Name: Een cel-cel Macromoleculaire Transport Assay In Planta Door gebruik te maken biolistische Bombardement (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-27T17:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Leer hoe je cel-cel transport van fluorescerend gelabelde eiwitten analyseert in planta-epidermis met behulp van biolistische bombardement en confocale microscopie. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van eiwitdynamica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ons werk wordt ondersteund door subsidies van NIH / NIGMS, NSF, USDA / NIFA, en BARD naar VC.

Achtergrond Symplastic transport van macromoleculen door de plant intercellulaire verbindingen, de plasmodesmata, is van belang voor veel plant-pathologen en biologen. Bijvoorbeeld, zijn verschillende virale eiwitten waarvan bekend is dat plasmodesmal size exclusion grenzen te reguleren, zodat virale beweging 1-3. Ook zijn sommige endogene proteïnen, waaronder belangrijke ontwikkeling toezichthouders, aangenomen om van cel naar cel, vermoedelijk door plasmodesmata, tot niet-cel-autonoom 4-functie. Dus een betrouwbare methode te identificeren en te visualiseren macromoleculaire vervoer tussen plantencellen is veel vraag naar is. 1) Groei van de doelsoorten behorende planten Voor hoge efficiëntie van de omzetting, moet een gezonde, robuuste planten worden gebruikt. 1. Arabidopsis-planten Grow een Arabidopsis plant op Pro-Mix BX in een pot (10 cm x 10 cm x 10 cm) in een omgeving gecontroleerde kamer met een korte lichtperiode (8 uur van 130 tot 150 μE m -2 s -1 licht bij 23 ° C/16 uur donker bij 20 ° C) en 40-65% relatieve vochtigheid gedurende 6 tot 8 weken 5. Zo nu en dan bemesten ze met de handel verkrijgbare producten zoals beschreven 5. Bladeren met de grootte groter dan 15 mm x 35 mm (de lengte is inclusief steel) zijn geselecteerd voor de experimenten. 2. N. benthamiana en N. tabacum Grow een plant op Pro-Mix BX in een pot (20 cm x 20 cm x 20 cm) in een omgeving gecontroleerde kamer met een lange lichtperiode (16 hr van 130-150 μE m -2 s -1 licht bij 23 ° C / 8 uur donker bij 20 ° C) en 40-65% relatieve vochtigheid voor 7 tot 10 weken. Zo nu en dan bemesten ze met commercieel verkrijgbare producten te beschrijven. Bladeren met groter dan 50 mm x 70 mm voor N. benthamiana, of 100 mm x 125 mm voor N. tabacum (deze lengte metingen omvatten niet de steel) zijn geselecteerd voor de experimenten. 2) Voorbereiding van de Gene Gun inktcartridge met DNA-gecoate Gold micropartikels Het protocol voor deze experimentele stap is in detail beschreven eerder 6. Het is zeer belangrijk om goed gezuiverde plasmide DNA te gebruiken bij hoge concentraties (~ 1 ug / ul) tot het hoogste transformatie efficiëntie te verkrijgen voor het gemak van confocale microscopie analyse tijdens de latere stadia van het experiment. Voor deze test is het belangrijk om na te gaan dat de voorbereide cartridge niet twee of meer aangrenzende cellen simultaneously te transformeren in een hoge frequentie, omdat het aantal cellen te associëren met een fluorescerende signaal cluster wordt gebruikt als een indicator voor de mate van symplastic vervoer (dat wil zeggen , een enkele cel die het signaal geeft aan geen beweging, terwijl een multicel signaal cluster geeft aan beweging). De kwaliteit van de elke cartridge kan worden gecontroleerd door analyse van de expressie van het eiwit 16-20 uur na bombardement. Ons protocol 6 produceert cartridges die multicel uitdrukking clusters opbrengst alleen bij &lt;3% van alle expressie gebeurtenissen in deze periode, dus geschikt voor dit experiment. 3) biolistische Levering van DNA-coating micropartikels <ol><li> Verwijder de bladeren van dezelfde ontwikkelingsfase (dwz met dezelfde grootte en dezelfde leeftijd, zie stap 1) met een scherp scheermesje en direct te plaatsen met de abaxiale zijkanten omhoog op een vlakke ondergrond piepschuim geconfronteerd. De abaxiale kant van het blad staat voor een beter substraat voor bombardement te wijten aan de lagere trichome dichtheid en dunnere cuticula. Arabidopsis bladeren, vanwege hun relatief geringe omvang, moeten worden gedekt met een stuk hor gaas, en het gaas dan beveiligd met pushpins aan het piepschuim oppervlak. Behoud van bladeren vlak verhoogt de efficiëntie van het deeltje levering en minimaliseert de schade aan het weefsel tijdens het microbombardment. </li><li> Plaats de cartridge met DNA-gecoate microdeeltjes (opgesteld in stap 1) in het geweer. Voor Arabidopsis, is het schieten uitgevoerd bij een druk van 80 tot 110 psi voor 1-um microdeeltjes, en 140 tot 160 psi voor 0,6-um