Name: Isolatie van het netvlies stamcellen van de muis Eye (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-11T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Leer de isolatie van netvliesstamcellen uit het ciliaire epitheel van het muizenoog. Deze methode omvat dissectie, enzymatische behandeling en kweek van clonale retinale sferen voor onderzoek naar stamcelbiologie en regeneratieve geneeskunde.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Laura Clarke voor haar onschatbare hulp. Dit werk wordt ondersteund door NCE: Stem Cell Network, CIHR en NIH.

1. Bereid de ontleden Solutions en Enzyme-oplossingen <ol><li> Maak de Kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) en de serum-vrij Media van tevoren in de koelkast. </li><li> Weeg de Kynurenic Acid (0,2 mg / ml) en los op in 10 ml Hilo ACSF in een 37 ° C waterbad van tevoren omdat het niet goed oplosbaar. </li><li> Weeg de trypsine (1,33 mg / ml) en hyaluronidase (0,67 mg / ml) en doe dit in een 15 ml tube en houd het bij -20 ° C totdat het nodig is. Voeg de Kynurenic Acid oplossing voor deze buis en filter met behulp van een 22 um spuitfilter vlak voor gebruik. </li><li> Weeg trypsine-remmer (Ovamucoid: 1 mg / ml) en lossen in warm serumvrij Media en filter met behulp van 22μm spuitfilter. </li><li> Maak de plating media: Serum-vrije media die FGF2 (10 ng / ml) en Heparine (2 ug / mL). </li></ol> 2. Het isoleren van stamcellen uit het netvlies van de muis Eye <ol><li> Isolatie van de retinale stamcellen is uitgevoerd in een specifieke steriele zaal gewijd aan de primaire cultuur experimenten. Voorafgaand aan deze procedure start, het opzetten van de dissectiemicroscoop en koud-lichtbron, en dan lay-out van de steriele ontleden instrumenten. Elke kap heeft een warme kraal sterilisator voor het steriliseren van de instrumenten die tussen de stappen. </li><li> We zullen isoleren van stamcellen uit het netvlies ogen die zijn direct geplaatst in een steriele petrischaal met kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) na hun verwijdering uit muizen opgeofferd volgens goedgekeurde dierethiek protocollen. </li><li> Onder de microscoop ontleden, reinig het oog met een tang: zich te ontdoen van het haar en het bindweefsel, dat is aangesloten op het hoornvlies / sclerale grens. Vervolgens overbrengen het oog naar een nieuwe schotel met ACSF. </li><li> Terwijl voorzichtig houdt het oog stationaire met gekartelde tang, gebruik schuine micro-ontleden schaar om de oogspieren te verwijderen. Verwijder de oogzenuw en als het nog aan het oog. Probeer niet voor het oog squish tijdens dit proces. Overdracht ogen om een ​​nieuwe schotel met ACSF. </li><li> Volgende gebruik van gebogen micro-ontleden schaar voor het oog gehalveerd: bij de oogzenuw beginnen en snijden door het midden van het hoornvlies, vergadering terug op de oogzenuw wanneer de snit was gestart. Het is ideaal als de twee stukken van de ogen zijn ongeveer gelijk in grootte, want dit zal de volgende stap gemakkelijker te maken. </li><li> Houd de hoornvliezen met behulp van twee tang voorzichtig schil de twee in het oog helften uit elkaar. Verwijder de lens, de ingewanden, en de neurale netvlies van het oog schelpen. Breng de schelpen aan een nieuwe schotel met ACSF. </li><li> Nu zijn we klaar om de ciliaire epitheel te isoleren. Om te beginnen, oriënteren in het oog shell, zodat het hoornvlies is aan uw rechterhand en de Retinal Gepigmenteerde epitheel (RPE) is aan de linkerkant. Voorzichtig pin in het oog schelp naar beneden met rechte tang aan de RPE kant. </li><li> Vervolgens gebruikt u een scalpel aan het hoornvlies en de iris weggesneden uit het ciliaire epitheel van het oog door zachtjes naar beneden te duwen op de scalpel in plaats van zagen bewegingen. </li><li> Daarna, snijd de ciliaire epitheel weg van de RPE. Gebruik niet-getande tang om de strook van de ciliaire epitheel over te dragen aan een nieuwe 35-mm schotel met ACSF. </li><li> Op dezelfde manier, isoleren van de ciliaire epitheel van het andere oog shell. </li><li> Zodra beide ciliaire epitheel stroken zijn verzameld, de overdracht van de strips in een 35-mm schotel met 2 ml Dispase. Plaats de schaal met de strips in een 37 ° C incubator gedurende 10 minuten. </li><li> Na 10 minuten, overdracht van de stroken van het Dispase in een schotel met 2 ml gefilterd Trypsine, hyaluronidase, en Kynurenic Acid. Zet de schaal bij 37 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Ga nu terug naar het ontleden microscoop. Terwijl u de sclera naar beneden met rechte tang, gebruik maken van de onderkant van de gebogen niet-getande tang voorzichtig schrapen het ciliaire epitheel weg van de sclera. </li><li> Haal de sclera van de schotel. Het enige dat moet worden overgelaten nu in de schotel zijn de cellen van belang en het enzym oplossing. </li><li> Met behulp van een brand-gepolijste katoen-plugged pipet deze oplossing in een 14 ml buis. Vermaal deze oplossing 30 keer te breken behalve de epitheelcellen door voorzichtig waardoor de oplossing in en uit de pipet. </li><li> Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten bij 1500 RPM. Wanneer het centrifugeren is gedaan, de buis voorzichtig te verwijderen uit de centrifuge, omdat de cellen zijn gevoelig voor komende uit de bodem van de buis in dit stadium. </li><li> Zuig voorzichtig het grootste deel van het supernatant met behulp van een brand-gepolijste pipet en voeg 1 ml trypsine-remmer in serum-vrij Media naar de cellen. Gebruik een klein boorgat katoen aangesloten pipet om het monster vermaal ongeveer 50 maal in totdat deze is een single-celsuspensie. </li><li> Nogmaals centrifugeer de buis gedurende 5 minuten bij 1500 RPM. </li><li> Verwijder het supernatant en vervang deze door 1 ml van uw plating medium. Vermaal voorzichtig met een brand-geslepen glazen pipet om de cellen te mengen. </li><li> Na teling van de cellen, plaat ze op de gewenste dichtheid in een 24-well plaat. We meestal plaat 10 cellen / microliter door het invullen van elk putje eerst met medium en daarna het toevoegen van de celsuspensie tot een eindvolume van 500 ul van de media te krijgen. </li><li> Plaats de plaat in een 37 ° C CO 2 incubator waar het niet zal worden verplaatst totdat u rekenen de sferen die zich voordoen na 7 dagen. </li></ol> 3. Resultaten van het netvlies isoleren stamcellen <ol><li> Wanneer deze procedure met succes wordt uitgevoerd, moet de ontleed ciliaire epitheel cellen er als volgt uitzien nadat ze losgekoppeld en uitgeplaat bij een lage dichtheid (figuur 1). </li><li> Na 7 dagen in cultuur, zijn de retinale stamcellen sferen die zich voordoen geteld. Een bol moet worden meer dan 75 micrometer in diameter en vrij zwevende te worden meegeteld als een stamcellen afgeleid sfeer. (Figuur 2). Toch zullen sommige cellen hebben een beperkte verspreiding en de vorm spheroids die niet voldoen aan deeltjesgrootte en zal niet worden geteld als stamcellen afgeleid bollen, een voorbeeld van een dergelijk sferoïde is hier te zien (figuur 2). </li></ol> 4. Representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/2209/2209fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. <img src="/files/ftp_upload/2209/2209fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2.

