Name: Specifieke markering van de HIV-1 positieve cellen met behulp van een Rev-afhankelijke lentivirale vector uitdrukken van de Green Fluorescent Protein (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-23T18:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Leer hoe u HIV-positieve cellen detecteert met een Rev-afhankelijke lentivirale vector die GFP tot expressie brengt. Deze methode gebruikt flowcytometrie voor kwantitatieve analyse en biedt therapeutische mogelijkheden voor HIV-behandeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Het werk werd gedeeltelijk ondersteund door GGD verlenen 1R01AI081568 van NIAID tot YW en door de gulle giften van de donoren en de rijders van de 2009 NYCDC AIDS Ride georganiseerd door M. Rosen en Day2 Inc

1. Transfectie van plasmiden voor de productie van de Rev-afhankelijke Lentivirale Particles Set up: The Rev-afhankelijke GFP lentivirale vector, PNL-GFP-RRE-SA, werd eerder 4,5,6 beschreven. Te monteren in een viraal deeltje, werd het plasmide contransfected in HEK293 T-cellen met een HIV-1 verpakking construct, pCMVΔ8.2 (vriendelijk verschaft door Dr Dider Trono), en een plasmide dat het VSV-G-glycoproteïne (pHCMV-G) . De transfectie werd uitgevoerd met behulp van de calciumfosfaat methode. Voorbereiding van de buffers: 10 X HBS (Hepes gebufferde zoutoplossing) werd bereid door het oplossen van 5 g van Hepes, 8 g NaCl, 0,37 g KCl, 1 g dextrose, 0,103 g Na 2 HPO 4 (watervrij) in 100 ml H 2 O. Aliquot the10 X HBS buffer in 1 ml porties en bewaar bij -20 ° C. Op het moment van transfectie, zetten de 10 X HBS tot en met 2 X HBS met H 2 O (1: 5 verdunnen) en pas de pH-waarde tussen 7,05 tot 7,12. (Voor 10 ml 2 X HBS, het vereist meestal ongeveer 50 ul van 1 M NaOH). Filter steriliseren van de 2X HBS buffer door het passeren door een 0,22 uM Millipore filter. CaCl 2 buffer werd gemaakt door het oplossen van CaCl 2 in 10 mM Hepes tot een uiteindelijke concentratie van 2M. Breng de pH op 5,8, filter steriliseren van de buffer en bewaar bij 4 ° C. Procedure: <ol><li> Een dag voorafgaand aan transfectie, zaad 2 x 10 6 HEK293T cellen in een 100 mm Petri-schaal, en cellen 's nachts in 10 ml DMEM + 10% FBS groeien bij 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> De volgende dag, verwijder supernatans van cellen en te vervangen door 5 ml vers DMEM + 10% FBS, continu cultuur cellen gedurende 4 uur. </li><li> In een 5 ml polystyreen reageerbuis, voeg 480 ul 2X HBS buffer. </li><li> In een tweede 5 ml polystyreen reageerbuis, voeg 60 il 2M CaCl 2 buffer, het plasmide DNA, en transfectie TE-buffer (1 mM Tris, 25 mM EDTA, pH 8,0) tot een totaal volume van 480 ul. Voor elke Petri-schaal, moet plasmiden worden toegevoegd in de verhouding van 10 ug van PNL-GFP-RRE-SA, 7,5 ug van pCMVΔR8.3, en 2,5 mg pHCMV-G. </li><li> Voeg de plasmide DNA-CaCl 2 mengsel druppelsgewijs aan de 2 X HBS buis, en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Een fijne neerslag zal vormen. </li><li> Voeg de 960 pi van het mengsel druppelsgewijs door pipet naar de cellen. Incubeer bij 37 ° C, 5% CO 2 's nachts. </li><li> De volgende dag, verwijder het supernatant en voeg 10 ml vers DMEM + 10% FBS, en continu de cellen incuberen bij 37 ° C, 5% CO 2 's nachts. </li><li> Op 48 uur na transfectie, verzamel dan het virus door het verwijderen van het supernatant en de overdracht van het in 50 ml steriele buizen. Voeg verse 10 ml vers DMEM + 10% FBS in elke Petri-schaal en blijven aan de cultuur 's nachts. Bewaar het virus supernatant bij 4 ° C. </li><li> Blijf na 72 uur na transfectie oogst door het verzamelen van de supernatant. Combineren alle supernatants, en centrifugeer de supernatanten op 500 xg gedurende 15 minuten om pellet en verwijder de