Name: Analyse van de Schwann-astrocyte Interacties gebruik In Vitro Testen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-13T23:59:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Leer in vitro-testen om interacties tussen Schwann-cellen en astrocyten te bestuderen voor ruggenmergletselherstel. Deze methoden helpen onderzoekers migratie en integratie van cellen te analyseren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag Philippa Warren bedanken voor haar soort te helpen.

1. Boundary Assay: <ol><li> Basis bereiding: Kamer dia's zijn voorzien van Poly-D-Lysine 's nachts en steriele glazen dia's worden voorbereid voordat het experiment. Medium wordt bereid met behulp van Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), aangevuld met 10% foetaal kalf serum (FCS), en 1% penicilline-streptomycine-Fungizon (PSF). Ook een fles van Calcium / Magnesium gratis Hanks gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) is bereid. </li><li> Primaire rat Schwann-cellen gekweekt in kolf zijn getrypsiniseerd gedurende 3 minuten met 0,1% trypsine. Primaire rat astrocyten cultuur is getrypsiniseerd gedurende 5 minuten met 0,1% trypsine. Trypsine is inactived door het toevoegen van DMEM aangevuld met 10% FCS en 1% PSF. </li><li> Getrypsiniseerd Schwann-cellen en astrocyten zijn overgebracht naar 15 ml Falcon buizen gescheiden en gecentrifugeerd bij 300G gedurende 5 minuten. </li><li> Schwann cellen en astrocyten opnieuw worden geschorst op de dichtheid van 2 x 10 6 (zie de representatieve resultaten sectie voor variaties in de celdichtheid). </li><li> 50 pi daling van Schwann celsuspensie wordt geplaatst aan de ene kant van de PDL-gecoate kamer slide putten. Een glazen strook werd gebruikt om smeren de druppel naar het midden van de kamer naar een rechte rand te genereren. (Met behulp van een glassnijder, een rechthoekige glazen dekglaasjes overlangs gesneden, zodat dat het de breedte van de kamer slides gebruikt voor de grens assays fit) </li><li> Een tweede daling van 50 ul van astrocyten suspensie werd geplaatst aan de andere kant van dezelfde goed en gesmeerd naar het centrum om een ​​rechte rand parallel aan de eerste druppel uitstrijkje met een kleine 0,2 mm kloof tussen hen te creëren. </li><li> De kamer dia's met daarin de druppels worden geplaatst in de incubator bij 37 ° C gedurende 2 uur. </li><li> Na 2 uur, werden de kweken gewassen met DMEM aan niet-ingeschreven cellulaire puin en vers medium met DMEM / 10% FCS / 1% PSF toegevoegd te verwijderen. Let op: DMEM / 10% FCS / 1% PSF kan worden aangevuld met forskoline (2μM) en Bovine hypofyse extract (BPE) (10μg / mL) te stimuleren Schwann cel proliferatie. BPE levert de groeifactoren die nodig zijn om op lange termijn Schwann cel cultuur toe te staan ​​en forskoline verhoogt de cyclische adenosine monofosfaat niveaus binnen de Schwann-cellen te induceren proliferatie </li><li> Cellen worden gekweekt voor ongeveer 8-10 dagen bij 37 ° C, 7% CO 2 incubator. Het medium moet vervangen worden om de 3 dagen. De twee cel fronten zal uiteindelijk elkaar en een scherpe grens vormen tussen de twee celtypen. In dit stadium experimenten kan worden uitgevoerd analyseren van factoren die betrokken zijn bij grens formatie. </li><li> Co-cultuur kan worden bevestigd met 4% formaldehyde en Schwann-cellen kunnen worden immunostained met anti-P75 antilichaam en astrocyten met anti-GFAP antilichamen tegen de cellen te identificeren in co-cultuur. P75 antilichaam herkent een lage affiniteit NGF receptor op Schwann cellen die astrocyten missen. Anti-GFAP antilichaam herkent gliale firbrillary zure eiwit dat lokaliseert tot astrocyten cytoplasma. (Zie figuur 1A voor representatieve grens) </li></ol> 2. Migratie Assay: <ol><li> 4 well platen (15mm putten) zijn PDL gecoat 's nachts en voorbereid voor het creëren van astrocyten monolagen. </li><li> Primaire astrocyten cultuur is getrypsiniseerd gedurende 5 minuten met 0,1% trypsine. Trypsine wordt geïnactiveerd door het toevoegen van DMEM aangevuld met 10% FCS en 1% PSF en cel gecentrifugeerd bij 300G gedurende 5 minuten. (Zie figuur 2) </li><li> Astrocyten opnieuw geschorst op 1x10 5 cellen / ml. 1 ml van deze oplossing wordt toegevoegd aan elk PDL gecoat goed in 4 well platen. Astrocyten worden gekweekt voor 24-48 uur totdat de monolaag is volledig confluent. </li><li> Om Schwann cel migratie te beoordelen op astrocyten monolagen, parallel aan het creëren van astrocyten monolagen, ronde PDL-gecoat glas dekglaasjes worden geplaatst in een 50 mL buis en geplet met behulp van een plastic pipet om kleine stukjes glas te creëren. </li><li> Glasscherven worden overgebracht in een put in 6 wells plaat schaal en het gebruik van een tang met aangepaste afmetingen fragmenten worden gekozen en geplaatst in andere putten. 