Isolatie van Valvulaire endotheelcellen

In dit videoprotocol wordt de isolatie van residente interstitiële cellen en zijdespecifieke endotheelcellen uit een aortaklep gedemonstreerd. De klepflap wordt uit het hart geoogst en in een koude zoutoplossing geplaatst. De endotheellaag kan van beide zijden van de flap worden verwijderd door het weefsel, terwijl het is ondergedompeld in een collagenase-oplossing, voorzichtig met een wattenstaafje af te schrapen; voor zijdespecifieke isolatie wordt de klepflap op een paraffinebed vastgepind zodat het endotheeloppervlak is blootgesteld.

Vervolgens worden een paar druppels koude collagenase aan het klepblad toegevoegd en worden de klepbladen gedurende vijf tot 10 minuten geïncubeerd. Na de incubatie met collagenase wordt de zijspecifieke endotheellaag verwijderd door het weefsel voorzichtig af te schrapen. De vrijgekomen endotheelcellen worden vervolgens met een wattenstaafje verzameld, gewassen en uitgeplaat.

De resterende klepbladen worden vervolgens gedurende de nacht gedigesteerd om de interstitiële cellen te isoleren, welke worden verzameld en gewassen. Alle geïsoleerde cellen worden gekweekt en kunnen worden gebruikt om hun rol in het herstel en de remodellering van de hartklep te begrijpen als reactie op lokale mechanische en biologische signalen. Hoi, mijn naam is Russell Gould.

Ik ben hier aan de Cornell University, in de afdeling biomedische technologie, waar ik werk in het Butcher-lab. Vandaag laat ik u zien hoe u valvulaire endotheelcellen kunt isoleren. De implicaties van deze techniek reiken tot het begrijpen van hoe residente V-cellen zich constant herstellen en remodelleren als reactie op mechanische en biologische signalen.

Laten we beginnen. Verkrijg eerst een varken bij het lokale slachthuis en werk aseptisch om de aortawortel uit te snijden. Spoel de aortawortel grondig schoon om al het bloed te verwijderen.

Met koud, steriel DPBS is het essentieel om alle bloedcomponenten zo snel mogelijk te verwijderen om de sterfte van valvulaire endotheelcellen of VEC's en bacteriële contaminatie te beperken. Antibiotica en antimycotica worden in dit stadium afgeraden, omdat ze potentieel schadelijk zijn voor de cellen. Isoleer vervolgens direct uit de aortawortel.

Klepbladen van elke klep. Wees voorzichtig bij het isoleren van het klepblad, aangezien elk annulair weefsel de celpopulatie zal contamineren. Plaats de geïsoleerde klepbladen in een steriele conische buis van 15 milliliter gevuld met 12 milliliter koude DPBS.

Schud meerdere keren om debris te verwijderen en vul opnieuw met verse DPBS. Transporteer de hartklepbladen vervolgens op ijs terug naar het laboratorium. Plaats bij aankomst in het laboratorium de container met het weefsel onder de steriele laminaire flowkast om over te gaan tot het isoleren van de endotheellaag; autoclafeer de volgende instrumenten in een afgedekte instrumentenbak: gekartelde weefselpincetten, weefselscharen en wattenstaafjes.

Bereid daarnaast een steriele collagenase-oplossing, endotheliaal medium en interstitieel medium voor, zoals gedetailleerd beschreven in het bijbehorende schriftelijke protocol. Vul een steriele schaal van 35 millimeter met drie milliliter koude collagenase-oplossing per klep en plaats alle drie de klepbladen uit de buis van 15 milliliter in de schaal.

Incubeer het weefsel gedurende vijf tot 10 minuten bij 37 °C. Verwijder vervolgens voorzichtig de endotheellaag van beide zijden van de leaflet door een droge steriele wattenstaaf over het oppervlak te draaien. De draairichting en de hoeveelheid uitgeoefende schuifkracht zijn cruciaal voor de zuiverheid van het monster.