celresten. </li><li> Het supernatant werden verzameld en gefilterd door een 0,22 uM Millipore filter. Het virus werd verder geconcentreerd door middel van grootte-uitsluiting kolommen. </li></ol> 2. Concentreren virusdeeltjes en bepalen virale titer <ol><li> Virale deeltjes werden geconcentreerd door een grootte-uitsluiting kolom (100.000 MW cut off, Centricoin). Virale supernatant werd geladen in de kolom, en gecentrifugeerd bij 6000 xg bij 4 ° C gedurende 15 minuten. </li><li> Geconcentreerde virale supernatant werd verzameld, gealiquoteerd, en opgeslagen bij -80 ° C. </li><li> De virale titer werd bepaald door infectie van een TNF-behandeld, HIV-1 positieve Jacket cellijn, J1.1 7. Cellen werden gekweekt in een 96 wells plaat op 2,5 x 10 5 cellen per ml (100 ml totaal volume), en geïnfecteerd met 100 ml serieel verdund VNL-GFP-RRE-SA voor een week. De titer (TCID50) van het deeltje werd geschat door het tellen van de GFP positieve putten volgens de methode van Reed en Muench 8. </li></ol> 3. Markering HIV-1 positieve cellen met de Lentivirale Particle, VNL-GFP-RRE-SA Opgericht: een menselijke CD4 T-cellijn, CEM-SS, werd voor het eerst geïnfecteerd met HIV-1. Op 48 uur na infectie werden cellen superinfected met de lentivirale deeltjes, VNL-GFP-RRE-SA. Naar aanleiding van superinfectie nog twee dagen werden GFP-positieve cellen geanalyseerd door middel van flow cytometrie. Als een controle, HIV-1 geïnfecteerde CEM-SS cellen werden op identieke wijze geïnfecteerd met VNL-GFP-RRE-SA. Alleen de HIV-1-geïnfecteerde cellen CEM-SS gaf aanleiding tot GFP positieve cellen, maar niet van de HIV-1 geïnfecteerde CEM-SS cellen. Procedure: <ol><li> Twee uur voor infectie, voeg polybrane tot een eindconcentratie 4 mg / ml. Tellen cellen en duren 2 x 10 5 cellen voor elke infectie. Cellen infecteren met 200 ng (p24) van HIV-1 NL4-3 voor 2 uur. </li><li> Wassen van cellen door centrifugeren op 300 xg gedurende 10 minuten, resuspenderencellen in 2 x 10 5 cellen / ml, en de cultuur bij 37 ° C gedurende 48 uur. </li><li> Tellen cellen en duren 2 x 10 5 cellen per infectie met VNL-GFP-RRE-SA. Voeg 100 ml van de VNL-GFP-RRE-SA en incubeer bij 37 ° C gedurende de nacht. Was de cellen en resuspendeer in 2 x 10 5 cellen / ml. </li><li> Voer flowcytometrie-analyse op 48 uur na superinfectie. Geïnfecteerde cellen werden gepelleteerd en geresuspendeerd in 500 ml 1% paraformaldehede, geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten, en vervolgens geanalyseerd op een FACScan analyser (Becton Dickenson). </li></ol> 4. Representatieve resultaten Als de experimenten met succes uitgevoerd, zal een aanzienlijke GFP bevolking worden gedetecteerd in HIV-1-geïnfecteerde CEM-SS cellen door de flowcytometer, terwijl in de controlegroep, GFP positieve cellen worden niet gedetecteerd in HIV-1 geïnfecteerde CEM-SS cellen. Als de experimenten met succes uitgevoerd, de Rev-afhankelijke lentivirale vector, VNL-GFP-RRE-SA, zal toestaan ​​dat de zeer specifieke detectie van HIV-replicatie in levende cel populaties, door meting van de groene fluorescentie eiwit (GFP) expressie. In dit voorbeeld werden geoogst CEM-SS-cellen gekleurd met een PE-gelabelde rat monoklonaal antilichaam tegen muis CD24, HSA, en vervolgens geanalyseerd op een flowcytometer voor zowel HSA en GFP expressie. <img src="/files/ftp_upload/2198/2198fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Zoals hier getoond, een omvangrijk GFP populatie werd ontdekt in HIV-1-geïnfecteerde cellen superinfected met VNL-GFP-RRE-SA (figuur 1c). Daarentegen werden GFP positieve cellen niet gedetecteerd in een HIV-1 geïnfecteerde CEM-SS cellen zonder lentivirale superinfectie (figuur 1a) of HIV-1 geïnfecteerde cellen met lentivirale superinfectie (Figuur 1b).

