liggen aan circadiaanse ritmes is ontstaan ​​uit genetische screens waarbij een gemakkelijk te meten gedrag ritme wordt gebruikt als een read-out van klokfunctie. Studies met behulp van Drosophila hebben baanbrekende bijdragen aan ons begrip van de cellulaire en biochemische grondslagen van circadiane ritmes. De standaard circadiane gedrag uitlezing gemeten in Drosophila is locomotorische activiteit. In het algemeen, de monitoring systeem omvat speciaal ontworpen apparaten die het bewegingsapparaat beweging van Drosophila kunnen meten. Deze apparaten zijn ondergebracht in ecologisch gecontroleerde incubators gevestigd in een donkere kamer en zijn gebaseerd op het gebruik van de onderbreking van een bundel van infrarood licht om de locomotorische activiteit van individuele vliegen die in kleine buisjes vast te leggen. Gemeten gedurende vele dagen, Drosophila vertonen dagelijkse cycli van activiteit en inactiviteit, een gedrags-ritme dat wordt beheerst door endogene van het dier circadiane systeem. De algemene procedure is vereenvoudigd met de komst van commercieel verkrijgbare bewegingsactiviteit controle-apparaten en de ontwikkeling van software programma&#39;s voor data-analyse. We maken gebruik van het systeem van Trikinetics Inc, dat is de procedure hier beschreven en is momenteel de meest populaire systeem wereldwijd gebruikt. Meer recent hebben dezelfde controle-apparaten gebruikt om te slapen gedrag in Drosophila bestuderen. Omdat de dagelijkse wake-slaap cycli van veel vliegen kunnen gelijktijdig worden gemeten en slechts 1 tot 2 weken ter waarde van continue bewegingsactiviteit data is meestal voldoende, dit systeem is ideaal voor grootschalige schermen te identificeren Drosophila manifesteren veranderd circadiane of slapen eigenschappen.

We beschrijven de procedures voor de registratie van de dagelijkse bewegingsactiviteit ritmes van<em&gt; Drosophila</em&gt; En de daaropvolgende data-analyse. Locomotorische activiteit ritmes zijn een betrouwbare gedrag output van dierlijke circadiane klokken en worden gebruikt als de standaard uitlezen van de klok functie bij het bestuderen van circadiane mutanten of te onderzoeken hoe de omgeving het circadiane systeem regelt.

Het testen van de locomotorische activiteit te circadiaanse ritmes Studie en parameters Sleep in Drosophila</em

