Het testen van de locomotorische activiteit te circadiaanse ritmes Studie en parameters Sleep in Drosophila

Het algemene doel van het volgende experiment is om circadiane en slaapfenotypes bij drosophila te karakteriseren door de dagelijkse ritmes van de locomotorische activiteit te analyseren. Dit wordt bereikt door trenchgene vliegen te genereren, specifieke mutanten te verkrijgen of de nodige kruisingen op te zetten om de experimentele dieren voor te bereiden. Als tweede stap moeten glazen activiteitsbuisjes met een voedingsbron worden klaargemaakt, die tijdens het experiment als habitat voor de vliegen zullen dienen.

Vervolgens worden vliegen van één tot vijf dagen oud in activiteitsbuisjes geplaatst, die in DAM-activiteitsmonitoren worden geladen om de ritmes van de locomotorische activiteit te monitoren. Met het DAM-systeem worden resultaten verkregen die defecten en variaties in circadiane en slaapparameters aantonen, gebaseerd op de analyse van dagelijkse locomotorische activiteitsritmes met software zoals far sex en insomniac. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de circadiane biologie, zoals welke eiwitten en regulatiemechanismen betrokken zijn bij het genereren van correcte ritmes, en bijvoorbeeld hoe omgevingsfactoren zoals licht en temperatuur gedragsritmes moduleren via specifieke moleculaire paden.

Het systeem voor het monitoren van locomotorische activiteit omvat talrijke apparaten, zoals gespecialiseerde monitoringsystemen, omgevingsincubators met de mogelijkheid tot dagelijkse lichtregeling, gegevensverzamelapparatuur, computers en randapparatuur zoals bekabeling. Kies een goed geventileerde ruimte met temperatuurregeling en een donkere kamer om het systeem voor het monitoren van locomotorische activiteit te huisvesten, om overmatige belasting van de incubators en een eventueel falen in het handhaven van de temperatuur te voorkomen. Sluit de kamer af van externe lichtbronnen. Het is niet nodig om volledig in het donker te werken, aangezien het circadiane systeem van de fruitvliegen niet gevoelig is voor infraroodlicht.

Daarom gebruiken we in gevallen waarin we in de donkere kamer moeten zien, simpelweg een standaard zaklamp die is voorzien van een gekocht rood filter, en een uninterruptible power supply (UPS) noodstroomvoorziening die voldoende wattagecapaciteit heeft om de componenten van het activiteitsmonitoringsysteem van stroom te voorzien. Sluit de UPS-noodstroomvoorziening bij een spanningspiek of stroomuitval in het gebouw aan op het noodstroomcircuit van het gebouw, indien beschikbaar. Als het systeem dat de verlichting in de incubator regelt niet direct door de incubator wordt aangestuurd, is het voldoende om de incubator zonder UPS op de noodstroom aan te sluiten, aangezien een stroomonderbreking van enkele seconden geen invloed heeft op de temperatuur in de kamer.

Stel vervolgens een computer in, een pc of Macintosh, die volledig is gewijd aan gegevensverzameling en/of aan de besturing van de incubatoren. Rangschik het telefoonlijnnetwerk handmatig en netjes rond de planken van de geconditioneerde incubatoren om het aansluiten en loskoppelen van de activiteit te vergemakkelijken. Stel de monitors zo in dat meerdere telefoonlijnen samenkomen in één hoofdlijn die uit de incubator loopt om verbinding te maken met de computer; verbind de bewakingsapparatuur in de incubatoren met de computer via een stroomvoorzieningsinterface-unit, die dient om de activiteitsmonitor via de telefoonlijn van stroom te voorzien.

Maskeer ten slotte mogelijke lichtbronnen van LED's van elektronische apparatuur of een onvolledig afgesloten incubatordeur met ducttape of een zwarte doek, om te garanderen dat vrijlopende ritmes worden gemeten in de afwezigheid van ongewenst licht. Het is cruciaal om deze fenotypes te beoordelen met behulp van geschikte controledieren die onder dezelfde omgevingsomstandigheden en op dezelfde leeftijd zijn opgegroeid.

Daarnaast is er sprake van seksueel dimorfisme in de circadiane ritmiek. De algemene praktijk is om voor deze assays volwassen mannelijke vliegen te gebruiken die zijn opgekweekt bij 25 °C en tussen de één en vijf dagen oud zijn, omdat de eiafzetting bij vrouwelijke vliegen de werkelijke meting van de locomotorische activiteit beïnvloedt. Bij het onderzoeken van circadiane parameters en slaap-rustparameters van specifieke mutante vliegen van belang, is het raadzaam om de mutante stam te kruisen met de wildtype-stam met dezelfde genetische achtergrond.