<ol><li>Garcia, J. A., Wu, F. K., Mitsuyasu, R., Gaynor, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+cellular+proteins+involved+in+the+transcriptional+regulation+of+the+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Interactions of cellular proteins involved in the transcriptional regulation of the human immunodeficiency virus.</a> EMBO Journal. 6, 3761-3770 (1987).</li>
<li>Merzouki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+gp120%2F160+expressing+cells+upregulate+HIV-1+LTR+directed+gene+expression+in+a+cell+line+transfected+with+HIV-1+LTR-reporter+gene+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Biol+%28Noisy-le-grand%22%5BJournal%5D)">HIV-1 gp120/160 expressing cells upregulate HIV-1 LTR directed gene expression in a cell line transfected with HIV-1 LTR-reporter gene constructs.</a> Cell Mol Biol (Noisy-le-grand. 41, 445-452 (1995).</li>
<li>Aguilar-Cordova, E., Chinen, J., Donehower, L., Lewis, D. E., Belmont, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+reporter+cell+line+for+HIV-1+tat+activity%2C+HIV-1+inhibitors%2C+and+T+cell+activation+effects%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res+Hum+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">A sensitive reporter cell line for HIV-1 tat activity, HIV-1 inhibitors, and T cell activation effects.</a> AIDS Res Hum Retroviruses. 10, 295-301 (1994).</li>
<li>Wu, Y., Beddall, M. H., Marsh, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rev-dependent+lentiviral+expression+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Rev-dependent lentiviral expression vector.</a> Retrovirology. 4, 12-12 (2007).</li>
<li>Wu, Y., Beddall, M. H., Marsh, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rev-dependent+indicator+T+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Current+HIV+Research%22%5BJournal%5D)">Rev-dependent indicator T cell line.</a> Current HIV Research. 5, 395-403 (2007).</li>
<li>Young, J., Tang, Z., Yu, Q., Yu, D., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+killing+of+HIV-1-positive+macrophages+and+T+Cells+by+the+Rev-dependent+lentivirus+carrying+anthrolysin+O+from+Bacillus+anthracis%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Selective killing of HIV-1-positive macrophages and T Cells by the Rev-dependent lentivirus carrying anthrolysin O from Bacillus anthracis.</a> Retrovirology. 5, 36-36 (2008).</li>
<li>Perez, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+HIV-1-infected+T+cell+clone+defective+in+IL-2+production+and+Ca2%2B+mobilization+after+CD3+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">An HIV-1-infected T cell clone defective in IL-2 production and Ca2+ mobilization after CD3 stimulation.</a> Journal of Immunology. 147, 3145-3148 (1991).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hygiene%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).</li>
</ol>

Net als bij de eerder ontwikkelde Tat-afhankelijke expressievectoren, het Rev-systeem hier beschreven is een exploitatie van een geëvolueerde hiv-proces. De opname van Rev-afhankelijkheid maakt de LTR-based expressievector in hoge mate afhankelijk van de aanwezigheid van replicerende HIV. De toepassing van deze vector zoals gerapporteerd hier, een HIV-afhankelijke reporter virus, heeft een nieuwe nieuwe aanpak van HIV-positieve cellen te identificeren. De vector maakt onderzoek van levende cellen, kunt uitdrukken elk gen voor het basis-of klinische experimenten, en als een pseudo-getypte lentivirus heeft toegang tot de meeste celtypen en weefsels.