De meeste levensvormen vertonen dagelijkse ritmes in cellulaire, fysiologische en gedragsmatige fenomenen die worden aangestuurd door endogene circadiane (&equiv;24 u) ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om circadiane en slaapfenotypes bij drosophila te karakteriseren door de dagelijkse ritmes van de locomotorische activiteit te analyseren. Dit wordt bereikt door trenchgene vliegen te genereren, specifieke mutanten te verkrijgen of de nodige kruisingen op te zetten om de experimentele dieren voor te bereiden. Als tweede stap moeten glazen activiteitsbuisjes met een voedingsbron worden klaargemaakt, die tijdens het experiment als habitat voor de vliegen zullen dienen.Vervolgens worden vliegen van één tot vijf dagen oud in activiteitsbuisjes geplaatst, die in DAM-activiteitsmonitoren worden geladen om de ritmes van de locomotorische activiteit te monitoren. Met het DAM-systeem worden resultaten verkregen die defecten en variaties in circadiane en slaapparameters aantonen, gebaseerd op de analyse van dagelijkse locomotorische activiteitsritmes met software zoals far sex en insomniac. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de circadiane biologie, zoals welke eiwitten en regulatiemechanismen betrokken zijn bij het genereren van correcte ritmes, en bijvoorbeeld hoe omgevingsfactoren zoals licht en temperatuur gedragsritmes moduleren via specifieke moleculaire paden.Het systeem voor het monitoren van locomotorische activiteit omvat talrijke apparaten, zoals gespecialiseerde monitoringsystemen, omgevingsincubators met de mogelijkheid tot dagelijkse lichtregeling, gegevensverzamelapparatuur, computers en randapparatuur zoals bekabeling. Kies een goed geventileerde ruimte met temperatuurregeling en een donkere kamer om het systeem voor het monitoren van locomotorische activiteit te huisvesten, om overmatige belasting van de incubators en een eventueel falen in het handhaven van de temperatuur te voorkomen. Sluit de kamer af van externe lichtbronnen. Het is niet nodig om volledig in het donker te werken, aangezien het circadiane systeem van de fruitvliegen niet gevoelig is voor infraroodlicht.Daarom gebruiken we in gevallen waarin we in de donkere kamer moeten zien, simpelweg een standaard zaklamp die is voorzien van een gekocht rood filter, en een uninterruptible power supply (UPS) noodstroomvoorziening die voldoende wattagecapaciteit heeft om de componenten van het activiteitsmonitoringsysteem van stroom te voorzien. Sluit de UPS-noodstroomvoorziening bij een spanningspiek of stroomuitval in het gebouw aan op het noodstroomcircuit van het gebouw, indien beschikbaar. Als het systeem dat de verlichting in de incubator regelt niet direct door de incubator wordt aangestuurd, is het voldoende om de incubator zonder UPS op de noodstroom aan te sluiten, aangezien een stroomonderbreking van enkele seconden geen invloed heeft op de temperatuur in de kamer.Stel vervolgens een computer in, een pc of Macintosh, die volledig is gewijd aan gegevensverzameling en/of aan de besturing van de incubatoren. Rangschik het telefoonlijnnetwerk handmatig en netjes rond de planken van de geconditioneerde incubatoren om het aansluiten en loskoppelen van de activiteit te vergemakkelijken. Stel de monitors zo in dat meerdere telefoonlijnen samenkomen in één hoofdlijn die uit de incubator loopt om verbinding te maken met de computer; verbind de bewakingsapparatuur in de incubatoren met de computer via een stroomvoorzieningsinterface-unit, die dient om de activiteitsmonitor via de telefoonlijn van stroom te voorzien.Maskeer ten slotte mogelijke lichtbronnen van LED's van elektronische apparatuur of een onvolledig afgesloten incubatordeur met ducttape of een zwarte doek, om te garanderen dat vrijlopende ritmes worden gemeten in de afwezigheid van ongewenst licht. Het is cruciaal om deze fenotypes te beoordelen met behulp van geschikte controledieren die onder dezelfde omgevingsomstandigheden en op dezelfde leeftijd zijn opgegroeid.Daarnaast is er sprake van seksueel dimorfisme in de circadiane ritmiek. De algemene praktijk is om voor deze assays volwassen mannelijke vliegen te gebruiken die zijn opgekweekt bij 25 °C en tussen de één en vijf dagen oud zijn, omdat de eiafzetting bij vrouwelijke vliegen de werkelijke meting van de locomotorische activiteit beïnvloedt. Bij het onderzoeken van circadiane parameters en slaap-rustparameters van