5 glazen fragmenten worden geplaatst in elk putje in 6 well platen. </li><li> Primaire Schwann-cellen gekweekt in kolf zijn getrypsiniseerd gedurende 3 minuten met 0,1% trypsine. Getrypsiniseerd Schwann-cellen worden overgebracht naar 15 ml Falcon buis gescheiden en gecentrifugeerd bij 300 G gedurende 5 minuten. Schwann-cellen worden opnieuw geschorst op 2x 10 6 cellen / ml in DMEM/10% FCS / 1% PSF. </li><li> 20 pi druppels van Schwann-cellen suspensie wordt toegevoegd over elke 5 dekglaasje fragmenten geplaatst in zes goed platen en cellen worden geïncubeerd bij 37 ° C, 7% CO 2 gedurende 2 uur. </li><li> Na 2 uur worden de Schwann-cellen aan de dekglaasje fragmenten en DMEM/10% FCS / 1% PSF (aangevuld met 2μM van Forskolin en 10μg / mL van BPE wordt aan elk putje toegevoegd, zodat de fragmenten volledig bedekt zijn met medium) . </li><li> De 6 well platen met de fragmenten worden dan geplaatst in de incubator voor 24-48 uur totdat het glas fragmenten zijn volledig convloeiend met Schwann-cellen. </li><li> Zodra fragmenten zijn samenvloeiing met Schwann-cellen, wordt elk fragment opgehaald voorzichtig met scherpe pincet en ondergedompeld in HBSS met losse cellen te verwijderen en vervolgens omgekeerd naar beneden op astrocyten monolaag. </li><li> Elke well wordt dan bedekt met een ml DMEM/10% FCS / 1% PSF en Schwann-cellen mogen migreren gedurende 24 tot 48 periode. Tijdens deze periode experimentele reagentia zoals groeifactoren kunnen worden toegevoegd om het effect te beoordelen op het aantal en de afstand van de migratie van de Schwann-cellen. </li><li> Na de migratie periode, zijn de glasscherven bevestigd aan de onderkant van elke goed door de toevoeging van 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 30 minuten. Na fixatie, immunostain de Schwann-cellen voor p75 (herkennen van lage affiniteit NGF-receptor) dan vlek ze met behulp van ABC strepavidin kit-diaminobenzidine (DAB), om visualisatie van de Schwann-cellen onder de lichtmicroscoop mogelijk te maken. </li></ol> 3. Representatieve resultaten: Na 8-10 dagen Schwann-astrocyten co-culturen tonen een scherpe grens tussen de twee celtypen. Deze grens is meer uitgesproken als forskoline en BPE wordt gebruikt in de cultuur als Schwann cel proliferatie is verbeterd. Als er geen grens is waargenomen tijdens de periode van 10 dagen, kan de tijd van de cultuur verder worden verhoogd totdat de grenzen zijn vastgesteld. Het veranderen van de verhouding van de celdichtheid is een alternatieve manier om de grens formatie te verhogen. Een verhouding van 3:1 Schwann: astrocyten celdichtheid kan worden gebruikt bij het ​​opstellen van celsuspensies 8,18. Naar aanleiding van immunokleuring van de Schwann-cellen en astrocyten te identificeren, tot cel vermenging een lijn kan worden getrokken waar de grens is gevestigd en het aantal Schwann-cellen migreren naar het astrocyt grondgebied kan worden geteld onder de fluorescentie microscoop te beoordelen. Hieronder staan ​​twee voorbeelden van beelden verkregen grenzen, een met goed gevormde segregatie van Schwann cellen en astrocyten (Figuur 1A) en een waar de cellen niet goed gescheiden in verschillende gebieden te wijten aan een slechte techniek (Figuur 1B). <img src="/files/ftp_upload/2214/2214fig2.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> . Figuur 1 Boundary test: Schwann-astrocyten interactie. A) Een 10 dagen co-cultuur assay in de aanwezigheid van forskoline en BPE aan Schwann cel proliferatie te stimuleren geeft blijk van een scherpe grens tussen de twee celtypes (rood = P75, groen = GFAP). B) Een 10 dagen co-cultuur assay waar de grens niet is gevormd en de twee cel fronten gemengd. Dit was te wijten aan het mengen van de twee druppeltjes bij het plaatsen van astrocyten en Schwann cel druppels naast elkaar tijdens de voorbereiding van de grens (rood = P75, groen = GFAP). <img src="/files/ftp_upload/2214/2214fig1.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Representatief beeld van samenvloeiende astrocyte monolaag Migratie testen beoordelen beweging van een celtype over het oppervlak van een ander celtype en daarom beoordelen van een ander fenomeen dan die van grens formatie. De praktijk is nodig om het omkeren van de dekglaasjes op monolagen zorgen niet leidt tot schade aan de Schwann cel bedekte glas fragmenten en astrocyte monolagen door de scherpe tang. Om de migratie van Schwann-cellen, de maximale afstand van de migratie en het aantal migrerende cellen van de rand van dekglaasje kan worden gemeten onder lichtmicroscoop. Hieronder is het beeld van Schwann-cellen gekleurd met P75 antilichaam via DAB vlekken op het oppervlak van astrocyte monolaag (figuur 3). <img src="/files/ftp_upload/2214/2214fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Migratie test met behulp van omgekeerde dekglaasje test. A) Schwann-cellen (bruin, immunostained met p75 antilichaam) migratie uit de buurt van de rand van het dekglaasje. Pijl wijst naar de richting van de cel migratie uit de buurt van het dekglaasje.

