Name: Bereiding van zeer Gekoppeld Rat Hart Mitochondriën (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-23T17:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: Leer hoe je zeer gekoppelde rattenhartmitochondriën isoleert met differentiële centrifugatie en temperatuurcontrole. Deze methode levert 10-15 mg mitochondriaal eiwit per hart voor bio-energetisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken prof. dr. A. Vinogradov en dr. Vera Grivennikova voor de invoering van de auteurs op het gebied van mitochondriale biologie en tal van nuttige inzichten en adviezen in deze procedure. De auteurs zijn dank verschuldigd aan mevrouw Amanda McKintock van de Queens University media bureau voor de hulp met de video voorbereiding.

Introductie Mitochondriën van de rat hart is een van de meest voorkomende voorbereidingen voor het verleden en de huidige studies van cellulaire metabolisme. Ze kunnen snel en betrouwbaar worden verkregen in grote hoeveelheden uit wild type of knock-out dieren. De algemene procedure bestaat uit weefsel spijsvertering door trypsine, fractionering en differentieel centrifugeren. Er zijn verschillende voorwaarden waaraan moet worden gehouden tijdens de Isolatie van mitochondriën uit verschillende weefsels, waaronder het hart (afb. 1). <ul><li> Het weefsel moet grondig worden gehakt, omdat het rechtstreeks van invloed op de opbrengst van de verkregen mitochondriën. Hartweefsel is het beste te blad voor de mond met kleine gebogen schaar en kan gevolgd worden door gebruik van een slijpmachine Latapie tissue of, indien een weefsel slijpmachine niet beschikbaar is, een knoflook pers met afvoer gaten met een diameter van ongeveer 1,0 mm diameter. </li><li> Het is noodzakelijk om de temperatuur van oplossingen te houden bij elke stap. Daarom is de hele procedure moet worden uitgevoerd in een koude kamer en alle instrumenten en oplossingen moeten worden opgesteld en gekoeld op voorhand. Als de temperatuur niet stabiel verschillende eigenschappen van het preparaat kan worden verloren. Mitochondriale structuur is erg gevoelig voor bevriezing, zodat overfreezing van de ophanging (bijvoorbeeld tijdens het centrifugeren) is niet toegestaan, zeker als studies van actief transport zijn belangrijk. </li><li> Een belangrijke parameter is de tijd-duur van de procedure, de isolatie moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd en de verkregen voorbereiding moet onmiddellijk worden gebruikt. Daarom, chirurgische instrumenten, oplossingen en apparaten moeten worden voorbereid op voorhand. </li></ul> Materialen en instrumenten Instrumenten <ol><li> Rechte operationele schaar, scherpe punt </li><li> Gebogen schaar </li><li> Pincet </li><li> Petrischaal </li><li> Kleine trechter + stuk nylon filter (voorwas) </li><li> 6 bekers 50 ml </li><li> Twee magnetische roerders en twee baden ijs </li><li> Een grote ijsbad </li><li> 2 kleine magneetstaven </li><li> Spatels voor pellet schrapen </li><li> Centrifugebuisjes </li><li> Latapie weefsel drukt u op (kan worden vervangen met knoflook pers) </li><li> Teflon-glas homogenisatoren 20 ml en 1-2ml </li><li> Afval beker </li><li> Eppendorf buisjes voor de laatste mitochondriale schorsing en monsters voor eiwitbepaling </li><li> Ijs baden </li></ol> Oplossingen (berekend per 2 ratten): <ol><li> Wasbuffer: 0,3 M sucrose, 10 mM HEPES (pH = 7,2), 0,2 mM EDTA (1000 ml) </li><li> Isolatie buffer: 0,3 M sucrose, 10 mM HEPES (pH = 7,4), 0,2 mM EDTA, 1 mg / ml BSA (Sigma A6003) (100 ml bereid uit de wasmachine buffer). Bovine serum albumine kan worden vervangen door minder dure vetzuur-vrij analogen. Dezelfde buffer of een isotone variaties kan worden gebruikt als buffer mengen. </li><li> Trypsine (Sigma T8003) oplossing: 2.5mg/ml in 1 mM HCl (0,5 ml) </li><li> Trypsine-remmer van soja bonen (Sigma T9128) 6,5 mg/10 ml Isolatie buffer </li></ol> Protocol De algemene opzet van de procedure wordt getoond op Fig. 1. Hearts moet worden gekoeld en gewassen in Wassen buffer, ventriculaire weefsel weggesneden, gehakt en gehomogeniseerd tijdens de fotolytische de behandeling met trypsine. De suspensie wordt gecentrifugeerd op lage snelheid en de verkregen supernatant wordt opnieuw gecentrifugeerd bij een hogere snelheid te verzamelen mitochondriën. Afhankelijk van de geplande experimenten