Het schatten van Virus Productie tarieven in aquatische systemen

Het algemene doel van deze procedure is om de snelheid te bepalen waarmee virussen worden geproduceerd in aquatische microbiële gemeenschappen. Dit wordt bereikt door eerst de abundantie van vrije virussen in het betreffende monster te verminderen, terwijl de inheemse microbiële gemeenschap behouden blijft. De tweede stap van de procedure is het incuberen van monsters onder stimulerende condities en het verzamelen van submonsters elke twee tot drie uur gedurende maximaal 10 uur.

De derde stap van de procedure is het tellen van de virussen binnen de verzamelde submonsters van elk tijdstip. De laatste stap van de procedure is het bepalen van de snelheid waarmee de overvloed aan viruspartikels binnen het monster toenam en het bepalen van de virusproductiesnelheden. Uiteindelijk kunnen er resultaten worden verkregen die op basis van de tellingen de snelheden tonen waarmee virussen binnen de microbiële gemeenschap worden geproduceerd, waardoor onderzoekers de snelheden van microbiële mortaliteit als gevolg van virusactiviteit kunnen afleiden.

Hallo iedereen. Mijn naam is Audrey Madison en ik werk in het laboratorium van Dr. Steven Milham en de afdeling Microbiologie aan de University of Tennessee. Vandaag zullen we, met hulp van Charles Budoff en Claire Campbell, een procedure laten zien voor het analyseren van de snelheden waarmee virussen worden geproduceerd in aquatische systemen.

Om dit te doen, verminderen we het aantal vrije virussen in monsters en tellen we de snelheid waarmee ze opnieuw verschijnen door de lysis van viraal geïnfecteerde micro-organismen. We gebruiken deze procedure momenteel in ons laboratorium om de ecologie van virussen te bestuderen en hoe zij microbiële gemeenschappen kunnen vormgeven. Nu we de introductie hebben gehad, kunnen we beginnen.

Voordat deze procedure kan beginnen, dienen ongeveer 20 liter zeewater zo aseptisch mogelijk te worden verzameld. Zodra het monster is verzameld, wordt het water voorgefilterd door een filter van 0,8 micron met een diameter van 142 millimeter. Voor biologisch productieve systemen kan dit voorafgegaan worden door filtratie via een grotere poriegrootte of een glasvezelfilter.

Om ultragefilterd water te verkrijgen, stelt u een ultrafiltratiesysteem in, zoals het AmCon M 12-systeem met een spiraalgewonden membraancartridge, om alle virussen uit te sluiten. De virussen in het monster worden vervolgens verwijderd en geconcentreerd bij ongeveer 25% van de maximale snelheid met 15 tot 16 kilo pascal tegendruk. Het retentaat, ongeveer 500 milliliter, bevat de nu geconcentreerde viruspopulatie, die bewaard kan worden voor andere studies, terwijl het virusvrije permeaat wordt gebruikt voor virale productienalen.

Reinig het Omicron M 12-systeem na elke dag gebruik om beschadiging van het membraan van de filterpatroon te voorkomen. Bij het werken met zeewater dient het membraan te worden gespoeld met ten minste zes liter Milli Q-water, gevolgd door een wasbeurt met 0,1 molaire natriumhydroxideoplossing gedurende 30 tot 45 minuten. Spoel de patroon vervolgens met nog eens ten minste zes liter Milli Q-water.

Wanneer men klaar is, kan de spiraalcartridge worden bewaard in een 0,05 molaire fosforzuuroplossing bij vier graden Celsius. Om te beginnen met de methode voor virale reductie, worden 500 milliliter zeewatermonster van dezelfde locatie waar we ons virusvrije water hebben verkregen, geplaatst in een steriele filtereenheid met een filter met een lage eiwitbinding en een nominale poriegrootte van 0,2 micro. Verzamel op dit punt ook een submonster om de totale overvloed aan virussen en bacteriën in het startwater te bepalen.

Zet de sample voorzichtig onder vacuümdruk van minder dan 200 millimeter kwik, terwijl de sample continu wordt geresuspendeerd met een steriele transferpipet om te voorkomen dat bacteriële cellen zich op het filter concentreren. Voeg langzaam drie volumes van 500 milliliters ultrafiltraat toe aan de bacteriële suspensie om de hoeveelheid vrije virussen in de sample te verminderen, terwijl de bacteriële populaties op een constante dichtheid worden gehouden. Verdun vervolgens de bacteriële fractie terug naar 500 milliliters met virusvrij ultragefilterd water. Verdeel dit daarna over drie replica's van 150 milliliters en plaats deze replica's in doorzichtige polycarbonaatflessen van 250 milliliters.

Dit vormt uw monsterset voor tijdstip nul. Neem monsters voor schattingen van de bacteriële en virale abundantie uit uw monsters van tijdstip nul. Breng de monsters over in cryovials met een eindconcentratie van 2,0 tot 2,5% steriel glutaaraldehyde.