<ol><li>Assouline, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+astrocytes+and+Schwann+cells+in+culture+synthesize+nerve+growth+factor-like+neurite-promoting+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Rat astrocytes and Schwann cells in culture synthesize nerve growth factor-like neurite-promoting factors.</a> Brain Res. 428, 103-118 (1987).</li>
<li>Taylor, J. S., Bampton, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+secreted+by+Schwann+cells+stimulate+the+regeneration+of+neonatal+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Factors secreted by Schwann cells stimulate the regeneration of neonatal retinal ganglion cells.</a> J Anat. 204, 25-31 (2004).</li>
<li>Reichardt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+and+cell+adhesion+molecules%3A+neuronal+receptors+that+regulate+axon+growth+on+extracellular+matrices+and+cell+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Integrins and cell adhesion molecules: neuronal receptors that regulate axon growth on extracellular matrices and cell surfaces.</a> Dev Neurosci. 11, 332-347 (1989).</li>
<li>Chiu, A. Y., Monteros,, Espinosa de los, A., Cole, R. A., Loera, S., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminin+and+s-laminin+are+produced+and+released+by+astrocytes%2C+Schwann+cells%2C+and+schwannomas+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Laminin and s-laminin are produced and released by astrocytes, Schwann cells, and schwannomas in culture.</a> Glia. 4, 11-24 (1991).</li>
<li>Blakemore, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remyelination+of+CNS+axons+by+Schwann+cells+transplanted+from+the+sciatic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Remyelination of CNS axons by Schwann cells transplanted from the sciatic nerve.</a> Nature. 266, 68-69 (1977).</li>
<li>Andrews, M. R., Stelzner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+olfactory+ensheathing+and+schwann+cells+after+implantation+into+a+dorsal+injury+of+adult+rat+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Evaluation of olfactory ensheathing and schwann cells after implantation into a dorsal injury of adult rat spinal cord.</a> J Neurotrauma. 24, 1773-1792 (2007).</li>
<li>Iwashita, Y., Fawcett, J. W., Crang, A. J., Franklin, R. J., Blakemore, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cells+transplanted+into+normal+and+X-irradiated+adult+white+matter+do+not+migrate+extensively+and+show+poor+long-term+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Schwann cells transplanted into normal and X-irradiated adult white matter do not migrate extensively and show poor long-term survival.</a> Exp Neurol. 164, 292-302 (2000).</li>
<li>Lakatos, A., Franklin, R. J., Barnett, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+ensheathing+cells+and+Schwann+cells+differ+in+their+in+vitro+interactions+with+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Olfactory ensheathing cells and Schwann cells differ in their in vitro interactions with astrocytes.</a> Glia. 32, 214-225 (2000).</li>
<li>Lakatos, A., Barnett, S. C., Franklin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+ensheathing+cells+induce+less+host+astrocyte+response+and+chondroitin+sulphate+proteoglycan+expression+than+Schwann+cells+following+transplantation+into+adult+CNS+white+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Olfactory ensheathing cells induce less host astrocyte response and chondroitin sulphate proteoglycan expression than Schwann cells following transplantation into adult CNS white matter.</a> Exp Neurol. 184, 237-246 (2003).</li>
<li>Ghirnikar, R. S., Eng, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-Schwann+cell+interactions+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-Schwann cell interactions in culture.</a> Glia. 11, 367-377 (1994).</li>
<li>Ghirnikar, R. S., Eng, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondroitin+sulfate+proteoglycan+staining+in+astrocyte-Schwann+cell+co-cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Chondroitin sulfate proteoglycan staining in astrocyte-Schwann cell co-cultures.</a> Glia. 14, 145-152 (1995).</li>
<li>Plant, G. W., Bates, M. L., Bunge, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+proteoglycan+immunoreactivity+is+higher+at+the+caudal+than+the+rostral+Schwann+cell+graft-transected+spinal+cord+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inhibitory proteoglycan immunoreactivity is higher at the caudal than the rostral Schwann cell graft-transected spinal cord interface.</a> Mol Cell Neurosci. 17, 471-487 (2001).</li>
<li>Fishman, P. S., Nilaver, G., Kelly, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrogliosis+limits+the+integration+of+peripheral+nerve+grafts+into+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Astrogliosis limits the integration of peripheral nerve grafts into the spinal cord.</a> Brain Res. 277, 175-180 (1983).</li>
<li>Fok-Seang, J., Mathews, G. A., ffrench-Constant, C., Trotter, J., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+oligodendrocyte+precursors+on+astrocytes+and+meningeal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Migration of oligodendrocyte precursors on astrocytes and meningeal cells.</a> Dev Biol. 171, 1-15 (1995).</li>
<li>Wilby, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Cadherin+inhibits+Schwann+cell+migration+on+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">N-Cadherin inhibits Schwann cell migration on astrocytes.</a> Mol Cell Neurosci. 14, 66-84 (1999).</li>
<li>Grimpe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+proteoglycans+in+Schwann+cell%2Fastrocyte+interactions+and+in+regeneration+failure+at+PNS%2FCNS+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of proteoglycans in Schwann cell/astrocyte interactions and in regeneration failure at PNS/CNS interfaces.</a> Mol Cell Neurosci. 28, 18-29 (2005).</li>
<li>Afshari, F. T., Kwok, J. C., White, L., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cell+migration+is+integrin-dependent+and+inhibited+by+astrocyte-produced%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Schwann cell migration is integrin-dependent and inhibited by astrocyte-produced.</a> Glia. , (2010).</li>
<li>Santos-Silva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF%2Fheparin+differentially+regulates+Schwann+cell+and+olfactory+ensheathing+cell+interactions+with+astrocytes%3A+a+role+in+astrocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">FGF/heparin differentially regulates Schwann cell and olfactory ensheathing cell interactions with astrocytes: a role in astrocytosis.</a> J Neurosci. 27, 7154-7167 (2007).</li>
<li>Afshari, F. T., Kwok, J. C., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-produced+ephrins+inhibit+schwann+cell+migration+via+VAV2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-produced ephrins inhibit schwann cell migration via VAV2 signaling.</a> J Neurosci. 30, 4246-4255 (2007).</li>
</ol>