de resuspenderen buffer kan worden vervangen door een andere isotone oplossing. Dieren werden beëindigd in overeenstemming met het Verenigd Koninkrijk "Dieren (wetenschappelijke procedures) wet." door cervicale dislocatie, gevolgd door onthoofding. Het is noodzakelijk om het hart extract onmiddellijk na onthoofding van het dier, zodat er geen vertraging tussen dier beëindiging en hart extractie. Als parallel isolatie van de lever mitochondriën wordt verwacht dat de ratten 's nachts moet worden gevast voorafgaand aan het experiment. <ol><li> Bereid drie bekerglazen met 40 ml wasbuffer. Koel ze in het ijs-zoutbad voor 3 tot 5 minuten voordat u verder gaat met de volgende stap. Zorg ervoor dat ze niet te overfreeze en direct net na wolken van ijskristallen beginnen te verschijnen te gebruiken. </li><li> Open de thorax van de onthoofde rat en extract het hart. Maak kleine incisies en direct daarna het hart naar de ijskoude oplossing in de eerste beker. Knijp het hart om bloed te verwijderen en zet het in de tweede beker. Herhaal deze handeling voor elk hart. </li><li> Droog de harten op het filtreerpapier. Verwijder alle vet, geronnen bloed, boezems en fasciae en het zwembad van het ventriculaire weefsel. </li><li> Hak de gepoolde weefsel met kleine gebogen schaar op de petrischaal op ijs voor ongeveer 5 minuten tot de grootte van de deeltjes is ongeveer 1-2 mm. </li><li> Doe het gehakt weefsel in het weefsel pers en passerenhet door. Wees ervan bewust dat een aanzienlijke hoeveelheid van het materiaal kan blijven in de pers, zodat al het hartweefsel te halen bij de wanden en de bodem van de pers. </li><li> Overdracht van het materiaal in het bekerglas met 50 ml wasbuffer en roer. Filteren dan de suspensie door middel van een nylon filter. Was het gehakt weefsel op het filter 3 keer met de wasbuffer en gooi het filtraat. </li><li> Breng de gewassen weefsel in 20 ml wasbuffer en plaats deze in het ijsbad op de magneetroerder. Voeg 0,5 ml trypsine-oplossing onder voortdurend roeren en start de timer. Bereid een andere magneetroerder, ijsbad en een tweede 50 ml beker. </li><li> Op de 4 e minuut kort homogeniseren van de schorsing gedeelte met behulp van een klein gedeelte los gemonteerd glas-Teflon homogenisator (10-15ml) met een aantal op en neer slagen om de schorsing te verspreiden. Na homogenisering overdracht van de suspensie in de tweede beker. Herhaal de procedure op de 9 e minuut, zodat u de homogenisering van de schorsing twee keer uit te voeren in totaal. Na 15 min incubatie, voeg 10 ml van het isoleren van buffer met trypsine-remmer en incubeer gedurende 1 minuut. </li><li> Nogmaals filteren de suspensie door een nylon filter en sla het filtraat. Verzamel de fractie deeltjes links op een filter en homogeniseren gedurende 1 minuut in 15-20 ml wasbuffer. </li><li> Combineer de homogenaat met het filtraat en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 600g. </li><li> Voorzichtig filter de resulterende supernatant in een nieuwe centrifugebuis. Voorkom besmetting door de pellet en centrifuge opnieuw gedurende 15 minuten bij 8500g. </li><li> Na de hoge snelheid centrifugeren Verwijder het supernatant en spoel de pellet 2-3 keer met 1 ml van de buffer het teruggooien van het pluizige witte buitenrand laag. Breek de pellet met de spatel, maar vermijd de rode vlek van erytrocyten aan de onderkant. Als de bloedcellen kreeg Loos, verwijder de rode stukjes van de schorsing voor de homogenisering. </li><li> Resuspendeer de pellet met een kleine homogenisator of anders door zachte pipetteren. Verdunnen de suspensie met meer Isolationbuffer en centrifugeer weer gedurende 15 minuten bij 8500g. </li><li> Verwijder het supernatant, resuspendeer de pellet in mengen Buffer (een isotone buffer naar keuze) en centrifugeer opnieuw. </li><li> De resulterende bruine pellet bevat gewassen intact mitochondriën. Resuspendeer de pellet in een zeer kleine hoeveelheid isotone buffer van uw keuze. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2202/2202fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Schema het aantonen van de procedure stap voor stap het isolement van de rat hart mitochondriën. Bovenste gedeelte, Podia 1-9: weefsel verstoring, trypsine behandeling en homogenisering, onderste deel, podia 10-15: differentieel centrifugeren.