microdeeltjes. Voor N. benthamiana en tabak, is het schieten uitgevoerd bij een druk van 100-120 psi voor 1-um microdeeltjes, en 160 tot 180 psi voor de 0,6-um microdeeltjes. Voor Arabidopsis, we meestal gebruik maken van een cartridge per blad, omdat elk blad heeft genoeg oppervlakte slechts voor een schot, die micropartikels verspreidt over een gebied van 10-12 mm in diameter. Bij grotere N. benthamiana en tabaksbladeren, meerdere bombardementen van hetzelfde blad mogelijk zijn, echter, moeten ze worden gedaan bij de symmetrische posities op elke zijde van het midden van de rib aan het blad aan te pakken in dezelfde ontwikkelingsfase (zie Discussie). </li><li> Haal de bladeren van de piepschuim oppervlakte en plaats ze iniet een petrischaal op 3 lagen nat Whatman filter papier, zegel de petrischaal met Parafilm, en incubeer bij kamertemperatuur voor 36 tot 48 uur om de expressie van de geleverde transgenen en de potentiële cel-cel beweging van hun eiwitproducten maken . </li></ol> 4) Beeldvorming van eiwitexpressie De fluorescerende signaal van de tijdelijk uitgedrukt gemerkte eiwitten wordt gevisualiseerd door confocale microscopie. Zorg moet worden genomen om optimale microscopie instellingen te vinden voor de detectie van elke geteste eiwit. Bijvoorbeeld, eiwitten die beperkte intracellulaire accumulatie show met zwak signaal intensiteiten, zoals de plasmodesmal lokalisatie van de tabak mozaïek virus beweging eiwit (TMV MP) 1-3,6, moet worden waargenomen onder een 40X objectief lens, die een hogere resolutie en biedt gevoeligheid, terwijl eiwitten die cytoplasmatische verdeling te tonen met een sterk signaal intensiteiten, zoals gratis YFP, kan worden gevisualiseerd in een 10x objectief met confocale zoom-functie voor snellere beeldvorming (zie figuur 1). Symplastic vervoer is afgeleid uit het verschijnen van multicel clusters die het fluorescerende signaal bevatten. Het aantal van dergelijke clusters en het aantal cellen in elke cluster is een indicatie van de mate van cel-cel transport. Voor het verkrijgen van betrouwbare gegevens, moet ten minste 100 uitdrukking clusters worden opgenomen per elke experimentele systeem. Bijvoorbeeld, moet als de cel-cel beweging van een eiwit wordt vergeleken in twee verschillende genetische achtergronden (bijvoorbeeld wild type en transgene planten), met een totale 200 uitdrukking clusters worden opgenomen. Belangrijk is, experimenten, moeten de resultaten van die moeten worden met elkaar vergeleken, worden gelijktijdig uitgevoerd. 5. Representatieve resultaten De figuur hieronder illustreert representatieve experimenten voor het opsporen van symplastic transport van fluorescent gelabelde eiwitten. Panelen A en B tonen de typische confocale beelden die zijn verkregen na microbombardment van een N. benthamiana blad met een TMV MP-YFP tot expressie te construeren. In paneel A, symplastic beweging van TMV MP-YFP wordt waargenomen gebaseerd op de verschijning van multicel clusters van de YFP signaal. Niet alle tijdelijk uitgedrukt TMV MP-YFP is in staat zich te bewegen zoals blijkt uit de single-cell-signaal in sommige microbombardments (paneel B). Statistisch gezien bij &lt;40% van de getelde signaal clusters, TMV MP-YFP niet in staat is om te bewegen tussen de cellen, terwijl bij&gt; 60% van de clusters, het eiwit beweegt zich tussen 2-5 cellen, met de twee-cel zich als de meest voorkomende (ca. ~ 50% van de gevallen) (figuur 1C). De eiwitten met relatief kleine moleculaire grootte, zonder aangeboren beweging activiteit kan diffunderen door PD tot cel-cel te verplaatsen. Bijvoorbeeld gratis YFP of 1xYFP (ca. 27 kDa, paneel D), spreads tussen verschillende cellen in 30% van de getelde clusters (panelen C). Deze niet-specifieke diffusie treedt niet op bij een translationeel YFP dimmer, of 2xYFP (54 kDa, paneel E), die in omvang vergelijkbaar is met TMV MP-YFP fusie-eiwit (57 kDa), en die volledig is cel-autonoom (Figuur 1C). <img src="/files/ftp_upload/2208/2208fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Typische resultaten van de symplastic transport test in N. benthamiana blad weefsels. (A, B) Visualisatie van TMV MP-YFP. (C) Kwantificering van het signaal clusters. 1xYFP en 2xYFP, gratis YFP en translationeel YFP dimeer, respectievelijk. (D) Visualisatie van 1xYFP. (E) Visualisatie van 2xYFP. In microfoto, het linker panelen tonen de YFP-signaal en de juiste panelen tonen samengevoegd beelden van YFP (in groen) en chloroplast autofluorescentie (in wit) signalen. Afbeeldingen zijn enkele confocale secties. Sterretjes in de microfoto tonen de epidermale cellen zien YFP signaal. Bars = 50 pm.