<ol><li>Tropepe, V., Coles, B. L., Chiasson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+stem+cells+in+the+adult+mammalian+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Retinal stem cells in the adult mammalian eye.</a> Science. 287, 2032-2036 (2000).</li>
<li>Ahmad, I., Tang, L., Pham, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+neural+progenitors+in+the+adult+mammalian+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Identification of neural progenitors in the adult mammalian eye.</a> Biochem Biophys Res Commun. 270, 517-521 (2000).</li>
<li>Coles, B. L., Angenieux, B., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+isolation+and+the+characterization+of+human+retinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Facile isolation and the characterization of human retinal stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15772-15777 (2004).</li>
<li>Cicero, S. A., Johnson, D., Reyntjens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+previously+identified+as+retinal+stem+cells+are+pigmented+ciliary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cells previously identified as retinal stem cells are pigmented ciliary epithelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 6685-6690 (2009).</li>
<li>Lamba, D., Karl, M., Reh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+regeneration+and+cell+replacement%3A+a+view+from+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Neural regeneration and cell replacement: a view from the eye.</a> Cell Stem Cell. 2 (6), 538-549 (2008).</li>
<li>Coles, B. L., Horsford, D. J., McInnes, R. R., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+retinal+progenitor+cells+leads+to+an+increase+in+the+retinal+stem+cell+population+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Loss of retinal progenitor cells leads to an increase in the retinal stem cell population in vivo.</a> Eur J Neurosci. 23, 75-82 (2006).</li>
<li>Angénieux, B., Schorderet, F. D., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+is+a+neuronal+differentiation+factor+for+retinal+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor is a neuronal differentiation factor for retinal stem cells in vitro.</a> Stem Cells. 24 (3), 696-706 (2006).</li>
<li>Xu, S., Sunderland, M. E., Coles, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proliferation+and+expansion+of+retinal+stem+cells+require+functional+Pax6%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The proliferation and expansion of retinal stem cells require functional Pax6.</a> Dev Biol. 304, 713-721 (2007).</li>
<li>Canola, K., Angénieux, B., Tekaya, M., Quiambao, A., Naash, M. I., Munier, F. L., Schorderet, D. F., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+stem+cells+transplanted+into+models+of+late+stages+of+retinitis+pigmentosa+preferentially+adopt+a+glial+or+a+retinal+ganglion+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinal stem cells transplanted into models of late stages of retinitis pigmentosa preferentially adopt a glial or a retinal ganglion cell fate.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (1), 446-4454 (2007).</li>
<li>Canola, K., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cells+committed+towards+the+photoreceptor+fate+for+retinal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Generation of cells committed towards the photoreceptor fate for retinal transplantation.</a> Neuroreport. 18 (9), 851-855 (2007).</li>
<li>Djojosubroto, M. W., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+stem+cells%3A+promising+candidates+for+retina+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal stem cells: promising candidates for retina transplantation.</a> Cell Tissue Res. 331 (1), 347-357 (2008).</li>
<li>Inoue, T., Coles, B. L., Dorval, K., Bremner, R., Bessho, Y., Kageyama, R., Hino, S., Matsuoka, M., Craft, C. M., McInnes, R. R., Tremblay, F., Prusky, G. T., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+functional+photoreceptor+differentiation+from+adult+human+retinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Maximizing functional photoreceptor differentiation from adult human retinal stem cells.</a> Stem Cells. 28 (3), 489-500 (2010).</li>
<li>Tropepe, V., Sibilia, M., Ciruna, B. G., Rossant, J., Wagner, E. F., Kooy, D. vander <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+neural+stem+cells+proliferate+in+response+to+EGF+and+FGF+in+the+developing+mouse+telencephalon.+Dev+Biol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct neural stem cells proliferate in response to EGF and FGF in the developing mouse telencephalon. Dev Biol.</a> , 208-201 (1999).</li>
<li>Coles-Takabe, B. L., Brain, I., Purpura, K. A., Karpowicz, P., Zandstra, P. W., Morshead, C. M., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Don%27t+look%3A+growing+clonal+versus+nonclonal+neural+stem+cell+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies.</a> Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).</li>
</ol>