De assays hierboven beschreven zijn die in verschillende studies het aantonen van de rol van meerdere factoren betrokken bij de vorming grens tussen de Schwann-astrocyten en beperkte Schwann cel migratie in astrocytaire omgeving. Inzicht in de mechanismen die ten grondslag liggen aan deze gebeurtenissen is essentieel omdat het in staat zou stellen de ontwikkeling van strategieën voor het optimaliseren en verbeteren van de integratie van Schwann cel transplantatie na de transplantatie en zo g...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Invitrogen</td><td>10091-148</td><td></td></tr><tr><td>PSF</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>BPE</td><td>Invitrogen</td><td>13028-014</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Calbiochem</td><td>344273</td><td></td></tr><tr><td>Dekglasjes</td><td>VWR international</td><td>631-0149</td><td></td></tr><tr><td>Dekglasjes (rechthoekig)</td><td>Menzel-Glaser</td><td>BB022050A1</td><td></td></tr><tr><td>Kamerslides</td><td>Nalge Nunc international</td><td>177380</td><td></td></tr><tr><td>4-well platen, 6-well platen</td><td>Nalge Nunc international</td><td></td><td>4-well platen6-well platen</td></tr><tr><td>rat p75 antilichaam</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB365</td><td></td></tr><tr><td>GFAP antilichaam</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td></td></tr><tr><td>Secundaire antilichamen (Alexa-geconjugeerd)</td><td>Invitrogen</td><td>A-11004 A-11034</td><td>Geit anti-muis 568Geit anti-konijn 488</td></tr><tr><td>Secundaire biotinylering</td><td>Vector Laboratories</td><td></td><td>Geit anti-muis</td></tr><tr><td>DAB-tabletten</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4418</td><td></td></tr><tr><td>ABC elite kit</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>Fijne pincet</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6168</td><td></td></tr><tr><td>Fluorosave</td><td>Calbiochem</td><td>345789</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse van de schwann-astrocyte interacties gebruik in vitro testen