Bijvoorbeeld W 1118 of yw. Aangezien er bij drosophila-mannetjes geen overkruising plaatsvindt, is het raadzaam om de uitkruising uit te voeren door mutante vrouwtjes te kruisen met wildtype mannetjes; zet zowel de wildtype controle- als de mutante vliegen tegelijkertijd uit. In standaard drosophila-voedsel gedurende ongeveer 10 tot 14 dagen vóór het experiment naar het ritme van de locomotorische activiteit. Verzamel na de uitkomst van het nageslacht mannetjesvliegen van één tot vijf dagen oud en zet deze apart voor gebruik in de experimenten.

Activiteitbuisjes representeren het habitat van de vlieg. Tijdens het experiment zijn dit dunne glazen buisjes van vijf millimeter die aan het ene uiteinde voedingsstof bevatten en aan het andere uiteinde zijn afgesloten met garen of een plastic stop. Het is bij voorkeur aanbevolen om vers gemaakte activiteitbuisjes te gebruiken.

Deze worden doorgaans enkele dagen tot een week voor de start van het experiment voorbereid. Aangezien glazen activiteitsbuisjes meerdere keren hergebruikt kunnen worden, beschrijven de volgende voorbereidingsprocedures het gebruik van eerder gebruikte en onreine activiteitsbuisjes als uitgangspunt. Indien u nieuwe activiteitsbuisjes gebruikt, kunt u direct overgaan naar het autoclaven van de buisjes, zoals later beschreven.

Verwijder de doppen uit de gebruikte activiteitsbuisjes en plaats deze in een groot glazen bekerglas. De buisjes mogen het bekerglas slechts tot de helft vullen. Vul het bekerglas met kraanwater en zorg ervoor dat de buisjes volledig ondergedompeld zijn.

Verhit het bekerglas gevuld met glazen buisjes in de magnetron totdat het water krachtig kookt. Wees voorzichtig bij het smelten van de was en het agar-voedingsmedium, aangezien het water heet is. Haal het bekerglas uit de magnetron en roer de buisjes met een spatel of een plastic instrument.

10 millimeter pipette om ingesloten was naar boven te laten drijven. Herhaal vervolgens de stap met de magnetron. Haal het bekerglas uit de magnetron en laat het afkoelen.

Het plaatsen van het bekerglas in de koelruimte zal het proces versnellen. Naarmate het water afkoelt, verzamelt de was zich op het wateroppervlak en stolt deze geleidelijk. Verwijder de gestolde was handmatig.

Hiermee zou het grootste deel van de was op de buisjes verwijderd moeten worden. Breng de activiteitsbuisjes over naar een nieuw bekerglas met vers kraanwater en herhaal het proces van magnetronverhitting en wasverwijdering. Aangezien de meeste was in de vorige stap is verwijderd, is het niet nodig om te wachten tot de was stolt.

Giet het water eenvoudig uit het bekerglas en breng de buisjes over naar een nieuw bekerglas. Wees voorzichtig, aangezien het water nog heet is. Herhaal het magnetronproces voor de laatste keer.

Giet het water uit het bekerglas en wacht tot de activiteitsbuisjes zijn afgekoeld. Plaats de activiteitsbuisjes vervolgens verticaal in bekerglazen van 250 milliliter of 500 milliliter. Zorg ervoor dat ze niet te dicht op elkaar staan.

Steriliseer deze met een autoclaaf met een droogprogramma of droog de buisjes simpelweg in een droogoven om het medium voor te bereiden dat in de activiteitsbuisjes wordt geladen. Maak een oplossing van 5% sucrose en 2% bact to agar in gedestilleerd water of kraanwater en autoclaaf de oplossing. Het geautoclaveerde medium kan onmiddellijk worden gebruikt of gedurende een langere periode worden bewaard bij vier graden Celsius.

Idealiter moet het voedsel ongeveer 65 °C zijn bij het vullen van de activiteitsbuisjes. Gebruik een pipet van 10 ml om de vloeibare voedingsoplossing langs de binnenwand van het glazen bekerglas te pipetteren, waarbij de buisjes van onderaf tot een derde worden gevuld. Schud het bekerglas voorzichtig heen en weer om er zeker van te zijn dat alle buisjes gelijkmatig zijn gevuld met de voedingsoplossing.

Wacht tot het voedsel volledig is gestold, ofwel bij kamertemperatuur of bij vier graden Celsius. Zodra de condensatie in de glazen buisjes is verdwenen, kunnen de buisjes uit het bekerglas worden gehaald. Om de activiteitsbuisjes uit het bekerglas te verwijderen, duwt u de buisjes naar de bodem van het bekerglas en draait u ze tegelijkertijd, zodat het gestolde voedsel in de buisjes zich scheidt van de bodem van het bekerglas.