Dit protocol beschrijft hoe te isoleren van stamcellen uit het netvlies van de ciliaire epitheel van de muis oog 1-3. De methodologie voor het isoleren van de strips van ciliaire epitheel kan variëren, maar de enzymen en de methodologie voor het bereiken van een single-celsuspensie zijn geoptimaliseerd in dit protocol. Het is ook belangrijk dat de strips van de ciliaire epitheel die zijn geïsoleerd geen grote hoeveelheden van de RPE of hoornvlies bevatten omdat deze lijken een negatieve invloed op het totaal aantal bollen dat kan worden geïsoleerd van elk oog hebben. Daarnaast is de serum-vrije media die we maken die oorspronkelijk was ontwikkeld voor de hersenen neurospheres 13, is ideaal voor het verbouwen van het netvlies stamcellen bollen. Men moet er ook voor zorgen dat de cellen niet worden verstoord nadat ze zijn verguld en geplaatst in de couveuse, zodat de groeiende bollen niet samenklonteren 14. Zodra het netvlies stamcellen hebben gevormd klonale bollen, kunnen ze worden gerekend tot een potentiële aantal stamcellen per oog te krijgen. De bollen kunnen dan vervolgens gescheiden worden in losse cellen en gepasseerd om na te gaan zelfvernieuwing mogelijkheden of gedifferentieerd in de verschillende celtypen van de neurale netvlies en RPE het gebruik van verschillende combinaties van groeifactoren en / of eiwitten.