specifieke mutante vliegen van belang, is het raadzaam om de mutante stam te kruisen met de wildtype-stam met dezelfde genetische achtergrond.Bijvoorbeeld W 1118 of yw. Aangezien er bij drosophila-mannetjes geen overkruising plaatsvindt, is het raadzaam om de uitkruising uit te voeren door mutante vrouwtjes te kruisen met wildtype mannetjes; zet zowel de wildtype controle- als de mutante vliegen tegelijkertijd uit. In standaard drosophila-voedsel gedurende ongeveer 10 tot 14 dagen vóór het experiment naar het ritme van de locomotorische activiteit. Verzamel na de uitkomst van het nageslacht mannetjesvliegen van één tot vijf dagen oud en zet deze apart voor gebruik in de experimenten.Activiteitbuisjes representeren het habitat van de vlieg. Tijdens het experiment zijn dit dunne glazen buisjes van vijf millimeter die aan het ene uiteinde voedingsstof bevatten en aan het andere uiteinde zijn afgesloten met garen of een plastic stop. Het is bij voorkeur aanbevolen om vers gemaakte activiteitbuisjes te gebruiken.Deze worden doorgaans enkele dagen tot een week voor de start van het experiment voorbereid. Aangezien glazen activiteitsbuisjes meerdere keren hergebruikt kunnen worden, beschrijven de volgende voorbereidingsprocedures het gebruik van eerder gebruikte en onreine activiteitsbuisjes als uitgangspunt. Indien u nieuwe activiteitsbuisjes gebruikt, kunt u direct overgaan naar het autoclaven van de buisjes, zoals later beschreven.Verwijder de doppen uit de gebruikte activiteitsbuisjes en plaats deze in een groot glazen bekerglas. De buisjes mogen het bekerglas slechts tot de helft vullen. Vul het bekerglas met kraanwater en zorg ervoor dat de buisjes volledig ondergedompeld zijn.Verhit het bekerglas gevuld met glazen buisjes in de magnetron totdat het water krachtig kookt. Wees voorzichtig bij het smelten van de was en het agar-voedingsmedium, aangezien het water heet is. Haal het bekerglas uit de magnetron en roer de buisjes met een spatel of een plastic instrument.10 millimeter pipette om ingesloten was naar boven te laten drijven. Herhaal vervolgens de stap met de magnetron. Haal het bekerglas uit de magnetron en laat het afkoelen.Het plaatsen van het bekerglas in de koelruimte zal het proces versnellen. Naarmate het water afkoelt, verzamelt de was zich op het wateroppervlak en stolt deze geleidelijk. Verwijder de gestolde was handmatig.Hiermee zou het grootste deel van de was op de buisjes verwijderd moeten worden. Breng de activiteitsbuisjes over naar een nieuw bekerglas met vers kraanwater en herhaal het proces van magnetronverhitting en wasverwijdering. Aangezien de meeste was in de vorige stap is verwijderd, is het niet nodig om te wachten tot de was stolt.Giet het water eenvoudig uit het bekerglas en breng de buisjes over naar een nieuw bekerglas. Wees voorzichtig, aangezien het water nog heet is. Herhaal het magnetronproces voor de laatste keer.Giet het water uit het bekerglas en wacht tot de activiteitsbuisjes zijn afgekoeld. Plaats de activiteitsbuisjes vervolgens verticaal in bekerglazen van 250 milliliter of 500 milliliter. Zorg ervoor dat ze niet te dicht op elkaar staan.Steriliseer deze met een autoclaaf met een droogprogramma of droog de buisjes simpelweg in een droogoven om het medium voor te bereiden dat in de activiteitsbuisjes wordt geladen. Maak een oplossing van 5% sucrose en 2% bact to agar in gedestilleerd water of kraanwater en autoclaaf de oplossing. Het geautoclaveerde medium kan onmiddellijk worden gebruikt of gedurende een langere periode worden bewaard bij vier graden Celsius.Idealiter moet het voedsel ongeveer 65 °C zijn bij het vullen van de activiteitsbuisjes. Gebruik een pipet van 10 ml om de vloeibare voedingsoplossing langs de binnenwand van het glazen bekerglas te pipetteren, waarbij de buisjes van onderaf tot een derde worden gevuld. Schud het bekerglas voorzichtig heen en weer om er zeker van te zijn dat alle buisjes gelijkmatig zijn gevuld met de voedingsoplossing.Wacht tot het voedsel volledig is gestold, ofwel bij kamertemperatuur of bij vier graden Celsius. Zodra de condensatie in de glazen buisjes is verdwenen, kunnen de buisjes uit het bekerglas worden gehaald. Om de activiteitsbuisjes uit het bekerglas te verwijderen, duwt u de buisjes naar de bodem van het bekerglas en draait u ze tegelijkertijd, zodat het gestolde voedsel in de buisjes zich scheidt van de bodem van het bekerglas.Haal de buisjes