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann-cellen zijn een van de meest gebruikte cellen in reparatie strategieën volgen ruggenmergletsels. Schwann-cellen zijn in staat de ondersteuning van axonale regeneratie en ontspruiten door het afscheiden van groeifactoren 1,2 en het verstrekken van de groei bevorderen van adhesiemoleculen 3 en extracellulaire matrix moleculen 4. Bovendien zijn ze myelinate de gedemyeliniseerde axonen op de site van letsel 5. Echter na transplantatie, moet Schwann-cellen niet migreren van de site van implantaat en niet vermengen met de gastheer astrocyten 6,7. Dit resulteert in de vorming van een scherpe grens tussen de Schwann-cellen en astrocyten, een obstakel vormt voor het kweken van axonen proberen om het transplantaat weer af te sluiten in de gastheerweefsel proximaal en distaal. Astrocyten in contact met de Schwann-cellen ook ondergaan hypertrofie en up-reguleren van de remmende moleculen 8-13. In vitro testen zijn gebruikt om het model Schwann cel-astrocyten interacties en zijn belangrijk in het begrijpen van het mechanisme dat ten grondslag de cellulaire gedrag. Deze in vitro testen omvatten grens assay, waarbij een co-cultuur is gemaakt met behulp van twee verschillende cellen met elk celtype bezettende verschillende gebieden met slechts een kleine kloof tussen de twee fronten cel. Omdat de cellen delen en migreren, de twee mobiele fronten komen dichter bij elkaar en uiteindelijk botsen. Dit maakt het gedrag van de twee mobiele populaties te analyseren aan de grens. Een andere variatie van dezelfde techniek is om de twee mobiele populaties in cultuur mix en na verloop van tijd de twee soorten cellen te scheiden met Schwann-cellen samengeklonterd samen als eilanden in tussen astrocyten samen het creëren van meerdere Schwann-astrocyten grenzen. De tweede test wordt gebruikt in het bestuderen van de interactie van twee celtypen is de migratie test waar de cellulaire bewegingen kunnen worden gevolgd op het oppervlak van het andere celtype monolaag 14,15. Deze test is algemeen bekend als omgekeerde dekglaasje test. Schwann-cellen worden gekweekt op kleine glasdeeltjes en ze zijn omgekeerd naar beneden op het oppervlak van astrocyte monolagen en migratie wordt beoordeeld vanuit de rand van het dekglaasje. Beide testen zijn geweest bij het bestuderen van de onderliggende mechanismen die betrokken zijn bij de cellulaire uitsluiting en grens vorming. Een deel van de moleculen geïdentificeerd met behulp van deze technieken zijn N-cadherines 15, chondroïtinesulfaat proteoglycanen (CSPGs) 16,17, FGF / Heparine 18, Ef / Ephrins 19. In dit artikel wil grens test en migratie test in stapsgewijs te beschrijven en de mogelijke technische problemen die zich kunnen voordoen toe te lichten.

In dit artikel wil beschrijven stapsgewijs de gebruikelijke<em&gt; In vitro</em&gt; Assays worden gebruikt bij het bestuderen van Schwann cel-asrtocyte interacties.

Analyse van de Schwann-astrocyte Interacties gebruik In Vitro Testen

Schwanncellen behoren tot de meest gebruikte cellen in herstelstrategieën na letsel aan het ruggenmerg. Schwanncellen zijn in staat om axonale...