<table><tbody><tr><td>Stemi 2000 microscoop</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Koude lichtbron</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>KL1500</td><td>optisch licht met dubbele arm</td></tr><tr><td>Gebogen mini Vannas-schaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-10</td><td></td></tr><tr><td>Gehoekte Vannas-schaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>15005-08</td><td></td></tr><tr><td>#7 Dumont pincet</td><td>Fine Science Tools</td><td>11272-30</td><td>niet-gekarteld</td></tr><tr><td>#5 Dumont pincet</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>recht</td></tr><tr><td>Fijne pincet</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td>gekarteld gebogen</td></tr><tr><td>#3 Scalpelhouder</td><td>Almedic</td><td>2586-M36-10</td><td></td></tr><tr><td>#10 Scalpelbladen</td><td>Almedic</td><td>2580-M90-10</td><td></td></tr><tr><td>Hot Bead sterilisator</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>VWR international</td><td>CACB354235</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1005</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6254</td><td></td></tr><tr><td>Kynureenzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K3375</td><td>1000 IU</td></tr><tr><td>Trypsine-inhibitor</td><td>Roche Group</td><td>10109878001</td><td></td></tr><tr><td>35 mm schalen</td><td>VWR international</td><td>CA354235</td><td></td></tr><tr><td>24-well plaat</td><td>VWR international</td><td>CA73521-004</td><td></td></tr><tr><td>Pipetten met katoenprop</td><td>VWR international</td><td>14672-400</td><td>vuurgepolijst</td></tr><tr><td>14 mL buizen</td><td>Falcon BD</td><td>352057</td><td>Polystyreen</td></tr><tr><td>Serumvrij medium</td><td></td><td></td><td>Ref# 13 voor formulering</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0291</td><td></td></tr><tr><td>Heparine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td>100 IU</td></tr></tbody></table>

isolatie van het netvlies stamcellen van de muis eye

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

De volwassen muis retinaal stamcellen (RSC) is een zeldzame rustende cel gevonden binnen de ciliaire epitheel (CE) van de zoogdieren oog 1,2,3. Het CE bestaat uit niet-gepigmenteerde binnen-en gepigmenteerde buitenste cellagen, en de klonale RSC kolonies die voortvloeien uit een enkele gepigmenteerde cel uit het CE zijn opgebouwd uit zowel gepigmenteerde en niet-gepigmenteerde cellen die kunnen worden gedifferentieerd om alle vormen celtypen van de neurale netvlies en de RPE. Er is enige controverse over de vraag of alle cellen in de sferen bevatten alle ten minste een aantal pigment 4, maar de cellen zijn nog in staat de vorming van de verschillende celtypes gevonden binnen de neurale netvlies 1-3. Bij sommige soorten, zoals amfibieën en vissen, hun ogen zijn in staat om de regeneratie na verwonding 5, echter, de zoogdieren oog vertoont geen regeneratieve eigenschappen. Wij streven ernaar om de stamcellen in vivo te identificeren en om de mechanismen die ervoor zorgen dat het zoogdier netvlies stamcellen rust 6-8 te begrijpen, zelfs nadat zowel de schade als het gebruik ervan als een potentiële bron van cellen te repareren fysieke of genetische modellen van de verwonding aan het oog te helpen door middel van transplantatie 9-12. Hier beschrijven we hoe u de ciliaire epitheel cellen van de muis oog te isoleren en te groeien ze in de cultuur om de klonale netvlies stamcellen bollen te vormen. Aangezien er geen bekende merkers van de stamcellen in vivo, deze gebieden zijn de enige bekende manier om de stamcellen bevolking prospectief identificeren op het ciliaire epitheel van het oog.