<table><tbody><tr><td>Biosafety Cabinet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;#x00B0;C 5%CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flowcytometer</td><td></td><td>FACSCalibur</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>Allega&amp;#174;6KR</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;#x00B0;C koelkast</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-20&amp;#x00B0;C vriezer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-80&amp;#x00B0;C vriezer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Celenteller</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>Cellometer&amp;#174; AutoT4</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T cellijn</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CEM-SS cellijn</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jurkat cellijn J1.1</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>21870</td><td></td></tr><tr><td>HI FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10438-018</td><td></td></tr><tr><td>HIV-1&lt;sub&gt;NL4-3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td>bereid door transfectie van HeLa-cellen met gekloond proviraal DNA</td></tr><tr><td>pNL-GFP-RRE</td><td></td><td></td><td>volledige deletie van alle HIV-ORF's van pNL4-3</td></tr><tr><td>pNL-GFP-RRE-SA</td><td></td><td></td><td>Insertie van HIV-1 A5 en D4 in pNL-GFP-RRE</td></tr><tr><td>pCMV&amp;#916;8.2</td><td></td><td></td><td>verstrekt door Dr. Dider Trono</td></tr><tr><td>pHCMV-G</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 x HBS (Hepes-gebufferde zoutoplossing)</td><td>Invitrogen</td><td>11344-041</td><td></td></tr><tr><td>2M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; buffer</td><td>Invitrogen</td><td>S-013-154-10</td><td></td></tr><tr><td>1% paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Bleekmiddel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50ml Falcon-buisjes</td><td>BD Biosciences</td><td>358206</td><td></td></tr><tr><td>5ml buisjes met ronde bodem</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>0,45&amp;mu;M Millipore-filter</td><td>EMD Millipore</td><td>SLHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>0,20&amp;mu;M Millipore-filter</td><td>EMD Millipore</td><td>SLFG85000</td><td></td></tr><tr><td>100mm Petri-schaal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430588</td><td></td></tr><tr><td>Size-exclusion kolom (100.000MW cut-off)</td><td>Sartorius AG</td><td>VS2041</td><td></td></tr><tr><td>2ml vriesbuisje</td><td>Axygen Scientific</td><td>SCT-200</td><td></td></tr><tr><td>96-wells plaat</td><td>BD Biosciences</td><td>353227</td><td></td></tr><tr><td>1,7mL Microcentrifuge-buisje</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT- 175-C</td><td></td></tr></tbody></table>

specifieke markering van de hiv-1 positieve cellen met behulp van een rev-afhankelijke lentivirale vector uitdrukken van de green fluorescent protein

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

De meeste van HIV-responsieve expressie vectoren zijn gebaseerd op de hiv-promotor, de lange terminale herhaling (LTR). Terwijl het reageren op een vroeg stadium van HIV-eiwit, Tat, de LTR ook inspelen op de cellulaire activatie staten en aan de lokale chromatine activiteit waarbij de integratie heeft plaatsgevonden. Dit kan resulteren in een hoge HIV-zelfstandige activiteit, en heeft beperkt het nut van LTR-gebaseerde reporter ter gelegenheid van hiv-positieve cellen 1,2,3. Hier bouwden we een uitdrukking lentivirale vector die, bezit naast de Tat-responsieve LTR, een groot aantal hiv-DNA-sequenties die de Rev-response element en hiv-splicing plaatsen 4,5,6 op te nemen. De vector werd opgenomen in een lentivirale verslaggever virus, waardoor zeer specifieke detectie van HIV-replicatie in levende cel populaties. De activiteit van de vector werd gemeten door expressie van de groene fluorescentie eiwit (GFP). De toepassing van deze vector, zoals gerapporteerd hier biedt een nieuwe alternatieve benadering van de bestaande methoden, zoals in situ PCR of hiv-antigeen kleuring, aan HIV-positieve cellen te identificeren. De vector kan ook uitdrukken therapeutische genen voor basis-of klinische experimenten aan HIV-positieve cellen te richten.

