Specifieke markering van de HIV-1 positieve cellen met behulp van een Rev-afhankelijke lentivirale vector uitdrukken van de Green Fluorescent Protein

Het algemene doel van deze procedure is het identificeren van HIV-positieve cellen met behulp van een HIV-1 rev-afhankelijke lentivirale vector die het groen fluorescerend eiwit draagt. Dit wordt bereikt door eerst de rev-afhankelijke lentivirale deeltjes te produceren via cotransfectie. De tweede stap van de procedure is het infecteren van menselijke CD4 T-cellen met HIV-1.

Vervolgens worden de HIV-positieve humane CD4 T-cellen gesuperinfecteerd met de lentivirale deeltjes die het GFP-gen dragen. De laatste stap is het identificeren van HIV-positieve cellen door GFP-positieve cellen te meten via flowcytometrie. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die het percentage GFP-positieve cellen via flowcytometrie aantonen.

De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van HIV-infecties, aangezien de rev-afhankelijke vector ook therapeutische genen in HIV-geïnfecteerde cellen kan afleveren en selectief kan tot expressie brengen om de dood van HIV-positieve cellen te induceren. De procedure voor het produceren van rev-afhankelijke lentivirale deeltjes zal worden gedemonstreerd door gi, een assistent-hoogleraar onderzoek vanuit ons laboratorium. HEK 293T-cellen worden getransfecteerd met drie plasmiden: de rev-afhankelijke GFP-lentivirale vector, een HIV-1 verpakkingsconstruct en een plasmide dat het VSVG-glycoproteïne draagt. Zaai één dag vóór de plasmide-transfectie 2 × 10⁶ HEK 293T-cellen in 10 ml medium.

In een Petri-schaal van 100 millimeter. Kweek de cellen gedurende de nacht bij 37 °C, 5% CO2. Vervang de volgende dag het supernatant van de cellen door vijf milliliter vers medium.

Kweek de cellen vervolgens nog vier uur voort bij 37 °C en 5% koolstofdioxide. Bereid de transfectiereagentia voor voordat de incubatieperiode van vier uur is verstreken. De HEK 293 T-cellen worden getransfecteerd met de drie plasmiden in een verhouding van 10 µg rev-afhankelijke GFP-lentivirale vector, 7,5 µg HIV-1 verpakkingsconstruct en 2,5 µg VSVG-glycoproteïne.

Meng eerst de drie plasmide-DNA's voor in de gewenste verhouding. Bereid vervolgens twee polystyreenbuisjes van vijf milliliter voor. Voeg 480 µL van tweevoudige HBS-buffer toe aan het eerste buisje en aan het tweede buisje.

Voeg 60 µL van de 2 M calciumchloridebuffer toe aan de plasma-DNA's en de transfectiebuffer tot een totaalvolume van 480 µL. Voeg vervolgens het mengsel van plasma-DNA en calciumchloride druppelgewijs toe aan de buis met 2x HPS en incubeer dit gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.

Er zal geleidelijk een fijn neerslag vormen. Voeg nu alle 960 µL van het mengsel druppelgewijs met een pipet toe aan de HEK 2 9 3 T-cellen. Incubeer gedurende de nacht bij 37 °C en 5% CO2.

Verwijder de volgende dag het supernatant en voeg 10 milliliter vers medium toe. Incubeer de cellen opnieuw bij 37 °C en 5% koolstofdioxide gedurende de nacht. Oogst het virus 48 uur na transfectie door het supernatant te verwijderen en over te brengen naar een steriele buis van 50 milliliter.

Voeg 10 milliliter vers medium toe aan de Petrischaal en zet de cultuur gedurende de nacht voort. Bewaar het virus-supernatant bij vier graden Celsius. Zet de oogst voort op 72 uur na transfectie door het supernatant te verzamelen en dit samen te voegen met het eerder geoogste supernatant.

Centrifuge vervolgens het S-supernatans bij 500 ×g gedurende 15 minuten om celdebris te pelletteren en te verwijderen. Verzamel na centrifugatie het S-supernatans en breng dit over in een nieuwe buis. Filtreer het supernatant vervolgens door een 0,22 µm Millipore-filter.

Het virus zal verder worden geconcentreerd met behulp van een size-exclusion kolom, wat in de volgende stap wordt gedemonstreerd om viruspartikels te concentreren. Laad het virale supernatant in een size-exclusion kolom en centrifugeer bij 6.000 ×g bij vier °C gedurende 15 minuten. Verzamel het geconcentreerde virale supernatant en zet ongeveer 100 µL apart voor het bepalen van de virale titer.