In deze video, zullen we laten zien hoe je netvlies stamcellen uit het ciliaire epitheel van de muis oog te isoleren en te groeien ze in cultuur tot klonale netvlies bollen te vormen. De bollen die zijn geïsoleerd beschikken over de kardinale eigenschappen van stamcellen: self-vernieuwing en multipotentiality.

Isolatie van het netvlies stamcellen van de muis Eye

De volwassen retinale stamcel (RSC) van de muis is een zeldzame quiescente cel die wordt aangetroffen in het ciliaire epitheel (CE) van het zoogdierenoog1,2,3. Het CE is opgebouwd uit ...

Het hoofddoel van deze procedure is het isoleren van retinale stamcellen uit het ciliaire epitheel van het oog. Dit wordt bereikt door eerst het oog te reinigen en in tweeën te snijden, beginnend bij de oogzenuw, door het hoornvlies snijdend en terugkerend bij de oogzenuw, om vervolgens het neurale netvlies en de lens te verwijderen. De tweede stap van de procedure is het uitsnijden van het ciliaire epitheel door het hoornvlies, de iris en het gepigmenteerde netvliesepitheel af te snijden.De derde stap van de procedure is het enzymatisch behandelen van het ciliaire epitheel, het verwijderen van de sclera en het mechanisch dissocieren van het epitheel tot enkelvoudige cellen. De laatste stap van de procedure is het resuspenderen van de cellen in serumvrij medium en het uitplaten ervan in weefselkweekplaten die serumvrij medium met groeifactoren bevatten. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die prospectief het aantal stamcellen in het ciliaire epitheel van het oog aantonen via in vitro clonale sfeer-vorming.Hallo, mijn naam is Brenda Coles. Ons lab ontwikkelde deze methode toen we literatuuronderzoek deden naar de regeneratieve vermogens van de ogen van amfibieën en vissen, waarbij we de hypothese stelden dat er wellicht een cel in het oog van zoogdieren met dezelfde vermogens bestond. De isolatie van de retinale stamcellen vindt plaats in een specifieke steriele ruimte die is gereserveerd voor experimenten met primaire culturen.Voordat u met deze procedure begint, stelt u de dissectiemicroscoop en de koudlichtbron in en legt u de steriele dissectie-instrumenten klaar. Elke zuil is voorzien van een hitte-sterilisator om de instrumenten tussen de stappen door te steriliseren. We zullen retinale stamcellen isoleren uit ogen die, na het opofferen van muizen volgens goedgekeurde ethische protocollen voor dieren, onmiddellijk in een steriele Petrischaal met kunstmatig cerebrospinaal vocht zijn geplaatst. Het moeilijkste aspect van deze procedure is het dissecteren van een rond object onder de microscoop.Er moet uiterste zorg worden betracht om het weefsel van belang niet te beschadigen. Reinig het oog met een pincet onder de dissectiemicroscoop. Verwijder de haren en het bindweefsel dat aan de grens tussen het hoornvlies en de sclera vastzit. Verplaats het oog vervolgens naar een nieuw schaaltje met A CSF, terwijl het oog met een gekartelde pincet gefixeerd wordt gehouden.Gebruik gebogen micro-dissectiescharen om de oogspieren te verwijderen. Verwijder ook de oogzenuw als deze nog aan het oog vastzit; probeer het oog tijdens dit proces niet plat te drukken. Breng de ogen over naar een nieuwe schaal met CSF.Gebruik vervolgens gebogen microschaartjes voor dissectie om het oog doormidden te knippen. Begin bij de oogzenuw en knip door het midden van het hoornvlies tot u weer bij de oogzenuw uitkomt, waar de snede is begonnen. Het is ideaal als de twee ooghelften ongeveer even groot zijn, omdat dit de volgende stap vergemakkelijkt.Houd de hoornvliezen vast met twee pincetten en pel de twee ooghelften voorzichtig van elkaar af. Verwijder de lenzen, de viscera en het neurale netvlies uit de oogschelpen en gooi deze weg. Breng de schelpen over naar een nieuw schaaltje met A CSF.Nu zijn we klaar om het ciliaire epitheel te isoleren. Begin met het oriënteren van de oogschelp, zodat het hoornvlies zich aan uw rechterkant bevindt en het retinaal