De rotatie van het wattenstaafje vindt plaats in de tegenovergestelde richting van de lineaire beweging van de hand die het wattenstaafje vasthoudt. Dit creëert een gecontroleerde schuifspanning waardoor de endotheelcellen van het weefsel worden losgemaakt. De uitgeoefende kracht is voldoende om de weerstand van het weefsel te voelen, maar zonder het basaalmembraan te penetreren; dep het wattenstaafje af en toe in de collagenase-oplossing om de cellen van de vezels van de tip te laten loslaten.

Nadat het afschrapen is voltooid, moet de textuur van de endotheliale laag iets gladder aanvoelen dan voorheen. Verzamel de cellen die gesuspendeerd zijn in de collagenase-oplossing en breng deze over naar een nieuwe steriele 15 liter buis. Plaats de leaflets direct na het afschrapen van de endotheliale cellen in een 15 milliliter buis met 10 milliliter collagenase-oplossing voor de isolatie van interstitiële cellen.

Centrifugeer de buizen 5 minuten bij 1000 RPM op kamertemperatuur om de geïsoleerde cellen te pelletiseren en zuig het supernatant af. Voeg drie milliliter endotheliaal medium toe aan de 15 milliliter buizen. Centrifugeer een tweede keer zoals voorheen en zuig het medium af.

Deze tweede centrifugatie helpt bij het filteren van ongewenste materialen, zoals tipvezels. Resuspendeer de gecentrifugeerde endotheelcellen in vijf milliliter endotheelmedium en zaai de cellen uit in een T 25-fles die vooraf is gecoat met collageen. Gebruik één fles per centrifugebuis en laat de cellen ten minste twee tot drie dagen groeien voordat het endotheelmedium wordt vervangen.

Dit helpt de cellen te herstellen en te delen. Omdat het isolatieproces vrij belastend is en de celopbrengst laag kan zijn, is het essentieel om de cellen te passageren wanneer ze bijna confluent zijn. Aangezien contactinhibitie kan leiden tot celtransformatie, kunnen endotheliale cellen ook van een specifieke zijde worden geïsoleerd.

Om dit te doen, bereid eerst een petrischaal voor met een paraffinebed. Gebruik glazen petrischalen van 60 millimeter met aluminiumfolie. Reken op twee glazen schalen per leaflet.

Het aluminiumfolie helpt bij het verwijderen van de paraffine om de petrischaal opnieuw te kunnen gebruiken. Plaats vervolgens paraffinekralen in de schalen tot ze ongeveer halfvol zijn en dek ze af voor het autoclaveren. Zodra het autoclaveren is voltooid en de paraffine is gesmolten, verplaatst u het geheel van schalen naar een koel, vlak oppervlak.

Terwijl de paraffine afkoelt, hardt deze uit en vormt er een laag die bestand is tegen naaldpuncties. Na 60 minuten kan de gesteriliseerde schaal worden gebruikt om het leafletweefsel te immobiliseren. Verwijder de uit de klep geïsoleerde leaflets uit de buisjes van 15 milliliter en plaats deze op het paraffinebed.

Hanteer de klepbladen zodanig dat de ventriculaire zijde naar beneden op het paraffine-oppervlak ligt, waardoor de fibrosezijde is blootgesteld. Zet de randen van het klepblad vast met spelden om de endotheellaag bloot te leggen. Plaats vervolgens een paar druppels koude collagenase op elk naar boven gericht endotheelioppervlak en incubeer het weefsel gedurende 5 tot 10 minuten bij 37 °C.

Wanneer de incubatie voltooid is, wordt de endotheliale laag voorzichtig verwijderd zoals eerder beschreven door een droog steriel wattenstaafje over het oppervlak van het blad te draaien. Dep het wattenstaafje af en toe in de collagenase-oplossing om cellen van de vezels van de tip te lossen. Na het afnemen moet de textuur van de endotheliale laag iets gladder aanvoelen dan voorheen.

Verzamel de celsuspensie en breng deze over naar een nieuwe steriele buis van 15 milliliter. Geef de zijspecificiteit aan op de labels; leaflets van dezelfde klep kunnen worden samengevoegd. Spoel de geïmmobiliseerde klep met enkele druppels koude DPBS om eventuele resterende cellen of debris weg te wassen.