Haal de buisjes uit het bekerglas, bij voorkeur als één groep. Maak vervolgens de buisjes één voor één schoon met papieren handdoekjes om overtollig voedsel van het buitenoppervlak van de buisjes te verwijderen. Zet de buisjes apart in een schone container.

Neem een algemene laboratoriumblokverwarmer zonder buishouder en bedek de verwarmingsput zorgvuldig. Voeg met meerdere lagen stevig aluminiumfolie paraffinekorrels toe aan de met aluminium beklede verwarmingsput om deze te smelten; houd de buisjes aan het niet-voedseluiteinde vast en dompel het voedseluiteinde in de gesmolten was. Dompel het wasgedeelte in een glazen bekerglas gevuld met koud water om de stolling van de was te versnellen. Herhaal dit proces.

Het kort onderdompelen van de wasbuisjes in water voorkomt dat de buisjes aan elkaar kleven. De buisjes kunnen direct worden gebruikt of bewaard in een luchtdichtreservoir bij vier graden Celsius voor later gebruik. Bij een bewaartermijn van meer dan een week zal het voedsel overmatig uitdrogen.

Als de buisjes bij vier graden Celsius bewaard zijn, laat ze dan vóór gebruik op het aanrecht opwarmen tot kamertemperatuur. Schakel de incubatoren die voor de activiteitsmonitoren worden gebruikt in voordat de vliegen in de activiteitsbuisjes worden geplaatst. Pas de temperatuur aan met de bedieningselementen van de incubator en stel het licht-donkerregime in met de lichtcontroller van het DAM-systeem of het eigen lichtcontrolesysteem van de incubator, overeenkomstig het gewenste experimentele ontwerp.

Anestheseer vervolgens de vliegen met koolstofdioxide. Breng daarna met een fijn schilderspenseel voorzichtig een enkele vlieg over naar een activiteitsbuisje. Pak het midden van een stukje garen van ongeveer een halve inch vast met een fijne pincet en steek het garen in het uiteinde van het activiteitsbuisje waar geen voedsel zit om de opening af te sluiten en te voorkomen dat de vlieg tijdens het experiment ontsnapt.

Houd de buis op zijn zij tot de vlieg ontwaakt, terwijl u tegelijkertijd luchtstroom in de buis toelaat. Om te voorkomen dat de vlieg aan het voedsel blijft plakken, plaatst u de buizen in de activiteitsmonitoren. Bij het nieuwere, compactere model van de Tri Kinetics-monitoren is het noodzakelijk om de buizen met elastiekjes op hun plaats te houden om te garanderen dat de infraroodstraal de buis in de middenpositie passeert. Plaats tot slot de activiteitsmonitoren in de incubatoren en sluit ze via de telefoondraden aan op het gegevensverzamelingssysteem.

Gebruik de software van het DAM-systeem om te controleren of alle monitoren correct zijn aangesloten en of er van elk monitor gegevens worden verzameld. Nu de vliegen in de activiteitsbuisjes zijn geplaatst en het systeem voor het monitoren van de locomotorische activiteit gereed is, kunnen de gegevens worden geregistreerd. Vliegen worden gesynchroniseerd en getraind door ze gedurende twee tot vijf volledige dagen bloot te stellen aan het gewenste licht-, donker- of LD- en temperatuurregime.

De meest gebruikte entrainment-conditie is een licht-donkercyclus van 12 uur licht en 12 uur donker bij 25 °C. Voor de studie van circadiane ritmes relatief aan dit protocol wordt het tijdstip waarop de lampen in de incubator aangaan gedefinieerd als ZT 0, en alle andere tijdstippen zijn relatief aan deze waarde. Onder standaard 12:12 LD-condities vertonen wildtype *Drosophila melanogaster* gewoonlijk twee perioden van activiteit: één gecentreerd rond ZT 0, de ochtendpiek genoemd, en een andere rond ZT 12, de avondpiek genoemd. Vrije-lopende locomotorische activiteitsritmes worden gemeten onder constante donker- en temperatuurcondities na de entrainment-periode.

De instelling voor de lichtcyclus kan op elk gewenst moment tijdens de donkerfase op de laatste dag van ld worden gewijzigd, zodat de volgende dag van het experiment de eerste dag van dd vormt. Zeven dagen aan DD-gegevensverzameling zijn voldoende om de circadiane periode en de amplitude of ritmekracht van de vliegen te berekenen. Over het algemeen is een steekproefomvang van ten minste 16 vliegen noodzakelijk om betrouwbare free-running perioden voor een specifiek genotype te verkrijgen.