gepigmenteerde epitheel aan uw linkerkant. Zet de oogschelp voorzichtig vast met een rechte pincet aan de kant van het RPE.Gebruik vervolgens het scalpel om het hoornvlies en de iris voorzichtig van het ciliaire epitheel van het oog te snijden door zachtjes op het scalpel te duwen in plaats van zaagbewegingen te maken. Snijd daarna het ciliaire epitheel weg van het RPE. Gebruik niet-gekartelde pincetten om de strook ciliaire epitheel over te brengen naar een nieuwe schaal van 35 millimeter met A CSF.Isoleer op dezelfde wijze het ciliaire epitheel uit de andere oogschelp. Zodra de stroken ciliair epitheel zijn verzameld, brengt u de stroken over naar een schaal van 35 millimeter die twee milliliter dis space bevat. Plaats de schaal met de stroken gedurende 10 minuten in een incubator van 37 °C.Na 10 minuten worden de strips vanuit de disruum overgebracht naar een schaal met twee milliliters gefilterde druppels in Haldane-buffer en kinurenzuur. Plaats de schaal 10 minuten lang bij 37 °C. Keer nu terug naar de dissectiemicroscoop terwijl de sclera met een rechte pincet wordt vastgehouden.Gebruik de punt van de niet-gekartelde pincet om het ciliaire epitheel voorzichtig van de sclera weg te schrapen. Verwijder de sclera uit de schaal. Alleen het epitheel mag in de schaal achterblijven.Nu zijn de cellen van belang en de enzymoplossing aanwezig. Overbreng de oplossing met een vuurgepolijste, met watten gestopte pipet naar een buis van 14 liter. Tritureer deze oplossing 30 keer om de epitheelcellen te scheiden door de oplossing voorzichtig in en uit de pipet te duwen; centrifugeer de buis vervolgens vijf minuten bij 1500 RPM.Verwijder de buis na het centrifugeren voorzichtig uit de centrifuge, aangezien de cellen gemakkelijk los kunnen laten van de bodem van de buis. Aspireer in deze fase voorzichtig het grootste deel van de SuperNet met een vuurgepolijste pipet en voeg vervolgens één milliliter trypsine-inhibitor in serumvrij medium toe aan de cellen.Gebruik een kleine pipette met katoenen prop om de monsteroplossing ongeveer 50 keer te homogeniseren totdat er een suspensie van enkelvoudige cellen is ontstaan. Centrifugeer de buis opnieuw vijf minuten lang bij 1500 RPM, verwijder het supernatant en vervang dit door één milliliter van uw plating-medium.Resuspendeer de cellen door het medium voorzichtig te mengen met een vuurgepolijste glazen pipette. Plateer de cellen na het tellen op de gewenste dichtheid. In een 24-well plaat plateeren we gewoonlijk 10 cellen per microliter door elke well eerst te vullen met medium en vervolgens de celsuspensie toe te voegen om een eindvolume van 500 microliter medium te verkrijgen.Plaats de plaat in een incubator met kooldioxide bij 37 °C, waar deze ongemoeid blijft totdat u de sferen telt die ontstaan na zeven dagen, mits deze procedure succesvol is uitgevoerd. De gedisseceerde ciliaire epitheelcellen zouden er zo uit moeten zien na dissociatie en uitplaten bij een lage dichtheid. Na zeven dagen in cultuur worden de ontstane retinaal stamcelsferen geteld.Een sfeer moet een diameter van meer dan 75 microns hebben en vrij zwevend zijn om als een sfeer afgeleid van stamcellen te worden geteld. Sommige cellen zullen echter een beperkte proliferatie vertonen en PHE vormen die niet aan het groottecriterium voldoen en dus niet als sferen afgeleid van stamcellen worden geteld. Een voorbeeld van zo'n asteroïde wordt hier getoond na de ontwikkeling ervan.Deze techniek maakte het mogelijk voor onderzoekers in het veld van de visiewetenschappen om de mogelijkheid van het gebruik van retinale stamcellen bij de behandeling van retinale aandoeningen te onderzoeken.

isolation-of-retinal-stem-cells-from-the-mouse-eye

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video describes a protocol to isolate the retinal cup without the outer covering layers from the eyeball of a mouse. The extracted retinal tissue can help study various metabolic pathways occurring in the retinal cells.