<ol><li>Jacobus, W. E., Saks, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creatine+kinase+of+heart+mitochondria%3A+changes+in+its+kinetic+properties+induced+by+coupling+to+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Creatine kinase of heart mitochondria: changes in its kinetic properties induced by coupling to oxidative phosphorylation.</a> Arch. Biochem. Biophys. 219, 167-178 (1982).</li>
<li>Gostimskaya, I. S., Grivennikova, V. G., Zharova, T. V., Bakeeva, L. E., Vinogradov, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+assay+of+the+intramitochondrial+enzymes%3A+use+of+alamethicin+for+permeabilization+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">In situ assay of the intramitochondrial enzymes: use of alamethicin for permeabilization of mitochondria.</a> Anal. Biochem. 313, 46-52 (2003).</li>
</ol>

Gedetailleerde snelle protocol voor isolatie van intact mitochondria met een hoge mate van koppeling wordt beschreven. Verkregen preparaat kan worden gebruikt voor functionele of structurele onderzoek op cellulaire bio-energetica, proteomische studies of analyses van mitochondriaal DNA en vetten. Biofysische studies van het actief transport van ionen en metabole intermediairen kunnen ook worden uitgevoerd. Het is mogelijk om verder te verwerken van de mitochondriale voorbereiding om submitochondrial deeltjes, buitenste membraan of te zuiveren afzonderlijke componenten van oxidatieve fosforylering isoleren. De beschreven werkwijze is een modificatie van het standaard protocol van de isolatie door Jacobus en Saks 1. De verwachte opbrengst van de bereide mitochondriën is ongeveer 10-15 mg van mitochondriaal eiwit per hart en de luchtwegen controle verhouding op malaat / glutamaat van deze bereiding, varieert tussen de 8 en 12 met State IV ademhaling van rond de 0,12 mmol O 2 xmin -1 XMG eiwit 1 bij 23 ° C in het medium, bestaande uit 0,25 M sucrose, 10 mM KCl, 0,2 mM EDTA, 5 mM kaliumfosfaat (pH 8,0) met 150 uM ADP voor initiatie staat III ademhaling (voor de exacte experimentele condities en aanvullingen, zie ref . 2). Speciale aandacht moet worden besteed aan enkele technische details voor de start van de isolatie procedure. Het is cruciaal om schoon polycarbonaat of polypropyleen centrifugebuizen gebruik, dus buizen moeten grondig gewassen worden met een schone borstel en warm water, maar het wasmiddel behandeling moet worden gehandhaafd op het minimum. Ook is het beter om alle nodige glaswerk en instrumenten verzamelen in de koude kamer een dag voor de isolatie. Tijdens de isolatie bij het overbrengen van buffers van kolven tot bekers, moet а speciale aandacht worden besteed aan de druppels ijswater te voorkomen in de oplossingen. Bij het hanteren van weefsels moet worden benadrukt dat het hart-extractie moet worden uitgevoerd zo snel mogelijk, omdat zelfs de korte vertraging tussen de onthoofding van het dier en het afkoelen van het weefsel zou resulteren in gedeeltelijk ontkoppelde mitochondria. Snelle afkoeling en grondig wassen van verwijderd harten is essentieel voor standaard voorbereiding, vrij van hemoglobine en erytrocyten NADase te verkrijgen. Trypsine wordt gebruikt voor het bindweefsel eiwitten degradatie van de gevoeligheid van het weefsel te verhogen tot afschuifkracht tijdens het homogeniseren. Langdurige blootstelling van het weefsel te protease dient te worden vermeden, omdat het resulteert in mitochondria van inferieure kwaliteit. Na de hoge snelheid centrifugations de wanden van de centrifuge buizen moeten worden afgeveegd met tissue papier om alle deposito&#39;s van vet materiaal verzameld op de muren te verwijderen. Voor de uiteindelijke resuspensie is het beter om een ​​laag volume van de laatste buffer te gebruiken om verlies te minimaliseren van mitochondriale functies tijdens opslag (150 tot 200 ul van de buffer per hart). Voor studies van het transport van tweewaardige kationen geen chelaatvormers moet aanwezig zijn in de laatste voorbereiding dus mitochondria moet worden gewassen voor meerdere malen met EGTA-vrij medium en gebruikt binnen de eerste uren na isolatie.