Schwanncellen zijn gliale cellen van het perifere zenuwstelsel die zijn gebruikt bij de herstelbehandeling van dwarslaesies. In essentie produceren ze groeifactoren die axonale regeneratie ondersteunen en zorgen ze voor adhesiemoleculen en extracellulaire matrixmoleculen die de groei bevorderen. Daarnaast myelineren ze axonen op de plaats van het letsel.Helaas migreren getransplanteerde swan-cellen niet vanuit de implantatieplaats en mengen ze zich niet met de astrocyten van de gastheer. Dit resulteert in de vorming van een scherpe grens en voorkomt dat groeiende axonen integreren met het weefsel van de gastheer. In deze video worden twee methoden gebruikt om de interacties tussen swan-cellen en astrocyten in vitro te bestuderen.Eerst wordt een boundary-assay gedemonstreerd waarbij territoria van swan-cellen en astrocyten op een objectglas worden vastgesteld en gekweekt. Vervolgens worden verschillende reagentia aan het objectglas toegevoegd, gevolgd door een verdere kweekperiode. De objectglazen worden daarna gefotografeerd en geanalyseerd om het effect van de reagentia op de migratie van swan-cellen naar het astrocytaire territorium, of vice versa, te bepalen.Vervolgens wordt een migratie-assay gedemonstreerd waarin fragmenten van dekglasplaatjes bedekt met nesten van Schwann-cellen worden omgekeerd op astrocyten-monolagen. Opnieuw worden verschillende reagentia aan het cultuurmedium toegevoegd, waarna beeldvorming van de cultuur wordt uitgevoerd om de mate en afstand van migratie van Schwann-cellen op astrocyten-monolagen te beoordelen. Uiteindelijk moet dit type assay de ontwikkeling van strategieën faciliteren om de integratie van Schwann-celtransplantaten na transplantatie te optimaliseren en te verbeteren.Het voordeel van deze in vitro-assays ten opzichte van bestaande methoden waarbij migratie op zuivere substraten wordt beoordeeld, is dat ze relevanter zijn voor in vivo-assays waarbij getransplanteerde cellen in contact komen met astrocyten. Daarnaast kunnen deze in vitro-assays worden gebruikt in andere vakgebieden, zoals de celbiologie, om kernvragen te beantwoorden over zaken als tumorcelinvasie en -migratie. Zorg dat de volgende items klaarliggen voordat u met de assay begint: met poly-D-lysine gecoate kamerslides, steriele glazen objectglazen, celkweekmedium en een fles calcium.Begin de magnesiumvrije Hanks-gebalanceerde bronoplossing door primaire rat-Schwanncellen gedurende drie minuten en primaire rat-astrocyten gedurende vijf minuten te trypsiniseren. Zodra de cellen zijn losgelaten, wordt de trypsine geïnactiveerd door celkweekmedium toe te voegen. Breng vervolgens de Schwanncellen en astrocyten over naar afzonderlijke 15 milliliter Falcon-buisjes en centrifugeer deze bij 300 ×g gedurende vijf minuten.Snijd ondertussen met een glasnijper rechthoekige glazen dekglasjes in de lengte, zodat ze passen op de breedte van de kamerdia's die worden gebruikt voor boundary assays en het uitstrijken van de druppel celсусpensie kunnen vergemakkelijken. Suspendeer na de spin Resus de Schwanncellen en astrocyten bij een dichtheid van 2 × 10⁶ cellen per milliliter. Plaats aan één uiteinde van een met polylysine gecoate kamerdia één druppel van 50 µL Schwanncel-suspensie.Gebruik een glazen strip om de druppel naar het midden van de kamer uit te smeren om een rechte rand te creëren. Plaats vervolgens een tweede druppel van 50 µL astrocytensuspensie aan het tegenovergestelde uiteinde van dezelfde put en smeer deze naar het midden. Om een rechte rand parallel aan de eerste te creëren, moet er een tussenruimte van 0,2 mm tussen beide ontstaan.Plaats het kamerglasplaatje met de druppels gedurende twee uur in de incubator bij 37 °C. Was na twee uur de culturen met DMEM om eventueel niet-gehecht cellulair debris te verwijderen.Voeg medium toe aan de kamerglaasjes om de proliferatie van Schwann-cellen te stimuleren. Dit medium is aangevuld met forskoline en runderhypofyse-extract. De forskoline verhoogt de cyclisch AMP-spiegels in de Schwann-cellen om proliferatie te induceren en het BPE levert de groeifactoren die nodig zijn voor langetermijnkweek.Incubeer het objectglas gedurende acht tot 10 dagen. De twee celfronten zullen uiteindelijk elkaar bereiken, waarna er een scherpe grens tussen de twee celtypen ontstaat. Op dit moment kunnen de experimenten worden uitgevoerd.Om de factoren die betrokken zijn bij de vorming van de grens te analyseren en de grens te onderzoeken, wordt de co-cultuur gefixeerd