<ol><li>Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ins+and+outs+of+non-destructive+cell-to-cell+and+systemic+movement+of+plant+viruses.+%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">The ins and outs of non-destructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. </a> Crit Rev Plant Sci. 23, 195-250 (2004).</li>
<li>Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+viral+movement+proteins%3A+agents+for+cell-to-cell+trafficking+of+viral+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Plant viral movement proteins: agents for cell-to-cell trafficking of viral genomes.</a> Virology. 344, 169-184 (2006).</li>
<li>Epel, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+viruses+spread+by+diffusion+on+ER-associated+movement-protein-rafts+through+plasmodesmata+gated+by+viral+induced+host+beta-1%2C3-glucanases%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Plant viruses spread by diffusion on ER-associated movement-protein-rafts through plasmodesmata gated by viral induced host beta-1,3-glucanases.</a> Semin Cell Dev Biol. 20, 1074-1081 (2009).</li>
<li>Zambryski, P. C., Crawford, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata%3A+gatekeepers+for+cell-to-cell+transport+of+developmental+signals+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata: gatekeepers for cell-to-cell transport of developmental signals in plants.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 16, 393-421 (2000).</li>
<li>Rivero-Lepinckas, L., Crist, D., Scholl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+plants+and+presercation+of+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Growth of plants and presercation of seeds.</a> Methods Mol Biol. 323, 3-12 (2006).</li>
<li>Ueki, S., Lacroix, B., Krichevsky, A., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+transient+genetic+transformation+of+Arabidopsis+leaves+by+biolistic+bombardment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Functional transient genetic transformation of Arabidopsis leaves by biolistic bombardment.</a> Nat Protoc. 4, 71-77 (2009).</li>
<li>Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple%2C+but+not+branched%2C+plasmodesmata+allow+the+nonspecific+trafficking+of+proteins+in+developing+tobacco+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Simple, but not branched, plasmodesmata allow the nonspecific trafficking of proteins in developing tobacco leaves.</a> Cell. 97, 743-754 (1999).</li>
<li>Imlau, A., Truernit, E., Sauer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+and+long-distance+trafficking+of+the+green+fluorescent+protein+in+the+phloem+and+symplastic+unloading+of+the+protein+into+sink+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell and long-distance trafficking of the green fluorescent protein in the phloem and symplastic unloading of the protein into sink tissues.</a> Plant Cell. 11, 309-322 (1999).</li>
<li>Gisel, A., Barella, S., Hempel, F. D., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+spatial+regulation+of+symplastic+trafficking+during+development+in+Arabidopsis+thaliana+apices%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Temporal and spatial regulation of symplastic trafficking during development in Arabidopsis thaliana apices.</a> Development. 126, 1879-1889 (1999).</li>
<li>Kim, I., Cho, E., Crawford, K. M., Hempel, F. D., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+movement+of+GFP+during+embryogenesis+and+early+seedling+development+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell movement of GFP during embryogenesis and early seedling development in Arabidopsis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 102, 2227-2231 (2005).</li>
<li>Crawford, K. M., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-targeted+and+targeted+protein+movement+through+plasmodesmata+in+leaves+in+different+developmental+and+physiological+states%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Non-targeted and targeted protein movement through plasmodesmata in leaves in different developmental and physiological states.</a> Plant Physiol. 125, 1802-1812 (2001).</li>
<li>Roberts, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phloem+unloading+in+sink+leaves+of+Nicotiana+benthamiana%3A+comparison+of+a+fluorescent+solute+with+a+fluorescent+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Phloem unloading in sink leaves of Nicotiana benthamiana: comparison of a fluorescent solute with a fluorescent virus.</a> Plant Cell. 9, 1381-1396 (1997).</li>
<li>Guenoune-Gelbart, D., Elbaum, M., Sagi, G., Levy, A., Epel, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+mosaic+virus+%28TMV%29+replicase+and+movement+protein+function+synergistically+in+facilitating+TMV+spread+by+lateral+diffusion+in+the+plasmodesmal+desmotubule+of+Nicotiana+benthamiana%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Tobacco mosaic virus (TMV) replicase and movement protein function synergistically in facilitating TMV spread by lateral diffusion in the plasmodesmal desmotubule of Nicotiana benthamiana.</a> Mol Plant Microbe Interact. 21, 335-345 (2008).</li>
</ol>