Retinal Cup Extraction from Mouse: A Surgical Procedure to Obtain Intact Retinal Cup from Mouse Eye

This video demonstrates the procedure for isolating murine primary retinal ganglion cells (RGCs) by using flow cytometry. This method allows for the future study of RGCs, with the goal of better understanding the major decline in visual acuity that results from the loss of functional RGCs in neurodegenerative diseases.

Isolating Murine Retinal Ganglion Cells Using Fluorescence-Activated Cell Sorting

Miljoenen mensen lijden aan retinale degeneratieve ziekten die leiden tot onomkeerbare blindheid. Een gemeenschappelijk element van veel van deze ziekten is het verlies van retinale ganglioncellen (RGC's). Dit gedetailleerde protocol beschrijft de isolatie van primaire murine RGC's door positieve en negatieve selectie met flowcytometrie.

Isolatie van Primaire Murine Retinale Ganglioncellen (RGC&#39;s) door Flow Cytometry

De retinale pigment epitheel (RPE) is een multi-functionele epitheel van het oog. Hier presenteren we een protocol om primaire celculturen afgeleid van de lymfkliertest RPE.

Primaire celculturen van de muis retinale Pigment epitheel

Dit protocol presenteert twee technieken om de subcellulaire compartimenten van muizenstaaffotoreceptoren te isoleren voor eiwitanalyse. De eerste methode maakt gebruik van levend retinae en cellulosefilterpapier om de buitenste segmenten van de staaf te scheiden, terwijl de tweede gebruik maakt van gelyofiliseerd netvlies en plakband om de binnenste en buitenste segmentlagen van de staaf weg te pellen.

Twee peelingmethoden voor de isolatie van fotoreceptorcelcompartimenten in het netvlies van de muis voor eiwitanalyse

Dit protocol beschrijft een methode voor de isolatie van muriene postnatale retinale endotheelcellen die zijn geoptimaliseerd voor celopbrengst, zuiverheid en levensvatbaarheid. Deze cellen zijn geschikt voor next-generation sequencing benaderingen.

Isolatie van murine retinale endotheelcellen voor next-generation sequencing

Dit manuscript beschrijft een vereenvoudigd protocol voor de isolatie van retinale gepigmenteerde epitheelcellen (RPE) uit muizenogen op een stapsgewijze manier. Het protocol omvat de enucleatie en dissectie van muizenogen, gevolgd door de isolatie, zaaiing en kweek van RPE-cellen.

Isolatie van primaire retinale gepigmenteerde epitheelcellen van muizen

Müller glia primaire culturen verkregen uit het netvlies van muizen vormen een zeer robuust en betrouwbaar hulpmiddel om de gliale omzetting in retinale voorlopercellen na microRNA-behandeling te bestuderen. Afzonderlijke moleculen of combinaties kunnen worden getest voordat ze vervolgens in vivo worden toegepast.

Primaire celculturen om het regeneratiepotentieel van Murine Müller Glia na microRNA-behandeling te bestuderen

We beschrijven een eenvoudige en efficiënte methode voor het isoleren van cellen van het retinale pigmentepitheel (RPE) cellen uit de ogen van jonge gepigmenteerde cavia's. Deze procedure maakt follow-up moleculair biologisch onderzoek naar de geïsoleerde RPE mogelijk, inclusief genexpressieanalyses.

Isolatie van retinale pigmentepitheelcellen uit caviaogen

Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol voor het isoleren van retinale gliacellen Müller uit muizenogen. Het protocol begint met enucleatie en dissectie van muizenogen, gevolgd door isolatie, zaaien en kweken van Müller-cellen.

Isolatie van primaire müllercellen van de retinale glia van muizen

Retinaal pigmentepitheel (RPE) fungeert als een cruciale barrière tussen het vaatvlies en het netvlies en bevordert de gezondheid en functie van retinale celtypen, zoals fotoreceptoren. Hierin beschrijven we een eenvoudig en effectief protocol voor het isoleren en kweken van RPE van volwassen muizen.

Een vereenvoudigde methode voor isolatie en kweek van retinale pigmentepitheelcellen van volwassen muizen

Leer de isolatie van netvliesstamcellen uit het ciliaire epitheel van het muizenoog. Deze methode omvat dissectie, enzymatische behandeling en kweek van clonale retinale sferen voor onderzoek naar stamcelbiologie en regeneratieve geneeskunde.

Isolatie van het netvlies stamcellen van de muis Eye

Meer video's verkennen