We hebben een lentivirale vector die, bezit naast de Tat-responsieve LTR, de Rev-respons element (RRE) die reporter genexpressie kan reguleren in een HIV-1-Tat en Rev-afhankelijke manier. De vector maakt de specifieke detectie van HIV-replicatie in levende cellen via de expressie van GFP.

Specifieke markering van de HIV-1 positieve cellen met behulp van een Rev-afhankelijke lentivirale vector uitdrukken van de Green Fluorescent Protein

De meeste HIV-responsieve expressievectoren zijn gebaseerd op de HIV-promotor, de long terminal repeat (LTR). Hoewel deze responsief zijn voor een vroeg HIV-eiwit, Tat, ...

Het algemene doel van deze procedure is het identificeren van HIV-positieve cellen met behulp van een HIV-1 rev-afhankelijke lentivirale vector die het groen fluorescerend eiwit draagt. Dit wordt bereikt door eerst de rev-afhankelijke lentivirale deeltjes te produceren via cotransfectie. De tweede stap van de procedure is het infecteren van menselijke CD4 T-cellen met HIV-1.Vervolgens worden de HIV-positieve humane CD4 T-cellen gesuperinfecteerd met de lentivirale deeltjes die het GFP-gen dragen. De laatste stap is het identificeren van HIV-positieve cellen door GFP-positieve cellen te meten via flowcytometrie. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die het percentage GFP-positieve cellen via flowcytometrie aantonen.De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van HIV-infecties, aangezien de rev-afhankelijke vector ook therapeutische genen in HIV-geïnfecteerde cellen kan afleveren en selectief kan tot expressie brengen om de dood van HIV-positieve cellen te induceren. De procedure voor het produceren van rev-afhankelijke lentivirale deeltjes zal worden gedemonstreerd door gi, een assistent-hoogleraar onderzoek vanuit ons laboratorium. HEK 293T-cellen worden getransfecteerd met drie plasmiden: de rev-afhankelijke GFP-lentivirale vector, een HIV-1 verpakkingsconstruct en een plasmide dat het VSVG-glycoproteïne draagt. Zaai één dag vóór de plasmide-transfectie 2 × 10⁶ HEK 293T-cellen in 10 ml medium.In een Petri-schaal van 100 millimeter. Kweek de cellen gedurende de nacht bij 37 °C, 5% CO2. Vervang de volgende dag het supernatant van de cellen door vijf milliliter vers medium.Kweek de cellen vervolgens nog vier uur voort bij 37 °C en 5% koolstofdioxide. Bereid de transfectiereagentia voor voordat de incubatieperiode van vier uur is verstreken. De HEK 293 T-cellen worden getransfecteerd met de drie plasmiden in een verhouding van 10 µg rev-afhankelijke GFP-lentivirale vector, 7,5 µg HIV-1 verpakkingsconstruct en 2,5 µg VSVG-glycoproteïne.Meng eerst de drie plasmide-DNA's voor in de gewenste verhouding. Bereid vervolgens twee polystyreenbuisjes van vijf milliliter voor. Voeg 480 µL van tweevoudige HBS-buffer toe aan het eerste buisje en aan het tweede buisje.Voeg 60 µL van de 2 M calciumchloridebuffer toe aan de plasma-DNA's en de transfectiebuffer tot een totaalvolume van 480 µL. Voeg vervolgens het mengsel van plasma-DNA en calciumchloride druppelgewijs toe aan de buis met 2x HPS en incubeer dit gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.Er zal geleidelijk een fijn neerslag vormen. Voeg nu alle 960 µL van het mengsel druppelgewijs met een pipet toe aan de HEK 2 9 3 T-cellen. Incubeer gedurende de nacht bij 37 °C en 5% CO2.Verwijder de volgende dag het supernatant en voeg 10 milliliter vers medium toe. Incubeer de cellen opnieuw bij 37 °C en 5% koolstofdioxide gedurende de nacht. Oogst het virus 48 uur na transfectie door het supernatant te verwijderen en over te brengen naar een steriele buis van 50 milliliter.Voeg 10 milliliter vers medium toe aan de Petrischaal en zet de cultuur gedurende de nacht voort. Bewaar het virus-supernatant bij vier graden Celsius. Zet de oogst voort op 72 uur na transfectie door het supernatant te verzamelen en dit samen te voegen met het eerder geoogste supernatant.Centrifuge vervolgens het S-supernatans bij 500 ×g gedurende 15 minuten om celdebris te pelletteren en te verwijderen. Verzamel na centrifugatie het S-supernatans en breng dit over in een nieuwe buis. Filtreer het supernatant vervolgens door een 0,22 µm Millipore-filter.Het virus zal verder worden geconcentreerd met behulp van een size-exclusion kolom, wat in de volgende stap