uit het bekerglas, bij voorkeur als één groep. Maak vervolgens de buisjes één voor één schoon met papieren handdoekjes om overtollig voedsel van het buitenoppervlak van de buisjes te verwijderen. Zet de buisjes apart in een schone container.Neem een algemene laboratoriumblokverwarmer zonder buishouder en bedek de verwarmingsput zorgvuldig. Voeg met meerdere lagen stevig aluminiumfolie paraffinekorrels toe aan de met aluminium beklede verwarmingsput om deze te smelten; houd de buisjes aan het niet-voedseluiteinde vast en dompel het voedseluiteinde in de gesmolten was. Dompel het wasgedeelte in een glazen bekerglas gevuld met koud water om de stolling van de was te versnellen. Herhaal dit proces.Het kort onderdompelen van de wasbuisjes in water voorkomt dat de buisjes aan elkaar kleven. De buisjes kunnen direct worden gebruikt of bewaard in een luchtdichtreservoir bij vier graden Celsius voor later gebruik. Bij een bewaartermijn van meer dan een week zal het voedsel overmatig uitdrogen.Als de buisjes bij vier graden Celsius bewaard zijn, laat ze dan vóór gebruik op het aanrecht opwarmen tot kamertemperatuur. Schakel de incubatoren die voor de activiteitsmonitoren worden gebruikt in voordat de vliegen in de activiteitsbuisjes worden geplaatst. Pas de temperatuur aan met de bedieningselementen van de incubator en stel het licht-donkerregime in met de lichtcontroller van het DAM-systeem of het eigen lichtcontrolesysteem van de incubator, overeenkomstig het gewenste experimentele ontwerp.Anestheseer vervolgens de vliegen met koolstofdioxide. Breng daarna met een fijn schilderspenseel voorzichtig een enkele vlieg over naar een activiteitsbuisje. Pak het midden van een stukje garen van ongeveer een halve inch vast met een fijne pincet en steek het garen in het uiteinde van het activiteitsbuisje waar geen voedsel zit om de opening af te sluiten en te voorkomen dat de vlieg tijdens het experiment ontsnapt.Houd de buis op zijn zij tot de vlieg ontwaakt, terwijl u tegelijkertijd luchtstroom in de buis toelaat. Om te voorkomen dat de vlieg aan het voedsel blijft plakken, plaatst u de buizen in de activiteitsmonitoren. Bij het nieuwere, compactere model van de Tri Kinetics-monitoren is het noodzakelijk om de buizen met elastiekjes op hun plaats te houden om te garanderen dat de infraroodstraal de buis in de middenpositie passeert. Plaats tot slot de activiteitsmonitoren in de incubatoren en sluit ze via de telefoondraden aan op het gegevensverzamelingssysteem.Gebruik de software van het DAM-systeem om te controleren of alle monitoren correct zijn aangesloten en of er van elk monitor gegevens worden verzameld. Nu de vliegen in de activiteitsbuisjes zijn geplaatst en het systeem voor het monitoren van de locomotorische activiteit gereed is, kunnen de gegevens worden geregistreerd. Vliegen worden gesynchroniseerd en getraind door ze gedurende twee tot vijf volledige dagen bloot te stellen aan het gewenste licht-, donker- of LD- en temperatuurregime.De meest gebruikte entrainment-conditie is een licht-donkercyclus van 12 uur licht en 12 uur donker bij 25 °C. Voor de studie van circadiane ritmes relatief aan dit protocol wordt het tijdstip waarop de lampen in de incubator aangaan gedefinieerd als ZT 0, en alle andere tijdstippen zijn relatief aan deze waarde. Onder standaard 12:12 LD-condities vertonen wildtype *Drosophila melanogaster* gewoonlijk twee perioden van activiteit: één gecentreerd rond ZT 0, de ochtendpiek genoemd, en een andere rond ZT 12, de avondpiek genoemd. Vrije-lopende locomotorische activiteitsritmes worden gemeten onder constante donker- en temperatuurcondities na de entrainment-periode.De instelling voor de lichtcyclus kan op elk gewenst moment tijdens de donkerfase op de laatste dag van ld worden gewijzigd, zodat de volgende dag van het experiment de eerste dag van dd vormt. Zeven dagen aan DD-gegevensverzameling zijn voldoende om de circadiane periode en de amplitude of ritmekracht van de vliegen te berekenen. Over het algemeen is een steekproefomvang van ten minste 16 vliegen noodzakelijk om betrouwbare free-running perioden voor een specifiek genotype te verkrijgen.Aan het einde van het experiment worden de ruwe binaire gegevens, verzameld met de DAM-systeemsoftware, gedownload naar een draagbaar gegevensopslagapparaat, zoals een USB-stick. De ruwe binaire gegevens worden verwerkt met DAM file scan 1 0 2 x en samengevoegd in