Breng de leaflets over naar een nieuwe kweekschaal zodat de ventriculaire zijde nu is blootgesteld en verzamel de endotheelcellen zoals zojuist is getoond. Zodra het afnemen van de endotheelcellen van de G-leaflet is voltooid, plaatst u de leaflets onmiddellijk in een buis van 15 milliliter met 10 milliliter collagenase-oplossing. Was de cellen, resuspendeer ze en kweek ze zoals getoond voor de niet-zijde-specifieke isolatie van de endotheelcellen.

Als de celopbrengst erg laag is, overweeg dan om over te stappen op een kleinere kolf of een wellplaat. Aangezien celadhesie de celgroei bevordert, dient u de cellen te passageren wanneer ze bijna confluent zijn. Omdat contactinhibitie kan leiden tot celtransformatie, start u de isolatie van interstitiële cellen terwijl u de endotheelcellen centrifugeert; incubeer de buisjes met de leaflets gedurende ongeveer 12 tot 18 uur.

In de collagenase-oplossing, indien gewenst onder zachte agitatie. Gebruik aan het einde van de incubatieperiode een serologische pipet om het verterende weefsel voorzichtig te mengen totdat de celsuspensie homogeen is. Deze homogenisatie helpt het weefsel af te breken en de interstitiële cellen vrij te maken; centrifugeer en was de cellen zoals beschreven voor de endotheelcellen.

Gebruik in plaats daarvan vijf milliliter interstitiummedium resus, suspendeer de gecentrifugeerde interstitiële cellen in 15 milliliter interstitiummedium en zaai de cellen uit in een T 75-fles, waarbij één fles per centrifugebuis wordt gebruikt. Laat de cellen ten minste één tot twee dagen groeien voordat het interstitiummedium wordt vervangen; verwacht meer weefselresten dan bij de endotheelcellen. Bovendien groeien de interstitiële cellen van nature sneller tot confluentie dan de endotheelcellen en leveren ze hogere celopbrengsten in deze representatieve afbeeldingen.

De morfologie van gecultiveerde V Cs valvulaire endotheelcellen en vs. valvulaire interstitiële cellen wordt getoond na twee tot drie dagen. Becs vertonen een typische endotheelmorfologie waarbij de cellen een kasseienpatroon vertonen en clusters beginnen te vormen.

De morfologie van de VS.Exhibit is vergelijkbaar met die van myofibroblasten, waarbij de cellen over het algemeen spoelvormig zijn en schaars aanwezig wanneer ze tot co-fluentie worden gekweekt; ECS vertonen een typische endotheliale morfologie waarbij de cellen een klinkerpatroon vormen en de groei contactgeremd is. De VI CS vertonen een morfologie die vergelijkbaar is met die van myofibroblasten, waarbij de cellen over het algemeen spoelvormig zijn en niet contactgeremd. Functionele kenmerken van zowel VEC als VIC kunnen worden afgeleid uit kleuring. Voor een ated LDL-opname.

VEC-cellen zijn geassocieerd met hoge niveaus van opname van geacetyleerd LDL. Terwijl VIC-cellen geassocieerd zijn met lage niveaus van opname van geacetyleerd LDL, worden hier de celmarkers van VEC en VIC getoond. ECS kleuren positief voor von Willebrand-factor terwijl vs.

Vertonen geen kleuring voor von Willebrand factor. Bovendien is de V CS-kleuring negatief voor alpha smooth muscle actin, terwijl de V CS-kleuring positief is voor alpha smooth muscle actin. Nou, ik hoop dat jullie vandaag veel hebben geleerd van onze isolaties.

Het is echter belangrijk om te onthouden dat het basaal membraan van de endotheelcellen zeer fragiel is en dat elke verstoring van de onderliggende matrix vaak resulteert in het vrijkomen van contaminerende cellen uit de rest van het weefsel. Om een succesvolle isolatie te bevestigen, is karakterisering cruciaal om de zuiverheid van uw isolaties te beoordelen. Veel succes dus.