wordt gedemonstreerd om viruspartikels te concentreren. Laad het virale supernatant in een size-exclusion kolom en centrifugeer bij 6.000 ×g bij vier °C gedurende 15 minuten. Verzamel het geconcentreerde virale supernatant en zet ongeveer 100 µL apart voor het bepalen van de virale titer.Verdeel de rest in aliquoten en bewaar deze bij -80 °C. Het bepalen van de virale titer is een van de meest kritieke aspecten van deze procedure. Een hogere multipliciteit van infectie is nodig voor een superinfectie van cellen met de GFP VIR-vector.Om het percentage GFP-positieve cellen vast te stellen dat detecteerbaar is via flowcytometrie ter bepaling van de virustiter, wordt een TNF-behandelde HIV V1-positieve Jurkat-cellijn geïnfecteerd met het virale supernatant. Deze HIV V1-positieve cellen worden gekweekt.In een 96-wells plaat bij 2,5 × 10⁵ cellen per milliliter in een totaalvolume van 100 µL. Bereid zes seriële tienvoudige verdunningen van de rev-afhankelijke lentivirale deeltjes voor het infecteren van de HIV-1-positieve cellen; voeg 100 µL van elke seriële virusverdunning toe aan elke well met cellen. Incubeer gedurende zeven dagen in een CO2-incubator bij 37 °C.De titer van het partikel wordt geschat door GFP-positieve cellen waar te nemen onder een fluorescentiemicroscoop. De berekeningen worden uitgevoerd volgens de methode van Reid en MU en de titer wordt bepaald als het verdunningspunt dat kan leiden tot GFP-positieve wells. In 50% van de wells die zijn geïnfecteerd tot markering IV, bevindt zich één positieve cel met de rev-afhankelijke lentivirale partikels.Een humane CD4 T-cellijn zal eerst worden geïnfecteerd met HIV-1. We gebruiken 2 × 10⁵ cellen voor elke infectie. Twee uur vóór de infectie.Voeg poly brain toe aan de cellen tot een eindconcentratie van 4 µg/mL. Incubeer gedurende twee uur bij 37 °C. Infecteer vervolgens de cellen door de HIV-oplossing in een van de 5 mL buizen te pipetteren.De andere twee buisjes cellen worden niet geïnfecteerd en dienen als controles. Incubeer alle cellen gedurende twee uur bij 37 °C. Centrifugeer de cellen na twee uur 10 minuten bij 300 ×g, verwijder het celvrije virus door het supernatant weg te gooien en resuspendeer de cellen in vers medium bij een concentratie van 2 × 10⁵ cellen per milliliter. Cultureer deze bij 37 °C gedurende 48 uur.Na 48 uur zijn de HIV-geïnfecteerde cellen klaar voor infectie. Gebruik bij de rev-afhankelijke lentivirale particles 2 × 10⁵ cellen voor infectie met 100 µL lentivirale particles aan de HIV V1-geïnfecteerde cellen. Als controle worden HIV V1-niet-geïnfecteerde humane CD4 T-cellen eveneens geïnfecteerd met 100 µL lentivirale particles. Incubeer de cellen de volgende dag gedurende de nacht bij 37 °C.Vervang het verbruikte medium door vers medium en resuspendeer de cellen tot een concentratie van 2 × 10⁵ cellen per milliliter. 48 uur na infectie worden de cellen door centrifugatie gepellet en vervolgens geresuspendeerd in 500 µL 1% paraformaldehyde; breng de geresuspendeerde cellen over naar een flowcytometrie-buisje voor flowcytometrische analyse. Na een incubatie van 20 minuten bij kamertemperatuur kunnen de cellen op een FACSScan-analyzer worden geanalyseerd op GFP-positiviteit.Wanneer de experimenten succesvol worden uitgevoerd, maakt de rev-afhankelijke lentivirale vector V-N-L-G-F-P-R-R-E-S-A de zeer specifieke detectie van replicerend HIV in levende celpopulaties mogelijk via de meting van de expressie van het groene fluorescerende eiwit GFP. In dit voorbeeld werden geoogste C-E-M-S-S-cellen gekleurd met een PE-gelabeld rat monochlonaal antilichaam tegen muis CD 24 HSA en vervolgens geanalyseerd op een flowcytometer voor zowel HSA- als GFP-expressie, zoals hier getoond. Er werd een aanzienlijke GFP-populatie gedetecteerd in HIV-1-geïnfecteerde cellen die gesuperinfecteerd waren met V-N-L-G-F-P-R-R-E-S-A.In tegenstelling hiermee werden er geen GFP-positieve cellen gedetecteerd in noch HIV V-1 niet-geïnfecteerde C-E-M-S-S-cellen zonder lentivirale superinfectie, noch in HIV-1 niet-geïnfecteerde cellen met lentivirale superinfectie. Houd er rekening mee dat werken met HIV extreem gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het naleven van biosafety-niveaus en -praktijken, bij het uitvoeren van deze procedure.

