Het beoordelen van stomatale Reactie op bacteriële cellen Live met behulp van Whole Leaf Imaging
2 oktober 2010
We hebben een eenvoudige en reproduceerbare protocol om stomatale reactie op de levende bacteriën te openen. Deze methode minimaliseert verwonden en manipulatie van het blad ten opzichte van het gebruik van de epidermale schillen eerder gerapporteerd.
In deze procedure wordt bladbeeldvorming gebruikt om de beweging van sluitcellen als reactie op levende bacteriële cellen te beoordelen. Eerst worden de bacteriën gekweekt vanuit een glycerolstock en wordt een inoculum voorbereid. Vervolgens worden jonge, gezonde bladeren verzameld en gekleurd met propidiumjodide.
De gekleurde bladeren worden uitgesneden en de bladfragmenten worden geïncubeerd bovenop een bacteriële suspensie. Ten slotte wordt het bladoppervlak onder de microscoop waargenomen, waarna de stomata-openingen kunnen worden gemeten. De resultaten verkregen met fluorescentiemicroscopie tonen veranderingen in de stomata-opening als reactie op bacteriën.
Het belangrijkste voordeel van deze methode ten opzichte van bestaande methoden, zoals het gebruik van epidermale peels, is dat het blad dat in contact komt met de bacteriën intact blijft, waardoor de natuurlijke omstandigheden voor bacteriële penetratie in de bladeren worden nagebootst. Om deze procedure te starten, worden Arabidopsis-zaden gezaaid op een mengsel van groeimedium, vermiculiet en perliet in een verhouding van 1:1:1. Laat de planten groeien in een groeikamer en bewater indien nodig.
De planten zijn na vier tot zes weken klaar voor gebruik, wanneer ze jonge, volledig uitgevouwen bladeren hebben voordat ze in bloei schieten. Bereid twee dagen voor aanvang van het experiment de bacteriecultuur-streek voor. Streep Pseudomonas ringe uit een glycerolvoorraad op gemodificeerd LB-medium en incubeer dit gedurende 24 uur bij 28 °C.
Gebruik een verse cultuur voor het bereiden van het inoculum en start cultuurplaten altijd vanuit glycerolstocks. Aangezien bacteriën na subcultivering minder virulent worden, moeten bacteriën die op de plaat zijn gegroeid worden gebruikt om een vloeibare cultuur van 10 milliliter pseudomona singe te starten. Incubeer de cultuur gedurende de nacht in een erlenmeyer van 50 milliliter bij 28 degrees Celsius onder krachtig schudden tot een optische dichtheid (OD) bij 600 nanometers tussen 0,8 en 1 is bereikt.
Meet de OD bij 600 en oogst de cellen door centrifugatie bij 1.360 ×g gedurende 10 minuten. Resuspendeer de cellen in gedestilleerd water zodat de uiteindelijke OD 0,2 is. Deze OD komt overeen met 10⁸ colony forming units per milliliter.
Nadat de bacteriën gereed zijn, kunt u overgaan tot het voorbereiden van de bladeren en het uitvoeren van de assay om de bladeren te kleuren. Bereid eerst een 20 µM propidiumjodide- of PI-oplossing in water. 10 mL van deze oplossing is voldoende om drie kleine bladeren tegelijk te kleuren.
Haal de planten uit de groeikamer en verwijder met een pincet drie jonge, volledig ontplooide bladeren. Dompel de volledige bladeren vijf minuten lang onder in de PI-oplossing. Verwijder vervolgens de bladeren en spoel ze kort af met gedestilleerd water.
Plaats vervolgens een blad met de onderzijde naar beneden op een objectglas. Snijd het blad met een scherp scheermesje in vier stukken, zonder de hoofdnerf mee te nemen, zodat het blad plat op het objectglas ligt om de bacteriën met de bladeren te incuberen. Voeg 300 µL bacteriële suspensie toe onder de bladstukjes op het objectglas en zorg ervoor dat de onderzijde van het blad in contact is met het inoculum.
Incubeer de monsters onder dezelfde omgevingsomstandigheden die zijn gebruikt voor de kweek van de planten. Wanneer het tijd is om de bladeren onder de microscoop te observeren, brengt u de bladfragmenten over naar een nieuw objectglas met de onderzijde naar boven gericht. Let op dat er geen dekglas wordt gebruikt bij het monteren van de preparaten.