De sleutel voor het succes van de symplastic transport-test is het verkrijgen van een hoge efficiëntie van de omzetting, die de productie van statistisch significante en gemakkelijk waarneembaar signaal clusters mogelijk maakt. Dit kan worden bereikt met behulp van de bladeren geoogst van gezonde, robuuste planten, en het voorbereiden van gouddeeltjes bekleed met een zuivere en geconcentreerde DNA voorbereiding. Met behulp van de bladeren in dezelfde groeifase is ook van vitaal belang voor d...

<table><tbody><tr><td>Goudmicrodeeltjes, 1,0 &amp;mu;m in diameter</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2262</td><td></td></tr><tr><td>Goudmicrodeeltjes, 0,6 &amp;mu;m in diameter</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2263</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0266-1G</td><td></td></tr><tr><td>Tefzel-slangen</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2441</td><td></td></tr><tr><td>Helios cartridge-voorbereidingsstation</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2420</td><td></td></tr><tr><td>Slangen-snijder</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2422</td><td></td></tr><tr><td>Helios gene gun</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2432</td><td></td></tr><tr><td>Heliumgasregelaar</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2413</td><td></td></tr></tbody></table>

een cel-cel macromoleculaire transport assay in planta door gebruik te maken biolistische bombardement

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

Hier presenteren wij een eenvoudige en snelle protocol op te sporen en te beoordelen van de mate van cel-cel macromoleculaire transport in planta. In dit protocol is een fluorescent gelabeld eiwit van belang tijdelijk, uitgedrukt in plantenweefsel na biolistische levering van haar coderend DNA te construeren. De intra-en intercellulaire verdeling van de gelabelde eiwit wordt vervolgens geanalyseerd door confocale microscopie. We beschrijven deze technologie in detail, het verstrekken van stap-voor-stap protocollen test en evaluatie van de mate van symplastic eiwit transport in drie plantensoorten, Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana en N. tabacum (tabak).

Macromoleculaire de handel tussen de plantencellen kan worden beoordeeld door kortstondig te drukken een fluorescent-gelabeld eiwit van belang en de analyse van de intra-en intercellulaire distributie door confocale microscopie.

Een cel-cel Macromoleculaire Transport Assay In Planta Door gebruik te maken biolistische Bombardement

Hier presenteren wij een eenvoudig en snel protocol om het cel-naar-cel macromoleculair transport in planta te detecteren en de omvang ervan te beoordelen. In dit protocol wordt een ...

