Een cel-cel Macromoleculaire Transport Assay In Planta Door gebruik te maken biolistische Bombardement

Het hoofddoel van het volgende experiment is om de mate van cel-naar-cel transport van een fluorescentie-gelabeld eiwit in de plantepidermis te analyseren. Dit wordt bereikt door DNA-gecoate gouddeeltjes te verkrijgen om het fusie-eiwit van belang transiënt tot expressie te brengen in de plantepidermis. Als tweede stap wordt het DNA in de plantepidermis afgeleverd, wat de expressie en beweging van het geteste fusie-eiwit mogelijk maakt.

Vervolgens wordt het tot expressie gebrachte fusie-eiwit waargenomen onder een confocale microscoop om de expressie en lokalisatie van de fluorescentisch gelabelde testeiwitten te monitoren. Er worden resultaten verkregen die de mate van cel-naar-cel transport van het fluorescentisch gelabelde eiwit aantonen, gebaseerd op de analyse van de distributie van het fluorescentiesignaal via confocale microscopie. Hallo, ik ben Ben Myers uit het laboratorium van KY in de afdeling Biochemie en Celbiologie aan de State University of New York at Stony Brook.

Vandaag laten we u een procedure zien voor het analyseren van de mate van cel-naar-cel beweging van fluorescerend gelabelde eiwitten in de plantepidermis. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om het cel-naar-cel transport van plantvirale bewegingseiwitten in diverse plantachtergronden te bestuderen en om de cel-naar-cel mobiliteit van verschillende typen eiwitten te vergelijken. Laten we beginnen.

Om met dit protocol te beginnen, kweek één arabidopsisplant op Promix BX. Gebruik in een pot van passende grootte een gecontroleerde klimaatkamer met een korte fotoperiode en een relatieve vochtigheid van 40 tot 65%. Voor nicotiana hamana en nicotiana tabakplanten kweek elke plant op Promix BX in een grotere pot. Zorg opnieuw voor een gecontroleerde klimaatkamer met een lange fotoperiode en een relatieve vochtigheid van 40 tot 65%.

Bemest de plant af en toe met commercieel verkrijgbare producten zoals eerder beschreven. Nadat de Opsis-plant zes tot acht weken is gegroeid, selecteert u bladeren voor het experiment die groter zijn dan 15 millimeter bij 35 millimeter, waarbij de lengtemeting de steel omvat. Voor n benanna- en NAC-planten laat u de planten zeven tot 10 weken groeien. Selecteer vervolgens bladeren groter dan 50 millimeter bij 70 millimeter voor end benanna en 100 millimeter bij 125 millimeter voor nac.

In deze gevallen omvatten de lengtemetingen de peole niet. Voordat de BIC-aflevering van DNA-gecoate microdeeltjes kan beginnen, dient de gene gun-cartridge met DNA-gecoate goudmicrodeeltjes te worden voorbereid zoals eerder in detail is beschreven. Verwijder vervolgens de bladeren in hetzelfde ontwikkelingsstadium met een scherp scheermesje en plaats ze onmiddellijk met de AAL-zijde naar boven op een vlak styrofoam oppervlak.

De abaxiale zijde van het blad vormt een beter substraat voor bombardement vanwege de lagere trichoomdichtheid en dunnere cuticula. Kleine bladeren, zoals die van Arabidopsis, kunnen worden geïmmobiliseerd door ze te bedekken met een stukje raamgaas en het gaas met punaise op het styrofoamoppervlak vast te zetten. Houd de bladeren plat om de efficiëntie van de partikelafgifte te verhogen en de schade aan het weefsel tijdens microbombardement te minimaliseren.

Plaats vervolgens de cartridge met DNA-gecoate micropartikels in het pistool. Voor een konijnenoog: voer het schieten uit bij drukken van 140 tot 160 PSI voor micropartikels van 0,6 micron.