Hetzelfde bladsample kan meerdere malen tijdens de incubatie worden afgebeeld, waarbij een tijdreeks kan worden opgezet op basis van de onderzoeksdoelstellingen. Hier wordt een laser scanning confocale microscoop gebruikt om de bladeren te bestuderen, de onderzijde van de bladeren te observeren om de fluorescentie van PI in dezelfde bladsamples te detecteren en beelden van de huidmondjes gedurende een bepaalde tijd vast te leggen. Bewaar de beelden om de breedte van de huidmondopening te meten.
Meet de breedte van de stomatale opening van ten minste 60 huidmondjes per behandeling op elk tijdstip. Bereken met de LSM-afbeeldingsbrowser het gemiddelde en de standaardfout voor de breedte van de stomatale opening. De statistische significantie van de resultaten kan worden berekend met behulp van tweezijdige gepaarde t-toetsen van Student.
Hier is een typische microscopische afbeelding van het bladoppervlak van arabidopsis onder een laser-scanning confocale microscoop. In brightfield-weergave kleurt propidiumjodide de celwand van levensvatbare cellen, waardoor de zichtbaarheid van sluitcellen wordt vergroot en de identificatie van onbeschadigde cellen mogelijk wordt. In deze micrografen is een reeks stomatale openingen te zien, van volledig gesloten stoma tot wijd open stoma.
Volledig gesloten huidmondjes worden geïdentificeerd aan de hand van de vorm van de sluitcellen. De openingbreedte wordt beschouwd als 0 µm voor open huidmondjes. De weergegeven openingbreedte is gemeten met een rechte lijn die door het breedste deel van de huidmondjesopening is getrokken.
Dit zijn typische experimentele resultaten van de assay voor inoculatie van levende bladeren. Arabidopsis-bladeren werden in het donker geïncubeerd met drie verschillende stammen van Pseudomonas; alleen de bacterie P-S-T-D-C 3000 was in staat om donker-gesloten huidmondjes te openen, gemeten aan de hand van de openingwijdte van 60 willekeurig geselecteerde huidmondjes per bacteriële stam. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van geplande bacteriële interacties om de mechanismen van de vroege respons op pathogenen in plantensoorten te onderzoeken.
Overzicht
Deze studie presenteert een nieuw protocol voor het beoordelen van stomatale reacties op levende bacteriën met behulp van intacte bladeren, waardoor schade in vergelijking met traditionele methoden tot een minimum wordt beperkt. De techniek maakt real-time observatie mogelijk van de beweging van sluitcellen als reactie op blootstelling aan bacteriën.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Interacties tussen planten en microben
- Stomata-fysiologie
- Fluorescentiemicroscopie
Achtergrond
- Stomata zijn cruciaal voor de gasuitwisseling in planten.
- Sluitcellen reguleren de stomatale opening als reactie op omgevingsstimuli.
- Traditionele methoden beschadigen vaak bladweefsels, wat de resultaten beïnvloedt.
- Deze studie beoogt de beoordeling van stomatale reacties op pathogenen te verbeteren.
Doel van de studie
- Om een reproduceerbare methode te ontwikkelen voor het bestuderen van stomatale responsen op levende bacteriën.
- Om bladbeschadiging tijdens experimenten te minimaliseren.
- Om real-time veranderingen in de stomatale opening te observeren met behulp van fluorescentiemicroscopie.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van bacteriële culturen vanuit glycerolvoorraden.
- Kleuring van bladweefsels met propidiumjodide voor visualisatie.
- Incubatie van bladmonsters met bacteriële suspensies.
- Microscopische beeldvorming om de huidmondopening in de tijd te meten.
Belangrijkste Resultaten
- Veranderingen in de stomatale opening werden waargenomen als reactie op verschillende bacteriële stammen.
- De methode met intacte bladeren maakte nauwkeuriger beoordelingen van het stomatale gedrag mogelijk.
- Statistische analyse bevestigde significante verschillen in openingsbreedtes tussen de behandelingen.
- De techniek faciliteert het onderzoek naar interacties tussen planten en pathogenen.
Conclusies
- Deze methode biedt een betrouwbare aanpak om stomatale reacties op pathogenen te bestuderen.
- Het vergroot het inzicht in plantafweersystemen tegen bacteriële infecties.