Verdeel de rest in aliquoten en bewaar deze bij -80 °C. Het bepalen van de virale titer is een van de meest kritieke aspecten van deze procedure. Een hogere multipliciteit van infectie is nodig voor een superinfectie van cellen met de GFP VIR-vector.

Om het percentage GFP-positieve cellen vast te stellen dat detecteerbaar is via flowcytometrie ter bepaling van de virustiter, wordt een TNF-behandelde HIV V1-positieve Jurkat-cellijn geïnfecteerd met het virale supernatant. Deze HIV V1-positieve cellen worden gekweekt.

In een 96-wells plaat bij 2,5 × 10⁵ cellen per milliliter in een totaalvolume van 100 µL. Bereid zes seriële tienvoudige verdunningen van de rev-afhankelijke lentivirale deeltjes voor het infecteren van de HIV-1-positieve cellen; voeg 100 µL van elke seriële virusverdunning toe aan elke well met cellen. Incubeer gedurende zeven dagen in een CO2-incubator bij 37 °C.

De titer van het partikel wordt geschat door GFP-positieve cellen waar te nemen onder een fluorescentiemicroscoop. De berekeningen worden uitgevoerd volgens de methode van Reid en MU en de titer wordt bepaald als het verdunningspunt dat kan leiden tot GFP-positieve wells. In 50% van de wells die zijn geïnfecteerd tot markering IV, bevindt zich één positieve cel met de rev-afhankelijke lentivirale partikels.

Een humane CD4 T-cellijn zal eerst worden geïnfecteerd met HIV-1. We gebruiken 2 × 10⁵ cellen voor elke infectie. Twee uur vóór de infectie.

Voeg poly brain toe aan de cellen tot een eindconcentratie van 4 µg/mL. Incubeer gedurende twee uur bij 37 °C. Infecteer vervolgens de cellen door de HIV-oplossing in een van de 5 mL buizen te pipetteren.

De andere twee buisjes cellen worden niet geïnfecteerd en dienen als controles. Incubeer alle cellen gedurende twee uur bij 37 °C. Centrifugeer de cellen na twee uur 10 minuten bij 300 ×g, verwijder het celvrije virus door het supernatant weg te gooien en resuspendeer de cellen in vers medium bij een concentratie van 2 × 10⁵ cellen per milliliter. Cultureer deze bij 37 °C gedurende 48 uur.

Na 48 uur zijn de HIV-geïnfecteerde cellen klaar voor infectie. Gebruik bij de rev-afhankelijke lentivirale particles 2 × 10⁵ cellen voor infectie met 100 µL lentivirale particles aan de HIV V1-geïnfecteerde cellen. Als controle worden HIV V1-niet-geïnfecteerde humane CD4 T-cellen eveneens geïnfecteerd met 100 µL lentivirale particles. Incubeer de cellen de volgende dag gedurende de nacht bij 37 °C.

Vervang het verbruikte medium door vers medium en resuspendeer de cellen tot een concentratie van 2 × 10⁵ cellen per milliliter. 48 uur na infectie worden de cellen door centrifugatie gepellet en vervolgens geresuspendeerd in 500 µL 1% paraformaldehyde; breng de geresuspendeerde cellen over naar een flowcytometrie-buisje voor flowcytometrische analyse. Na een incubatie van 20 minuten bij kamertemperatuur kunnen de cellen op een FACSScan-analyzer worden geanalyseerd op GFP-positiviteit.

Wanneer de experimenten succesvol worden uitgevoerd, maakt de rev-afhankelijke lentivirale vector V-N-L-G-F-P-R-R-E-S-A de zeer specifieke detectie van replicerend HIV in levende celpopulaties mogelijk via de meting van de expressie van het groene fluorescerende eiwit GFP. In dit voorbeeld werden geoogste C-E-M-S-S-cellen gekleurd met een PE-gelabeld rat monochlonaal antilichaam tegen muis CD 24 HSA en vervolgens geanalyseerd op een flowcytometer voor zowel HSA- als GFP-expressie, zoals hier getoond. Er werd een aanzienlijke GFP-populatie gedetecteerd in HIV-1-geïnfecteerde cellen die gesuperinfecteerd waren met V-N-L-G-F-P-R-R-E-S-A.

In tegenstelling hiermee werden er geen GFP-positieve cellen gedetecteerd in noch HIV V-1 niet-geïnfecteerde C-E-M-S-S-cellen zonder lentivirale superinfectie, noch in HIV-1 niet-geïnfecteerde cellen met lentivirale superinfectie. Houd er rekening mee dat werken met HIV extreem gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het naleven van biosafety-niveaus en -praktijken, bij het uitvoeren van deze procedure.