Aan het einde van het experiment worden de ruwe binaire gegevens, verzameld met de DAM-systeemsoftware, gedownload naar een draagbaar gegevensopslagapparaat, zoals een USB-stick. De ruwe binaire gegevens worden verwerkt met DAM file scan 1 0 2 x en samengevoegd in intervallen van 15 en 30 minuten bij de analyse van circadiane parameters, of in intervallen van één tot vijf minuten bij de analyse van de slaap.

Rustparameters. Momenteel is vijf aaneengesloten minuten inactiviteit de standaarddefinitie voor slaaprust bij Drosophila. Na voltooiing van dit protocol kan dezelfde dataset worden gebruikt om de circadiane parameters en slaapparameters van de experimentele en controle-dieren te vergelijken voor circadiane parameters.

Inductiegrafieken die de dagelijkse locomotorische activiteiten of de gemiddelde activiteiten van vliegen over meerdere dagen in LD- of DD-condities illustreren, kunnen worden gegenereerd met behulp van fast x oph melanogaster vertonen over het algemeen twee perioden van activiteit, één gecentreerd rond ZT 0, de ochtendpiek genoemd, en een andere rond ZT 12, de avondpiek genoemd. Deze twee activiteitsperioden worden aangestuurd door de endogene klok en kunnen zelfs worden waargenomen in vrijlopende DD-condities. Veranderingen in de timing van deze activiteitspieken kunnen eenvoudig worden waargenomen in inductiegrafieken en kunnen duiden op een verandering in de eigenschappen van de endogene klok.

Een andere eigenschap die duidt op een correcte klokfunctie is de anticipatoire toename van de locomotorische activiteit die wordt waargenomen in LD-cycli en plaatsvindt voorafgaand aan de feitelijke overgangen van donker naar licht of van licht naar donker. Dit gedrag is duidelijk waarneembaar bij wild-type vliegen, maar ontbreekt en is arrhythmic bij per zero-mutanten. In deze mutant.

De waargenomen ochtend- en avondpieken in LD zijn louter schrikreacties als gevolg van abrupte veranderingen in de licht-donkercondities. De vliegen zonder biologische klok anticiperen niet op omgevingsveranderingen, maar reageren er simpelweg op. Het verlies van gedragsritmiek is veel uitgesprokener in DD en uit zich over het algemeen in het totale verlies van ochtend- of avondpieken van locomotorische activiteit, zoals te zien is bij per zero-vliegen.

Naast inductiegrafieken kunnen gegevens over de locomotorische activiteit worden weergegeven als een dubbel plotgram voor elke individuele vlieg of vliegengenotype, waarbij gegevens van twee dagen opeenvolgend op elke regel worden uitgezet, maar het profiel van de laatste dag de volgende regel van twee dagen aan activiteit begint. Bijvoorbeeld, LD één en twee worden uitgezet op de eerste regel van het ACTO-gram. De volgende regel begint met een herhaling van LD twee en wordt gevolgd door LD drie, enzovoort.

Volgens dit formaat worden de gegevens van de locomotorische activiteit over het gehele experiment weergegeven in het ACTO-gram; een voordeel van ACTO-grammen ten opzichte van reductiegrafieken is dat een verandering in de periodelengte van dagelijkse activiteitsritmes eenvoudig waarneembaar is, naast het genereren van inductiegrafieken en ACTO-grammen.

Gegevens over de locomotorische activiteit uit de DD-conditie kunnen worden ingevoerd in far X om de periodelengte te berekenen met behulp van verschillende programma's, waaronder cycle P voor de analyse van slaap- en rustparameters, waarbij rust wordt gedefinieerd als vijf opeenvolgende minuten van inactiviteit. Men kan gegevens analyseren die zijn geregistreerd met locomotorische activiteitstests en meerdere slaapparameters onderzoeken met insomniac, een programma op basis van MATLAB; hiermee kan het percentage tijd dat vliegen slapend doorbrengen worden berekend over verschillende tijdsintervallen. Bijvoorbeeld het slaapprocent per uur of elke 12 uur.

Andere meer gangbare slaapparameters die kunnen worden onderzocht, zijn onder meer de gemiddelde rustperiode-duur, wat een maat is voor hoe geconsolideerd de slaap is en de slaapkwaliteit kan illustreren. Een andere is de wake activity count, een maat voor de activiteitsgraad wanneer de vliegen wakker zijn. Deze parameter helpt om onderscheid te maken tussen vliegen bij wie de slaap- en rustgedragingen daadwerkelijk zijn beïnvloed en vliegen die ziek of hyperactief zijn.

Vliegen die simpelweg ziek zijn, kunnen bijvoorbeeld vaker lijken te slapen omdat ze minder mobiel zijn. Voor deze vliegen zal de activiteit tijdens de waakperiode lager zijn in vergelijking met controledieren. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe circadiane en slaapfenotypes in drosophila via assays kunnen worden gekarakteriseerd. Dagritmes van locomotorische activiteit.