intervallen van 15 en 30 minuten bij de analyse van circadiane parameters, of in intervallen van één tot vijf minuten bij de analyse van de slaap.Rustparameters. Momenteel is vijf aaneengesloten minuten inactiviteit de standaarddefinitie voor slaaprust bij Drosophila. Na voltooiing van dit protocol kan dezelfde dataset worden gebruikt om de circadiane parameters en slaapparameters van de experimentele en controle-dieren te vergelijken voor circadiane parameters.Inductiegrafieken die de dagelijkse locomotorische activiteiten of de gemiddelde activiteiten van vliegen over meerdere dagen in LD- of DD-condities illustreren, kunnen worden gegenereerd met behulp van fast x oph melanogaster vertonen over het algemeen twee perioden van activiteit, één gecentreerd rond ZT 0, de ochtendpiek genoemd, en een andere rond ZT 12, de avondpiek genoemd. Deze twee activiteitsperioden worden aangestuurd door de endogene klok en kunnen zelfs worden waargenomen in vrijlopende DD-condities. Veranderingen in de timing van deze activiteitspieken kunnen eenvoudig worden waargenomen in inductiegrafieken en kunnen duiden op een verandering in de eigenschappen van de endogene klok.Een andere eigenschap die duidt op een correcte klokfunctie is de anticipatoire toename van de locomotorische activiteit die wordt waargenomen in LD-cycli en plaatsvindt voorafgaand aan de feitelijke overgangen van donker naar licht of van licht naar donker. Dit gedrag is duidelijk waarneembaar bij wild-type vliegen, maar ontbreekt en is arrhythmic bij per zero-mutanten. In deze mutant.De waargenomen ochtend- en avondpieken in LD zijn louter schrikreacties als gevolg van abrupte veranderingen in de licht-donkercondities. De vliegen zonder biologische klok anticiperen niet op omgevingsveranderingen, maar reageren er simpelweg op. Het verlies van gedragsritmiek is veel uitgesprokener in DD en uit zich over het algemeen in het totale verlies van ochtend- of avondpieken van locomotorische activiteit, zoals te zien is bij per zero-vliegen.Naast inductiegrafieken kunnen gegevens over de locomotorische activiteit worden weergegeven als een dubbel plotgram voor elke individuele vlieg of vliegengenotype, waarbij gegevens van twee dagen opeenvolgend op elke regel worden uitgezet, maar het profiel van de laatste dag de volgende regel van twee dagen aan activiteit begint. Bijvoorbeeld, LD één en twee worden uitgezet op de eerste regel van het ACTO-gram. De volgende regel begint met een herhaling van LD twee en wordt gevolgd door LD drie, enzovoort.Volgens dit formaat worden de gegevens van de locomotorische activiteit over het gehele experiment weergegeven in het ACTO-gram; een voordeel van ACTO-grammen ten opzichte van reductiegrafieken is dat een verandering in de periodelengte van dagelijkse activiteitsritmes eenvoudig waarneembaar is, naast het genereren van inductiegrafieken en ACTO-grammen.Gegevens over de locomotorische activiteit uit de DD-conditie kunnen worden ingevoerd in far X om de periodelengte te berekenen met behulp van verschillende programma's, waaronder cycle P voor de analyse van slaap- en rustparameters, waarbij rust wordt gedefinieerd als vijf opeenvolgende minuten van inactiviteit. Men kan gegevens analyseren die zijn geregistreerd met locomotorische activiteitstests en meerdere slaapparameters onderzoeken met insomniac, een programma op basis van MATLAB; hiermee kan het percentage tijd dat vliegen slapend doorbrengen worden berekend over verschillende tijdsintervallen. Bijvoorbeeld het slaapprocent per uur of elke 12 uur.Andere meer gangbare slaapparameters die kunnen worden onderzocht, zijn onder meer de gemiddelde rustperiode-duur, wat een maat is voor hoe geconsolideerd de slaap is en de slaapkwaliteit kan illustreren. Een andere is de wake activity count, een maat voor de activiteitsgraad wanneer de vliegen wakker zijn. Deze parameter helpt om onderscheid te maken tussen vliegen bij wie de slaap- en rustgedragingen daadwerkelijk zijn beïnvloed en vliegen die ziek of hyperactief zijn.Vliegen die simpelweg ziek zijn, kunnen bijvoorbeeld vaker lijken te slapen omdat ze minder mobiel zijn. Voor deze vliegen zal de activiteit tijdens de waakperiode lager zijn in vergelijking met controledieren. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe circadiane en slaapfenotypes in drosophila via assays kunnen worden gekarakteriseerd. Dagritmes van locomotorische activiteit.