met 4% formaldehyde. Om Schwann-cellen en astrocyten te onderscheiden, wordt respectievelijk immunokleuring uitgevoerd met een anti-P75-antilichaam en een anti-GFAP-antilichaam. Het P75-antilichaam herkent de NGF-receptor met lage affiniteit op Schwann-cellen, die astrocyten missen; het anti-GFAP-antilichaam herkent het gliale fibrillaire zure proteïne, dat gelokaliseerd is in astrocyten, om een migratie-assay uit te voeren.Begin met het uitplaten. Voeg 1 × 10⁵ astrocyten in 1 mL medium toe aan elke well van een 4-wells plaat met 15 mm wells. Plaats de plaat in de 37 °C incubator gedurende 24 tot 48 uur totdat de monolaag volledig confluent is.Bereid ondertussen de zwanencellen voor om de migratie op astrocyten-monolagen te beoordelen door ronde, met polylysine gecoate glazen dekglasplaatjes in een buis van 50 milliliter te plaatsen en een plastic stamper te gebruiken om ze te verbrijzelen, zodat er kleine glasfragmenten ontstaan. Breng de glasfragmenten met een pincet over naar één putje van een six-wellplaat. Selecteer fragmenten van ongeveer vijf millimeter groot en breng er vijf over naar elk van de andere putjes.Behandel de Schwann-cellen gedurende drie minuten met trypsine. Draai de cellen vervolgens in een buis van 15 milliliter centrifuge bij 300 ×g gedurende vijf minuten. Resuspendeer de Schwann-cellen in cultuurmedium tot een concentratie van 2 × 10⁶ cellen per milliliter.Voeg vervolgens 20 µL van de Schwanncel-suspensie toe over elk fragment en incubeer gedurende twee uur bij 37 °C en 7% CO2. Haal de Schwanncellen na twee uur uit de incubator. Voeg aan elke well voldoende kweekmedium toe, aangevuld met 2 µM four scale in en 10 µg/mL BPE.Zorg dat de fragmenten met gehechte cellen volledig bedekt zijn met medium en incubeer deze gedurende 24 tot 48 uur totdat de glasfragmenten volledig bevolkt zijn met swan-cellen. Zodra de fragmenten bevolkt zijn met swan-cellen, worden zowel de swan-cellen als de astrocyten uit de incubator gehaald. Gebruik een pincet om elk fragment met gehechte swan-cellen voorzichtig op te pakken.Dip het fragment in HBSS om niet-gehechte cellen te verwijderen en plaats het vervolgens met de voorkant naar beneden op de astrocytenmonolaag. Zodra alle fragmenten zijn overgebracht, wordt aan elke well één milliliter celcultuurmedium toegevoegd.Indien de effecten van experimentele reagentia, zoals groeifactoren, worden beoordeeld, moeten deze aan het medium worden toegevoegd. Plaats de plaat terug in de incubator en laat de schwan-cellen gedurende 24 tot 48 uur migreren na de migratieperiode. De glasfragmenten worden aan de bodem van elke put gefixeerd door 4% paraformaldehyde gedurende 30 minuten toe te voegen na de fixatie.Voer een immunokleuring uit van de Schwann-cellen voor P 75 en kleur ze vervolgens met de ABC Strept ADIN-kit, geleverd door DIAM benadine, om de Schwann-cellen na 10 dagen onder een lichtmicroscoop zichtbaar te maken. De co-cultuur van Schwann-cellen en astrocyten vertoont een scherpe grens tussen de twee celtypen. Hier zijn de Schwann-cellen geïdentificeerd door P 75.Kleuring van de NGF-receptor met lage affiniteit is in het rood weergegeven; astrocyten worden geïdentificeerd door GFAP-kleuring, weergegeven in het groen. De grens tussen deze cellen is uitgesprokener wanneer forskoline en BPE in de kweek worden gebruikt, omdat de proliferatie van Schwanncellen wordt versterkt. In contrast hiermee zijn de cellen in deze 10-daagse co-kweekassay niet goed gesegregeerd in verschillende territoria.Dit was te wijten aan een gebrekkige techniek en het mengen van de twee celtypen. Hoewel de boundary assay wordt voorbereid, beoordelen migratieassays de beweging van één celtype over het oppervlak van een ander celtype, en beoordelen zij daarom een ander fenomeen dan dat van boundary-vorming. Deze afbeelding toont swan-cellen die wegmigreren van de rand van het dekglas; de pijl geeft de richting van de celmigratie aan.Bij het uitvoeren van deze in vitro assays is het belangrijk om te onthouden dat het effect van de reagentia zowel op astrocyten als op Schwann-cellen kan liggen; daarom zijn vervolgexperimenten nodig om exact aan te tonen welk celtype verantwoordelijk is voor de waargenomen toename of afname van de migratie. Daarnaast kunnen andere technieken, zoals immunochemie, worden toegepast, in het bijzonder bij de boundary assay, om aan te tonen welke moleculen opgereguleerd of neergereguleerd zijn op de grens tussen Schwann-cellen en astrocyten.