Het hoofddoel van het volgende experiment is om de mate van cel-naar-cel transport van een fluorescentie-gelabeld eiwit in de plantepidermis te analyseren. Dit wordt bereikt door DNA-gecoate gouddeeltjes te verkrijgen om het fusie-eiwit van belang transiënt tot expressie te brengen in de plantepidermis. Als tweede stap wordt het DNA in de plantepidermis afgeleverd, wat de expressie en beweging van het geteste fusie-eiwit mogelijk maakt.Vervolgens wordt het tot expressie gebrachte fusie-eiwit waargenomen onder een confocale microscoop om de expressie en lokalisatie van de fluorescentisch gelabelde testeiwitten te monitoren. Er worden resultaten verkregen die de mate van cel-naar-cel transport van het fluorescentisch gelabelde eiwit aantonen, gebaseerd op de analyse van de distributie van het fluorescentiesignaal via confocale microscopie. Hallo, ik ben Ben Myers uit het laboratorium van KY in de afdeling Biochemie en Celbiologie aan de State University of New York at Stony Brook.Vandaag laten we u een procedure zien voor het analyseren van de mate van cel-naar-cel beweging van fluorescerend gelabelde eiwitten in de plantepidermis. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om het cel-naar-cel transport van plantvirale bewegingseiwitten in diverse plantachtergronden te bestuderen en om de cel-naar-cel mobiliteit van verschillende typen eiwitten te vergelijken. Laten we beginnen.Om met dit protocol te beginnen, kweek één arabidopsisplant op Promix BX. Gebruik in een pot van passende grootte een gecontroleerde klimaatkamer met een korte fotoperiode en een relatieve vochtigheid van 40 tot 65%. Voor nicotiana hamana en nicotiana tabakplanten kweek elke plant op Promix BX in een grotere pot. Zorg opnieuw voor een gecontroleerde klimaatkamer met een lange fotoperiode en een relatieve vochtigheid van 40 tot 65%.Bemest de plant af en toe met commercieel verkrijgbare producten zoals eerder beschreven. Nadat de Opsis-plant zes tot acht weken is gegroeid, selecteert u bladeren voor het experiment die groter zijn dan 15 millimeter bij 35 millimeter, waarbij de lengtemeting de steel omvat. Voor n benanna- en NAC-planten laat u de planten zeven tot 10 weken groeien. Selecteer vervolgens bladeren groter dan 50 millimeter bij 70 millimeter voor end benanna en 100 millimeter bij 125 millimeter voor nac.In deze gevallen omvatten de lengtemetingen de peole niet. Voordat de BIC-aflevering van DNA-gecoate microdeeltjes kan beginnen, dient de gene gun-cartridge met DNA-gecoate goudmicrodeeltjes te worden voorbereid zoals eerder in detail is beschreven. Verwijder vervolgens de bladeren in hetzelfde ontwikkelingsstadium met een scherp scheermesje en plaats ze onmiddellijk met de AAL-zijde naar boven op een vlak styrofoam oppervlak.De abaxiale zijde van het blad vormt een beter substraat voor bombardement vanwege de lagere trichoomdichtheid en dunnere cuticula. Kleine bladeren, zoals die van Arabidopsis, kunnen worden geïmmobiliseerd door ze te bedekken met een stukje raamgaas en het gaas met punaise op het styrofoamoppervlak vast te zetten. Houd de bladeren plat om de efficiëntie van de partikelafgifte te verhogen en de schade aan het weefsel tijdens microbombardement te minimaliseren.Plaats vervolgens de cartridge met DNA-gecoate micropartikels in het pistool. Voor een konijnenoog: voer het schieten uit bij drukken van 140 tot 160 PSI voor micropartikels van 0,6 micron.Bombardeer het monster met één cartridge per blad om de micropartikels over een oppervlakte van 10 tot 12 millimeter