bereiding van zeer gekoppeld rat hart mitochondriën

Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

De functie van mitochondriën in generatie van cellulaire ATP in het proces van oxidatieve fosforylering wordt algemeen erkend. In de afgelopen decennia zijn er aanzienlijke vooruitgang in ons begrip van de functies van de mitochondria andere dan de opwekking van energie. Deze omvatten hun rol in apoptose, als signalering organellen, zoogdieren ontwikkeling en veroudering en hun bijdrage aan de coördinatie tussen de celstofwisseling en celproliferatie. Ons begrip van biologische processen gemoduleerd door mitochondriën is gebaseerd op de robuuste methoden voor isolatie en behandeling van intacte mitochondriën van weefsels van de proefdieren. Mitochondriën van de rat hart is een van de meest voorkomende voorbereidingen voor het verleden en de huidige studies van cellulaire metabolisme inbegrip van studies naar knock-out dieren. Hier beschrijven we een gedetailleerde snelle methode voor isolatie van intact mitochondria met een hoge mate van koppeling. Een dergelijke voorbereiding van de rat hart mitochondriën is een uitstekend object voor functionele en structurele onderzoek naar cellulaire bio-energetica, transport van biomoleculen, proteomische studies en analyses van mitochondriaal DNA, eiwitten en lipiden.

We beschrijven а protocol voor isolatie van pure, sterk gekoppeld rat hart mitochondriën voor functionele of structurele studies van cellulaire bio-energetica, biofysische metingen, proteomics of mitochondriale DNA en lipiden-analyse.

Bereiding van zeer Gekoppeld Rat Hart Mitochondriën

De functie van mitochondriën bij de generatie van cellulair ATP tijdens het proces van oxidatieve fosforylering is algemeen erkend. Gedurende de afgelopen decennia zijn er...