specific-marking-hiv-1-positive-cells-using-rev-dependent-lentiviral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Dit gevisualiseerd experiment is een gids voor het gebruik van een fluorescerende moleculaire kloon van HIV voor live confocale imaging experimenten.

Visualiseren Cel-cel Overdracht van hiv met behulp van TL-Klonen van HIV en Live confocale microscopie

Lentivirale expressievectoren zijn het meest effectief voertuigen stabiel tot expressie verschillende effector-moleculen of reporter-constructen in delende en niet-delende zoogdiercellen en hele organismen. Hier bieden we een protocol over hoe lentivector expressie constructen te verpakken in pseudoviral deeltjes en target cellen met behulp van de pseudoviral deeltjes transduceren.

Verpakking HIV-of FIV-based Lentivector expressie constructen en transductie van VSV-G pseudogetypeerde virale deeltjes

Beschrijven we een moleculaire kloon van maedi-visna virus dat GFP tot uitdrukking en is volledig besmettelijk. Replicatie van dit virus kan worden gedetecteerd door gebruik te maken van fluorescentie microscopie en flowcytometrie.

Teeltmateriaal en Detecteren van een besmettelijke moleculaire kloon van Maedi-visna virus dat Green Fluorescent Protein geeft uiting aan

Detectie van virale RNA door fluorescentie<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie (FISH)

In dit protocol beschrijven we de productie, zuivering en titratie van lentivirale vectoren. Wij bieden een voorbeeld van lentivirale vector-gemedieerde gen-levering in de eerste gekweekte neuronen en astrocyten. Onze methoden kunnen ook van toepassing op andere...