in diameter te verspreiden. Voor end benanna en end baum. Voer het schieten uit bij drukken van 160 tot 180 PSI voor 0,6 micron micropartikels bij grotere end benanna en end tobacco bladeren.Meerdere bombardementen op hetzelfde blad zijn mogelijk, maar deze moeten worden uitgevoerd op symmetrische posities aan weerszijden van de hoofdnerf om bladoppervlakken in hetzelfde ontwikkelingsstadium te targeten. Het fluorescentiesignaal van de transiënt tot expressie gebrachte gelabelde eiwitten wordt gevisualiseerd met confocale microscopie. Er moet zorg worden besteed aan het vinden van optimale microscopie-instellingen voor de detectie van elk getest eiwit.Gebruik een 40 x objectief om proteïnen te observeren die een beperkte intracellulaire accumulatie vertonen met zwakke signaalintensiteiten, zoals de plasma-desal lokalisatie van het tobaksmosaicvirus, movement protein of T-M-V-M-P. Dit biedt een hogere resolutie en een verbeterde gevoeligheid. Echter kan een 10 x objectief met een confocale zoomfunctie worden gebruikt voor snellere beeldvorming van proteïnen die een cytoplasmatische distributie vertonen met sterke signaalintensiteiten, zoals vrij geel fluorescent proteïne of YFP. Simplistisch transport wordt afgeleid uit het verschijnen van multicelclusters die het fluorescerende signaal bevatten.Het aantal van dergelijke clusters en het aantal cellen in elk cluster zijn indicatief voor de mate van cel-naar-cel transport. Om betrouwbare gegevens te verkrijgen, worden ten minste 100 expressieclusters per experimenteel systeem geregistreerd; zorg ervoor dat de experimenten gelijktijdig worden uitgevoerd.Wanneer vergelijkingen worden gemaakt. Hier werd het eenvoudige transport van fluorescentie-gelabelde eiwitten gedetecteerd. Typische confocale beelden die zijn verkregen na microbombardement van een blad van end hamana met een TMV mp YFP-expressieconstruct worden getoond.Eenvoudige beweging van TMV MP YFP wordt waargenomen op basis van de verschijning van multi-celcluster van het YFP-signaal. Echter is niet alle transiënt tot expressie gebrachte TMV MP YFP in staat om te bewegen, zoals blijkt uit het signaal in enkelvoudige cellen bij sommige microbombardementen.Statistisch gezien is TMV MP YFP in minder dan 40% van de getelde signaalclusters niet in staat om tussen cellen te bewegen. In meer dan 60% van de clusters beweegt het eiwit zich echter tussen twee en vijf cellen. Aangezien een verspreiding over twee cellen het meest frequent voorkomt, kunnen eiwitten met een relatief kleine moleculaire grootte zonder inherente bewegingsactiviteit diffunderen via plasma SMA om van cel naar cel te bewegen.Bijvoorbeeld, vrij YFP of één XYFP verspreidt zich tussen meerdere cellen en in meer dan 30% van de getelde clusters. Omgekeerd komt deze aspecifieke diffusie niet voor bij een translationele YFP-dimeer of twee XYFP, die qua grootte vergelijkbaar is met het TMV MP YFP-fusie-eiwit en volledig celautonoom is. We hebben zojuist aangetoond hoe de beweging van cel naar cel van fluorescentie-gelabelde eiwitten kan worden geanalyseerd met behulp van transiënte expressie via een gene gun-systeem in de plantenepidermis.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat gezonde, robuuste planten moeten worden voorbereid, dat gouddeeltjes van hoge kwaliteit moeten worden gecoat met DNA voor de aflevering van het DNA en dat voldoende expressieclusters moeten worden geanalyseerd om statistisch betrouwbare resultaten te verkrijgen. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