assaying-locomotor-activity-to-study-circadian-rhythms-sleep

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In dit artikel zal methoden die kunnen worden gebruikt om de circadiane functie en licht responsiviteit bij muizen te bepalen.

Meten Circadiaanse en acute Light Reacties in Muizen met behulp van Wiel Running Activity

Deze video beschrijft het Drosophila activity monitor (DAM) systeem dat wordt gebruikt om de motorische activiteit te volgen. Onderzoekers gebruiken activiteitsgegevens verzameld van de DAM om circadiaanse ritmes bij fruitvliegen te bestuderen. De aanbevolen protocolclip laat zien hoe u vliegen in het apparaat laadt en activiteitsgegevens opneemt voor circadiane experimenten.

Drosophila Activity Monitor (DAM): een methode om de motorische activiteit bij vliegen te meten

Drosophila melanogaster zijn nuttig bij het ​​bestuderen van genetische of ecologische manipulaties die gedrag zoals spontane motorische activiteit beïnvloeden. Hier beschrijven we een protocol dat monitoren met infrarood stralen en data analyse software om spontane bewegingsactiviteit kwantificeren gebruikt.

Bepaling van de Spontane bewegingsactiviteit in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Ziekte van Parkinson is een neurodegeneratieve aandoening die resulteert uit de degeneratie van dopaminerge neuronen in het centrale zenuwstelsel, waardoor voortbeweging defecten. Rotenone modellen ziekte van Parkinson in Drosophila. In dit document worden twee testen die zowel spontaan en schrikken geïnduceerde motoriek gebreken veroorzaakt door rotenon karakteriseren.

Methoden te karakteriseren Spontane en Schrik-geïnduceerde Locomotion in een-Rotenon geïnduceerde Parkinson&#39;s Disease Model van<em&gt; Drosophila</em

Dit rapport beschrijft een methode voor het meten van Drosophila larvenactiviteit met behulp van de TriKinetics Drosophila Activiteitsmonitor. Het apparaat gebruikt infraroodstralen om bewegingen van maximaal 16 individuele dieren te detecteren. Gegevens kunnen worden geanalyseerd om bewegingsparameters weer te geven, inclusief snelheden en de posities van de dieren binnen de testkamers.

Meting van larvale activiteit in de<em&gt; Drosophila</em&gt; Activity Monitor

Een methode om te kwantificeren van de belangrijkste tijdelijke functies gezien in vliegen circadiane ritmes van locomotor wordt gepresenteerd. De kwantificering wordt bereikt door het aanbrengen van vliegen activiteit met de golfvorm van een meerdere parametrische model. De model-parameters beschrijven de vorm en de grootte van de ochtend en avond toppen van dagelijkse activiteit.

Een rekenkundige methode om te kwantificeren vliegen circadiane activiteit

Hier beschrijven we hoe we Drosophila kunnen synchroniseren met een circadiane dag. Dit is de eerste en belangrijkste stap die nodig is voor het bestuderen van biologische ritmes en chronobiologie.

Circadiane Entrainment van Drosophila Melanogaster

Het huidige protocol beoordeelt de locomotorische activiteit van Drosophila door de beweging van vliegen in een handgemaakte arena te volgen en te analyseren met behulp van open-source software Fiji, compatibel met plug-ins om pixels van elk frame te segmenteren op basis van high-definition video-opname om parameters van snelheid, afstand, enz. Te berekenen.

Een eenvoudige techniek om locomotorische activiteit in Drosophila te testen

Gepresenteerd wordt een protocol voor high-throughput drug screening om de slaap te verbeteren door het slaapgedrag van fruitvliegjes te monitoren in een ouder Drosophila-model .

High-Throughput Small Molecule Drug Screening voor leeftijdsgebonden slaapstoornissen met behulp van Drosophila melanogaster

Dit protocol biedt een kader voor het beoordelen van door stress veroorzaakte gedragsveranderingen in Drosophila melanogaster. Door complementaire assays te combineren kunnen we activiteit, verkenning en besluitvorming voor individuele vliegen kwantificeren. De aanpak is flexibel en kan worden aangepast aan een breed scala aan studies die stressbiologie, metabolisme en neurogedragsfunctie onderzoeken.

Multimodale gedragsfenotypering van stress-geïnduceerde depressie-achtige toestanden bij Drosophila melanogaster

Leer hoe je circadiane en slaapfenotypen in Drosophila karakteriseert door dagelijkse locomotorische activiteitsritmes te meten met DAM-monitoren. Deze methode onthult genetische en milieu-invloeden op het circadiane systeem.

Het testen van de locomotorische activiteit te circadiaanse ritmes Studie en parameters Sleep in Drosophila

Meer video's verkennen