Ik ben Dr. Ska. Vandaag laat ik u zien hoe u mitochondriën uit het rode hart isoleert. De belangrijkste stappen bij het isoleren van mitochondriën uit weefsels zijn eerst het disrupten van weefsel en cellen door middel van mechanische of enzymatische behandeling.Ten tweede volgt differentiële centrifugatie bij een lage snelheid om debris, gebroken cellen en kernen te verwijderen. Ten derde volgt centrifugatie bij een hogere snelheid om mitochondria te verzamelen. De instrumenten en oplossingen werden vooraf voorbereid en bewaard in de koelruimte.Tijdens de isolatie moeten verschillende omstandigheden in acht worden genomen. Ten eerste is een grondige weefseldisruptie van essentieel belang, aangezien dit de opbrengst van mitochondria direct beïnvloedt. Ten tweede moet de temperatuur tijdens alle stappen laag worden gehouden, maar moet men voorzichtig zijn dat oplossingen niet overmatig bevriezen, in het bijzonder tijdens centrifugatie.Ten derde geldt dat hoe sneller u werkt, hoe beter de kwaliteit van de verkregen mitochondriën is. De dieren werden geëuthanaseerd in overeenstemming met de Britse Animal Scientific Procedure Act en alle volgende handelingen werden in de koelruimte uitgevoerd. Bereid drie bekerglazen voor met elk 40 ml wasbuffer.Koel dit drie tot vijf minuten in het ijswaterbad voordat u doorgaat naar de volgende stap. Zorg ervoor dat ze niet te veel bevriezen en gebruik ze onmiddellijk zodra er snel ijskristallen beginnen te verschijnen; open de thorax van de gedecapiteerde red en extraheer het hart. Maak kleine incisies en breng het hart vervolgens onmiddellijk over naar de ijskoude oplossing.Knijp het hart in het eerste bekerglas uit om het bloed te verwijderen en plaats het vervolgens in het tweede bekerglas. Herhaal deze handeling voor elk hart. Snelle koeling en het wassen van de verwijderde harten is essentieel om een gestandaardiseerde preparatie te verkrijgen die vrij is van hemoglobine, erytrocyten en adas.Droog de harten af op het filterpapier. Verwijder snel al het vet, gestold bloed en de slagader. Trek vervolgens het ventriculaire weefsel los.Scheid vervolgens het weefsel met een klein gebogen schaartje in de Petrischaal. Plaats het weefsel vijf minuten lang in de MIT-weefselpers. Zet de pers aan en laat deze doorlopen. Na het persen wordt het materiaal overgebracht naar een bekerglas met 50 ml wasbuffer en geroerd.Filtreer vervolgens de suspensie door een eilandfilter. Was het weefsel op het filter drie keer met de wasbuffer en gooi het filter weg. Overbreng het gewassen weefsel naar 20 mL wasbuffer en plaats het in het ijsbad op de magnetische plaat.Voeg druppels van de oplossing toe onder constant roeren en start de timer bij de vierde minuut van de incubatie. Homogeniseer de suspensie kortstondig, deel voor deel en in kleine hoeveelheden, met gebruik van een kleine, lospassende glazen Teflon-homogenisator. Breng de suspensie na homogenisatie over naar een andere beker op een tweede roerder.Herhaal de procedure in de negende minuut, zodat u de homogenisatie in totaal twee keer uitvoert na de tweede homogenisatie. Voeg in de 15e minuut van de incubatie 10 ml isolatiebuffer toe die trypsineremmer bevat en incubeer nog een minuut. Filtreer de suspensie opnieuw door een nylon filter. Bewaar in dit geval het filtraat, breng het resterende weefsel over naar de homogenisator en homogeniseer dit.Combine het homogenaat gedurende nog één minuut met het filtraat in de centrifugebuis. Zorg dat de buizen gelijkmatig in balans zijn en voer een centrifugatie op lage snelheid uit gedurende 15 minuten. Filtreer de resulterende supernatant bij 600 G voorzichtig in een nieuwe centrifugebuis.Probeer contaminatie door een pellet te voorkomen en centrifugeer opnieuw gedurende 15 minuten bij 8.500 G. Gooi na de high-speed centrifugatie het supernatant weg en spoel de pellet met een buffer, waarbij u probeert de witte, pluizige buitenrandlaag te verwijderen. Voeg een volume isolatiebuffer toe. Kantel de buis van zijde naar zijde en verwijder de rest van de buffer.Breek de pellet open met de ula en probeer de rode plek erythrocyten onderin te vermijden, of resuspendeer de pellet met een kleine homogenisator of alternatief door voorzichtig te pipetteren; verdun de suspensie met meer isolatiebuffer en centrifugeer opnieuw gedurende 15 minuten bij 8.500 G. Verwijder de supernatant. Suspendeer de pellet in Resus-suspensiebuffer en centrifugeer opnieuw bij 8.500 G. De resulterende bruine pellet bevat gewassen, intacte mitochondriën. Resuspendeer de pellet in een zeer klein volume Resus-suspensiebuffer.Hoe kleiner het gebruikte volume, hoe stabieler de preparatie van mitochondriën zal zijn. Meestal is 200 µL van de buffer per hart voldoende. De verwachte opbrengst van geprepareerde mitochondriën is ongeveer 10 tot 15 mg mitochondriaal eiwit per hart.En de respiratoire controle ratio op complex I-substraten van een dergelijke preparatie moet tussen de 8 en 12 liggen. Veel succes met uw preparatie.

preparation-of-highly-coupled-rat-heart-mitochondria

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In dit artikel beschrijven we een typische manier om te isoleren en cultuur volwassen ratten hart myocyten. Collagenase en protease worden gebruikt voor het verteren en te isoleren single myocyten. Myocyten gekweekte volgen van dit protocol voldoen aan de meeste eisen experiment.

Primaire Cultuur van volwassen ratten Heart myocyten

Een spectrofluorimetrische protocol voor het meten van de mitochondriale permeabiliteit transitie porie opening in geïsoleerde muizenhart mitochondria wordt hier gepresenteerd. De bepaling omvat de gelijktijdige meting van Ca...

Multi-parameter meting van de doorlatendheid Transitie Pore Openen in Geïsoleerde Muis Heart Mitochondria

Werkwijze voor snelle isolatie van mitochondria uit zoogdierweefsel biopsies beschreven. Rat lever of skeletspieren voorbereidingen werden gehomogeniseerd met een commerciële weefsel Dissociator en mitochondriën werden door differentiële filtratie geïsoleerd door nylon mesh filters. Mitochondriale isolatie is &lt;30 min ten opzichte van 60-100 min met behulp van alternatieve methoden.