Bombardeer het monster met één cartridge per blad om de micropartikels over een oppervlakte van 10 tot 12 millimeter in diameter te verspreiden. Voor end benanna en end baum. Voer het schieten uit bij drukken van 160 tot 180 PSI voor 0,6 micron micropartikels bij grotere end benanna en end tobacco bladeren.

Meerdere bombardementen op hetzelfde blad zijn mogelijk, maar deze moeten worden uitgevoerd op symmetrische posities aan weerszijden van de hoofdnerf om bladoppervlakken in hetzelfde ontwikkelingsstadium te targeten. Het fluorescentiesignaal van de transiënt tot expressie gebrachte gelabelde eiwitten wordt gevisualiseerd met confocale microscopie. Er moet zorg worden besteed aan het vinden van optimale microscopie-instellingen voor de detectie van elk getest eiwit.

Gebruik een 40 x objectief om proteïnen te observeren die een beperkte intracellulaire accumulatie vertonen met zwakke signaalintensiteiten, zoals de plasma-desal lokalisatie van het tobaksmosaicvirus, movement protein of T-M-V-M-P. Dit biedt een hogere resolutie en een verbeterde gevoeligheid. Echter kan een 10 x objectief met een confocale zoomfunctie worden gebruikt voor snellere beeldvorming van proteïnen die een cytoplasmatische distributie vertonen met sterke signaalintensiteiten, zoals vrij geel fluorescent proteïne of YFP. Simplistisch transport wordt afgeleid uit het verschijnen van multicelclusters die het fluorescerende signaal bevatten.

Het aantal van dergelijke clusters en het aantal cellen in elk cluster zijn indicatief voor de mate van cel-naar-cel transport. Om betrouwbare gegevens te verkrijgen, worden ten minste 100 expressieclusters per experimenteel systeem geregistreerd; zorg ervoor dat de experimenten gelijktijdig worden uitgevoerd.

Wanneer vergelijkingen worden gemaakt. Hier werd het eenvoudige transport van fluorescentie-gelabelde eiwitten gedetecteerd. Typische confocale beelden die zijn verkregen na microbombardement van een blad van end hamana met een TMV mp YFP-expressieconstruct worden getoond.

Eenvoudige beweging van TMV MP YFP wordt waargenomen op basis van de verschijning van multi-celcluster van het YFP-signaal. Echter is niet alle transiënt tot expressie gebrachte TMV MP YFP in staat om te bewegen, zoals blijkt uit het signaal in enkelvoudige cellen bij sommige microbombardementen.

Statistisch gezien is TMV MP YFP in minder dan 40% van de getelde signaalclusters niet in staat om tussen cellen te bewegen. In meer dan 60% van de clusters beweegt het eiwit zich echter tussen twee en vijf cellen. Aangezien een verspreiding over twee cellen het meest frequent voorkomt, kunnen eiwitten met een relatief kleine moleculaire grootte zonder inherente bewegingsactiviteit diffunderen via plasma SMA om van cel naar cel te bewegen.

Bijvoorbeeld, vrij YFP of één XYFP verspreidt zich tussen meerdere cellen en in meer dan 30% van de getelde clusters. Omgekeerd komt deze aspecifieke diffusie niet voor bij een translationele YFP-dimeer of twee XYFP, die qua grootte vergelijkbaar is met het TMV MP YFP-fusie-eiwit en volledig celautonoom is. We hebben zojuist aangetoond hoe de beweging van cel naar cel van fluorescentie-gelabelde eiwitten kan worden geanalyseerd met behulp van transiënte expressie via een gene gun-systeem in de plantenepidermis.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat gezonde, robuuste planten moeten worden voorbereid, dat gouddeeltjes van hoge kwaliteit moeten worden gecoat met DNA voor de aflevering van het DNA en dat voldoende expressieclusters moeten worden geanalyseerd om statistisch betrouwbare resultaten te verkrijgen. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.