De productie van lentivirale vectoren voor transduceren Cellen van het centrale zenuwstelsel

Sinds de ontdekking van het groene fluorescente eiwitgen, hebben fluorescente eiwitten invloed gehad op de moleculaire celbiologie. Dit protocol beschrijft hoe expressie van verschillende fluorescente eiwitten door genetische manipulatie wordt gebruikt voor het barcoden van individuele cellen. De procedure maakt het mogelijk om verschillende populaties in een cellenmengsel te volgen, wat ideaal is voor multiplextoepassingen.

Genetische barcodes met fluorescerende eiwitten voor multiplexverzending Toepassingen

Beschreven is een methode om te kwantificeren van de expressie van genen die 96 en 18 oppervlakte eiwitten door afzonderlijke cellen ex vivo, waardoor voor de identificatie van differentially uitgedrukte genen en proteïnen in virus-geïnfecteerde cellen ten opzichte van niet-geïnfecteerde cellen. Passen we de aanpak van de studie SIV-geïnfecteerde CD4+ T cellen geïsoleerd van rhesus makaken.

Eencellige kwantificatie van mRNA en oppervlak eiwituitdrukking in Simian Immunodeficiëntie Virus-geïnfecteerde CD4+ T cellen geïsoleerd van Rhesus Makaken

We beschrijven een cel-gebaseerde test om te melden aan de HIV-1 fusion via de uitdrukking van groen fluorescent proteïne aantoonbaar door stroom cytometry of fluorescentie microscopie. Het kan worden gebruikt voor het testen van remmers van virale toegang (specifiek aan de fusie stap) in cel-vrij en cel-naar-cel infectie systemen.

Een High-throughput Cre-Lox geactiveerd virale membraan Fusion Assay ter identificatie van de Inhibitors van HIV-1 virale membraan Fusion

Een hoge doorvoersnelheid protocol voor functionele beoordeling van efficiënte reactivering van HIV en de ontmijning van latente proviruses is beschreven en toegepast door het testen van het effect van interventies op HIV transcriptie, egaliseren en lamineren. Representatieve resultaten van het effect van latentie omkering van agenten op LTR-gedreven transcriptie, egaliseren en lamineren zijn verstrekt.

High Throughput In Vitro beoordeling van latentie omkering van agenten op HIV transcriptie, egaliseren en lamineren

Gerichte DNA epigenome bewerken vertegenwoordigt een krachtige therapeutische aanpak. Dit protocol beschrijft de productie, reiniging en concentratie van de alles-in-één lentivirale vectoren herbergen van de CRISPR-dCas9-DNMT3A-transgenic voor bewerken van epigenome's in menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel (hiPSC)-afgeleid van neuronen.

Lentivirale Vector Platform voor de efficiënte levering van Epigenome-bewerkingsgereedschap in mens geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige ziekte modellen

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor een fluorescentiebeeldvormingsbenadering, multiplex immunofluorescent cell-gebaseerde detection van DNA, RNA en protein (MICDDRP), een methode die in staat is tot gelijktijdige fluorescentie eencellige visualisatie van virale eiwitten en nucleïnezuren van verschillende type en gestrandheid. Deze aanpak kan worden toegepast op een breed scala aan systemen.

Eencellige multiplexed fluorescentie beeldvorming om virale nucleïnezuren en eiwitten te visualiseren en HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika-virus en influenza-infectie te controleren

Leer hoe u HIV-positieve cellen detecteert met een Rev-afhankelijke lentivirale vector die GFP tot expressie brengt. Deze methode gebruikt flowcytometrie voor kwantitatieve analyse en biedt therapeutische mogelijkheden voor HIV-behandeling.

Specifieke markering van de HIV-1 positieve cellen met behulp van een Rev-afhankelijke lentivirale vector uitdrukken van de Green Fluorescent Protein (Video) | JoVE Journal

Specifieke markering van de HIV-1 positieve cellen met behulp van een Rev-afhankelijke lentivirale vector uitdrukken van de Green Fluorescent Protein

Meer video's verkennen