Rapid isolatie en zuivering van Mitochondriën voor transplantatie Door Tissue Dissociatie en differentiële Filtratie

Verscheidene protocollen zijn ontwikkeld en beschreven voor de isolatie van verschillende hartcel typen uit een rat hart. Hier wordt een geoptimaliseerd protocol beschreven dat de isolatie van hoge kwaliteit grote hartcellen (cardiomyocyten, endotheelcellen en fibroblasten) van een enkel preparaat mogelijk maakt, waardoor de experimentele kosten worden verminderd.

Gelijktijdige isolatie van hoogwaardige cardiomyocyten, endothelcellen en fibroblasten uit een volwassen rat hart

Hier presenteren we twee protocollen voor het meten van mitochondriale Ca2 + toestroom in geïsoleerde mitochondriën en gekweekte cellen. Voor geïsoleerde mitochondriën, detailleren wij een plaat lezer gebaseerde Ca2 + import assay met behulp van de Ca2 + gevoelige kleurstof calcium groen-5N. Voor gekweekte cellen beschrijven we een methode van de confocal microscopie met behulp van de Ca2 + kleurstof Rhod-2/AM.

Analyses van mitochondriale Calcium toestroom in geïsoleerde Mitochondria en gekweekte cellen

Hier beschrijven we een geoptimaliseerd, Langendorff gebaseerde procedure voor de isolatie van eencellige atriale cardiomyocytes van een rat model van metabole syndroom-gerelateerde hartfalen met bewaarde ejectie Fractie. Een handmatige regulering van de intraluminale druk van cardiale Holten is geïmplementeerd om de opbrengst van functioneel intact myocytes geschikt voor excitatie-contractie-koppeling studies.

Isolatie van atriale Cardiomyocytes van een Rat Model van metabole syndroom-gerelateerde hartfalen met bewaarde ejectie Fractie

Bereiding van mitochondriën-verrijkte monsters van eerder bevroren gearchiveerde vaste weefsels stelde de onderzoekers in staat om zowel functionele als analytische beoordelingen van mitochondriën uit te voeren in verschillende experimentele modaliteiten. Deze studie toont aan hoe mitochondria-verrijkte preparaten kunnen worden bereid uit bevroren hartweefsel en analytische beoordelingen van mitochondriën kunnen worden uitgevoerd.

Het meten van mitochondriale elektronenoverdrachtscomplexen in eerder bevroren hartweefsel van de nakomelingen van zeug: een model om door inspanning geïnduceerde mitochondriale bio-energetische veranderingen te beoordelen

Hier beschrijven we een gedetailleerde methode voor mitochondriale isolatie van de skeletspieren van muizen en de daaropvolgende analyse van ademhaling door oxygen consumption rate (OCR) met behulp van op microplaten gebaseerde respirometrische assays. Deze pijplijn kan worden toegepast om de effecten van meerdere omgevings- of genetische interventies op het mitochondriale metabolisme te bestuderen.

Isolatie van mitochondriën uit de skeletspieren van muizen voor respirometrische assays

Deze methode maakt gebruik van de bijdrage van de mitochondriale permeabiliteitstransitieporie aan protonlek met lage geleiding om de spanningsdrempel voor porieopening te bepalen bij neonatale fragiele X-syndroommuizen met een verhoogd cardiomyocyt mitochondriaal co-enzym Q-gehalte in vergelijking met wildtypecontrole.

Beoordeling van de open waarschijnlijkheid van de mitochondriale permeabiliteitstransitieporie in de setting van co-enzym Q-overmaat

Bio-energetische en metabolomische studies op mitochondriën hebben hun veelzijdige rol bij veel ziekten aan het licht gebracht, maar de isolatiemethoden voor deze organellen variëren. De hier beschreven methode is in staat om hoogwaardige mitochondriën uit meerdere weefselbronnen te zuiveren. De kwaliteit wordt bepaald door ademhalingscontroleratio's en andere meetwaarden die worden beoordeeld met respirometrie met hoge resolutie.

Robuuste mitochondriale isolatie van knaagdierweefsel 

Leer hoe je zeer gekoppelde rattenhartmitochondriën isoleert met differentiële centrifugatie en temperatuurcontrole. Deze methode levert 10-15 mg mitochondriaal eiwit per hart voor bio-energetisch onderzoek.

Bereiding van zeer Gekoppeld Rat Hart Mitochondriën

Meer video's verkennen