- Het protocol kan worden toegepast op diverse plantensoorten voor bredere onderzoeksimplicaties.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Deze methode maakt real-time, niet-destructieve beoordeling van stomatale dynamiek mogelijk in reactie op levende bacteriële stimuli, wat bijdraagt aan mechanische risicoreductie bij studies naar plant-pathogeeninteracties. Door de integriteit van het blad te behouden en natuurlijke infectiecondities na te bootsen, wordt het voorspellend vertrouwen bij vroege targetvalidatie voor de ontwikkeling van agrochemicaliën of biopesticiden vergroot. De aanpak richt zich op een cruciaal ontdekkingspunt: het onderscheid maken tussen directe bacteriële effecten op de fysiologie van de gastheer en secundaire stressreacties.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door veranderingen in de stomatale opening te kwantificeren als een functionele aflezing van bacteriële virulentie of de activering van de afweer van de gastheer.
- Operationele waarde: Maakt biologische risicoreductie mogelijk via reproduceerbare, kwantitatieve metingen van de beweging van sluitcellen onder gecontroleerde co-incubatieomstandigheden.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de triage van portfolio's door bacteriële stammen of verbindingen te identificeren die het stomatale gedrag significant veranderen, wat wijst op potentiële pathogene of immunomodulerende activiteit.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid voor assay: Produceert gevalideerde biologische systemen (intacte bladeren met gekleurde sluitcellen) die geschikt zijn voor downstream screeningscampagnes van verbindingen of stammen.
- Kwantitatieve output: Genereert meetbare, tijdopgeloste gegevens over de stomatiale opening, waardoor dosis-respons- en kinetische analyses mogelijk zijn.
- Schaalbaarheid: Maakt herhaalde beeldvorming van hetzelfde bladmonster over tijd mogelijk, wat de doorvoersnelheid verhoogt en de biologische variabiliteit vermindert.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Modelleert natuurlijke toegangspunten van pathogenen, waardoor een ziekterelevant systeem ontstaat voor het evalueren van interventies die bacteriële invasie blokkeren of de immuniteit van de gastheer moduleren.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen mechanistische inzichten uit de ontdekkingsfase en preklinische validatie door de fysiologische context gedurende de gehele experimentele procedure te behouden.
- Risico-gecorrigeerde beslissingen: Maakt een vroege beoordeling mogelijk van de vraag of een kandidaat-verbinding het door pathogenen geïnduceerde openen van huidmondjes voorkomt, wat bijdraagt aan de go/no-go-criteria.
Integratie van pipeline en workflow
De methode past binnen het vroege stadium van het ontdekkingsproces, ondersteunt hypothesetesten bij targetvalidatie en maakt de ontwikkeling van reproduceerbare assays mogelijk voor screeningscampagnes die gericht zijn op modulatoren van plantimmuniteit of anti-virulentiemiddelen.
- Ontdekkingsbiologie: Faciliteert mechanistische risicoreductie door de stomatale respons te isoleren als afhankelijke variabele in studies naar gastheer-pathogeeninteracties.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve metingen van de stomatale opening die betrouwbare evaluaties van verbindingen ondersteunen onder meerdere condities.
- Analyses: Biedt gegevens over de openingbreedte en statistische output (gemiddelde, standaardfout, t-test significantie) die vergelijkingen tussen condities en de bepaling van de effectgrootte mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Behoudt de levensvatbaarheid van het blad en de natuurlijke oppervlaktetopologie, waardoor wordt gegarandeerd dat observaties fysiologisch relevante sluitcelgezichten weerspiegelen.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Vestigt een herbruikbaar, op beeldvorming gebaseerd platform dat toepasbaar is op diverse bacteriële stammen, plantensoorten of chemische bibliotheken.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door bacteriële blootstelling direct te koppelen aan stomatale dynamiek in intact weefsel.
- Operationele waarde: Garandeert standaardisatie en reproduceerbaarheid door minimale bladbeschadiging en consistente omgevingscontroles.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege, fysiologisch relevante signalen van effectiviteit te verschaffen, waardoor het risico op falen in een late fase wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van kandidaten mogelijk op basis van hun vermogen om stomatale immuunresponsen te moduleren.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de hantering van plantenweefsel, de bereiding van bacteriële culturen en confocale microscopie.
- Afhankelijk van toegang tot laser-scanning confocale microscopie en beeldanalysemiddelen voor stomatale morfometrie.
- Vereist standaardisatie van de incubatieomstandigheden (licht, vochtigheid, temperatuur) om reproduceerbaarheid tussen verschillende runs te waarborgen.
- Aanpassing aan andere plantensoorten kan optimalisatie van de kleuringsduur en de bacteriële concentratie vereisen.
- Praktische beperking: Verlengde imagingsessies kunnen bladstress veroorzaken, waardoor monitoring van de levensvatbaarheid van de monsters in de loop van de tijd noodzakelijk is.