analysis-of-schwann-astrocyte-interactions-using-in-vitro-assays

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit artikel beschrijft een nieuw protocol en reagensset ontworpen voor de gevoelige meting van de neurotoxische effecten van verbindingen en behandelingen op co-culturen van neuronen en astrocyten met behulp van hoge inhoudsanalyse. Resultaten tonen aan dat de hoge inhoudelijke analyse een spannende nieuwe technologie voor neurotoxiciteit assessment vertegenwoordigt.

Een Neuronale en astrocyte co-cultuur assay voor High Content Analysis van neurotoxiciteit

Deze studie beschrijft de procedures van het opzetten van een nieuwe neuronale axon en (astro) glia co-cultuur platform. In deze co-cultuur systeem, manipulatie van directe interactie tussen een axon (en single gliale cel) wordt het mogelijk, waardoor mechanistische analyse van de wederzijdse neuron naar gliale signalering.

Imaging Analyse van de Neuron tot Glia Interactie in Microfluïdische Cultuur Platform (MCP)-gebaseerde Neuronale Axon en Glia Co-cultuur systeem

Hier beschrijven we een Schwann-cellen (SC) migratie assay waarin SC kunnen ontwikkelen langs axonen verlenging.

Het analyseren van Murine Schwann Cell Development Samen Groeien Axonen

Fenotypisch wild-type astrocyten en neurale stamcellen die zijn geoogst uit muizen die zijn gemodificeerd met gefloxte, conditionele oncogeen allelen en getransformeerd via virale Cre-gemedieerde recombinatie, kunnen worden gebruikt om de pathogenese van astrocytomen in vitro en in vivo te modelleren door orthotopische injectie van getransformeerde cellen in hersenen van syngene, immuuncompetente nestgenoten.

Modeling Astrocytoom Pathogenese In Vitro En In Vivo Met behulp van corticale Astrocyten of neurale stamcellen uit Conditional, genetisch gemanipuleerde muizen

Dit protocol beschrijft de indirecte neuron-astrocyten co-cultuur voor verzuilde analyse van neuron-glia interacties.

De indirecte Neuron-astrocyten Coculture Assay: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Set-up voor het gedetailleerd onderzoek van het neuron-glia interacties

Het behoud van de bloeddrukbarriere dekking is de sleutel voor de homeostase van het centrale zenuwstelsel. Dit protocol beschrijft in vitro technieken om de fundamentele en pathologische processen te definiëren die de bloeddrukbeperking moduleren.

In Vitro- analyses voor het beoordelen van bloed-hersenbarrière Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Het AWESAM protocol beschreven hier is optimaal voor het kweken van lymfkliertest astrocyten los van andere hersencellen in een snelle, eenvoudige en goedkope manier. AWESAM astrocyten vertonen spontane Ca2 + signalering, morfologie en gene expressieprofielen vergelijkbaar met de astrocyten in vivo.

Kweken In Vivo-graag lymfkliertest astrocyten met behulp van de snelle, eenvoudige en goedkope AWESAM-Protocol

Hier presenteren we protocollen om te onderzoeken op bijzondere waardeverminderingen van de neurovasculaire eenheid tijdens de experimentele autoimmune encefalomyelitis in vivo. Wij ingaan specifiek op het bepalen van de bloed - hersenbarrière permeabiliteit en gelatinase activiteit die betrokken zijn bij migratie van leukocyten in de glia-limitans.

Visualiseren van de waardevermindering van het endotheel en gliale belemmeringen van de neurovasculaire eenheid tijdens de experimentele Autoimmune encefalomyelitis In Vivo

Hier beschrijven we een in vitro Live-imaging methode om intracellulair transport van organellen en de handel in plasma membraan eiwitten in muriene astrocyten te visualiseren. Dit protocol presenteert ook een analysemethode voor het vrachtvervoer en kinetiek.

Visualisering en analyse van intracellulair transport van organellen en andere Cargo's in astrocyten

Dit protocol presenteert een unieke manier om celculturen van het centrale zenuwstelsel te genereren uit embryonale dag 17 muizenhersenen voor neuro(immuno)logisch onderzoek. Dit model kan worden geanalyseerd met behulp van verschillende experimentele technieken, waaronder RT-qPCR, microscopie, ELISA en flowcytometrie.

Het opzetten van gemengde neuronale en gliale celculturen van embryonale muizenhersenen om infectie en aangeboren immuniteit te bestuderen

Hier bieden we een gedetailleerde methodologie voor het isoleren van het netvlies van het oog van de muis voor uitgebreide ex vivo experimenten. Dit protocol benadrukt het toegankelijk maken van deze technisch veeleisende benadering voor onderzoekers die willen profiteren van de onderzoeksmogelijkheden die worden geboden door retinale glia in situ te houden in levend weefsel.

Een ex vivo explantatiemodel voor het bestuderen van gliale interacties in het netvlies van de muis

Leer in vitro-testen om interacties tussen Schwann-cellen en astrocyten te bestuderen voor ruggenmergletselherstel. Deze methoden helpen onderzoekers migratie en integratie van cellen te analyseren.

Analyse van de Schwann-astrocyte Interacties gebruik In Vitro Testen

Meer video's verkennen