a-cell-to-cell-macromolecular-transport-assay-planta-utilizing

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We hebben een techniek ontwikkeld om eiwit-eiwit interacties in planten te testen. Een geel fluorescerend eiwit (YFP) wordt opgesplitst in twee niet-overlappende fragmenten. Elk fragment is gekloond in-frame aan een gen van belang via de Gateway-systeem, waardoor de expressie van fusie-eiwitten. Reconstitutie van YFP-signaal treedt alleen op wanneer de lijkschouwing eiwitten met elkaar omgaan.

Detectie van eiwit interacties in Plant met behulp van een Gateway-compatibele Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC) Systeem

We beschrijven een werkwijze voor het volgen van de endomembraan scheuren opgewekt door de intracellulaire...

Single Cell Metingen van vacuole Rupture Veroorzaakt door intracellulaire pathogenen

Gerichte afbraak van eiwitten is een belangrijke regulerende mechanisme voor de celfunctie. Het komt via een geconserveerde ubiquitineproteasoomroute, die polyubiquitine ketens hecht aan het doeleiwit dat dan als moleculaire "labels" voor het 26S proteasoom. We beschrijven hier een eenvoudige en betrouwbare celvrije assay voor proteasomale afbraak van eiwitten.

Het testen van proteasomale Afbraak in een Celvrije System in Plants

Vorming van eiwitcomplexen in vivo kan worden gevisualiseerd door bimoleculaire fluorescentie complementatie. Interactie partners gefuseerd aan complementaire delen van fluorescente labels en tijdelijk tot expressie gebracht in tabaksbladeren, waardoor een opnieuw fluorescentiesignaal op nabijheid van de twee eiwitten.

Eiwit-eiwit interacties gevisualiseerd door Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie in Protoplasten en Bladeren Tabak

Kwantificering van ziekteverwekkergroei is een krachtig hulpmiddel om verschillende Arabidopsis thaliana (hierna: Arabidopsis) immuunresponsen te karakteriseren. De hier beschreven methode presenteert een geoptimaliseerde spuitinfiltratie-assay om de groei van Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 in volwassen Arabidopsis-bladeren te kwantificeren.

Bacteriële Leaf Infiltratie Assay voor Beeldende karakterisatie van Plant Defense Reacties met behulp van de<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Pathosystem

Op subcellulair niveau worden signaleringsgebeurtenissen dynamisch gemoduleerd door ontwikkelings- en omgevingssignalen. Hier beschrijven we een protocol dat het tabaks-transiente expressiesysteem gebruikt om dynamische eiwit-eiwitinteracties te monitoren en om de ruimtelijke organisatie van signaaltransductie in plantencellen bekend te maken.

Beeldvorming Ruimtelijke Reorganisatie van een MAPK signaalroute Met behulp van de Tabak Transient Expression System

Bestaande methoden voor het modificeren van planten hebben een beperkte toepasbaarheid. De nieuwe peptide-afgeleide technologie die hier wordt voorgesteld, belooft zowel eenvoud als efficiëntie in de introductie van exogeen eiwit of genen in de gewenste intracellulaire compartimenten van intacte planten.

-Peptide afgeleide methode om genen en eiwitten Across Cellulaire en organellen Barriers in Planten Transport

Plant intercellulaire verbindingen, de plasmodesmata (Pd), spelen een centrale rol in plant fysiologie en plant-virus interacties. Kritische Pd vervoer zijn signalen dat rechtstreekse eiwitten aan Pd sorteren. Onze kennis over deze sequenties is echter nog in de kinderschoenen. Beschrijven we een strategie om te identificeren Pd lokalisatie signalen in Pd-gerichte eiwitten.

Identificatie van Plasmodesmal lokalisatie sequenties in eiwitten In Planta

Een verbeterde protocol wordt gepresenteerd voor de meting van voorbijgaande genexpressie van verslaggever constructies in gerst aleurone cellen na deeltje bombardement. De combinatie van geautomatiseerde graan malen met 96-wells-plaat enzym testen biedt hoge doorvoer voor de procedure.

Meten van de genexpressie in gebombardeerd gerst Aleurone lagen met grotere gegevensdoorvoer

We hebben een nieuwe methode voor het uitdrukken van mede meerdere chimeer fluorescerende fusie-eiwitten in planten te overwinnen van de moeilijkheden van conventionele methoden ontwikkeld. Duurt het voordeel van het gebruik van een enkele uitdrukking plasmide waarin meerdere functioneel onafhankelijk eiwit uiting van cassettes om eiwituitdrukking mede.

Co expressie van meerdere chimeer fluorescerende Fusion eiwitten op een efficiënte manier in planten

Dit protocol beschrijft een high-throughput benadering voor het evalueren van plantionenlekkage, peroxidaseactiviteit en calloseproductie in hetzelfde monster.

Evaluatie van bladreacties op microbiële secundaire metabolieten met behulp van een high-throughput formaat

Leer hoe je cel-cel transport van fluorescerend gelabelde eiwitten analyseert in planta-epidermis met behulp van biolistische bombardement en confocale microscopie. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van eiwitdynamica.

Een cel-cel Macromoleculaire Transport Assay In Planta Door gebruik te maken biolistische Bombardement

Meer video's verkennen