Bevries deze monsters direct als fixatiestap via flash-freezing met vloeibare stikstof en bewaar ze bij minus 80 degrees Celsius tot aan de verwerking. Alternatief kan een tangential flow-systeem worden gebruikt om de mariene microben te concentreren. Voor de TFF-methode dient ongeveer 500 milliliters van het natuurlijke monster te worden verkregen.

Concentreer dit monster met een tangential flow filtratiesysteem met een nominale poriegrootte van 0,2 micron totdat de bacteriële fractie is gereduceerd tot ongeveer 10 tot 15 milliliters in ultra-gefilterd virusvrij water, zoals beschreven voor de methode voor virusreductie; incubeer de resulterende replicaflessen onder in situ-condities. Met behulp van omgevingskamers op zee gebruiken we stromende zeewaterincubators die zijn aangesloten op een toevoer van oppervlaktewater die de omgevingstemperaturen handhaaft. Lichtniveaus kunnen worden afgestemd op de oppervlaktcondities door gebruik te maken van blauw getint acryl of een neutraal densiteitsfilternet om de lichtintensiteit te verlagen.

Wanneer er gewerkt wordt vanuit een veldstation of laboratorium, of wanneer er geen zeewater beschikbaar is om door te laten stromen, kan een verlichte groeincubator worden gebruikt. Blijf elke 2,5 uur submonsters verzamelen gedurende ten minste 10 uur volgens de methode die is toegepast voor het monster op tijdstip nul. Naast monsters voor microscopie zullen sommige onderzoekers ook water willen verzamelen voor kwantitatieve PCR-analyse van specifieke virussen.

Voeg voor qPCR-monsters vijf milliliter van het monster toe aan een cryovial zonder fixatiemiddel en vries dit onmiddellijk snel in vloeibare stikstof in ter voorbereiding op microscopie van virale productie. Ontdooi bevroren monsters op ijs en bereid verse oplossingen voor zoals beschreven in het geschreven protocol. Plaats vervolgens een filterdisc van 25 millimeter met een poriegrootte van 0,02 micron bovenop een cellulose filter van 0,45 micron. Voeg vervolgens 850 microliters van het gefixeerde monster toe aan de bovenkant van het anadi-filter en vacuümeer bij minder dan 20 kilo Pascal tot het volledig is opgedroogd.

Zodra het Anodisc-filter droog is, pipetteert u 100 µL Cyber Green-werkoplossing in een steriele petrischaal. Verwijder vervolgens, terwijl het vacuüm nog aanstaat, voorzichtig de Anodisc uit de filtertoren en plaats deze op de Cyber Green. Incubeer de monsters 20 minuten in het donker bij kamertemperatuur.

Verwijder voorzichtig het filter uit de cyber green-oplossing en dep de achterkant van het filter met een Kimwipe om alle resterende kleurstof te verwijderen. Voeg vervolgens een kleine druppel Antifa-oplossing toe aan een microscoopglasplaatje en plaats daar een dekglas op. Verwijder het dekglas en breng het gedroogde filter aan op het microscoopglasplaatje.

Voeg opnieuw een kleine hoeveelheid Antifa-oplossing toe aan het dekglas en plaats dit langzaam bovenop het filter, waarbij u er op let dat eventuele luchtbellen die ontstaan worden verwijderd. Tel de virussen met behulp van fluorescentiemicroscopie met een breed blauw filter; tel ten minste 20 gezichtsvelden per filter en kwantificeer de totale hoeveelheid virussen per veldrooster om een gelijkmatige verdeling van de virussen over het filtermembraan te waarborgen. Bereken de gemiddelde percentages van virusrecidive uit de drie onafhankelijke herhalingen en bepaal de standaarddeviatie van de productiesnelheden. Corrigeer tot slot deze snelheden voor de verdunning van micro-organismen van de beginhoeveelheid naar de verdunde hoeveelheid in het virusgereduceerde monster.

De primaire dataset die voortvloeit uit deze studie betreft de recurrentiegraden van de virushoeveelheid in de submonsters van de incubaties. Deze resultaten vormen onafhankelijke regressies van de virushoeveelheid versus de tijd voor elk van de monsters. De productie van virusachtige deeltjes werd gemonitord gedurende een incubatie van 10 uur onder in situ condities met behulp van epifluorescentiemicroscopie.

Deze monsters werden verzameld tijdens een fytoplanktonbloei voor de kust van Nieuw-Zeeland in september 2008. We hebben zojuist laten zien hoe de virusproductiesnelheden kunnen worden geschat. Dit omvat het gebruik van verschillende ultrafiltratiesystemen en het uitvoeren van experimenten om de virusproductiesnelheden te meten.

Daarnaast hebben we u laten zien hoe u deze virussen kunt tellen met behulp van epifluorescentiemicroscopie. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om schoon materiaal te gebruiken, voorzichtig met de gekleurde virussen om te gaan, de lichtblootstelling te beperken, uw monsters snel te verwerken en uw ultrafiltratiecartridges na elk gebruik grondig te reinigen. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.