Visualisatie van UV-geïnduceerde Replicatie Intermediates in E. coli Met behulp van twee-dimensionale Agarose gel-analyse

Het algemene doel van deze procedure is om de DNA-structurele tussenproducten te visualiseren die optreden wanneer replicatie DNA-laesies tegenkomt, met behulp van tweedimensionale gelanalyse. Dit wordt bereikt door eerst het DNA te isoleren uit actief delende cellen waarin replicatieblokkerende laesies zijn geïnduceerd. Vervolgens wordt gelelektroforese gebruikt om het herstelde DNA te scheiden op basis van grootte.

Vervolgens worden de banen uitgesneden en horizontaal opnieuw gegoten in een tweede gel die DNA verder scheidt op basis van zowel grootte als vorm. Ten slotte wordt Southern-analyse gebruikt om de DNA-structuren te visualiseren die geassocieerd zijn met replicerende DNA-fragmenten vóór en op verschillende tijdstippen na de introductie van UV-geïnduceerde schade. Uiteindelijk kan deze procedure worden gebruikt om te laten zien dat de onmogelijkheid om DNA-laesies in bepaalde mutanten te verwerken, resulteert in de accumulatie van DNA-reparatie-tussenproducten.

Hallo, mijn naam is Arthur Ian. Ik kom van het Corella Lab aan de Portland State University. Hallo, mijn naam is Brand she, ik kom ook van het Corella Lab.

Vandaag laten we je een procedure zien voor tweedimensionale gelelektroforese. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om DNA-replicatie en reparatie-tussenproducten te bestuderen. Dus laten we beginnen.

Om deze procedure te starten, kweek een 200 microliter overnachtcultuur van e coli die het plasmide PBR 3 22 bevat in DGC dij medium met ampicilline bij 37 graden Celsius. Het gebruik van DGC dij medium minimaliseert UV-afscherming. Na overnachtelijke incubatie pellet de cellen bij 14.000 RRP M gedurende 30 seconden.

Vervolgens resuspendeert u het celpellet in 200 microliters van DG C th medium zonder ampicilline en inoculeert u 20 milliliters van DG C dij medium om culturen te laten groeien zonder ampicilline selectie. In een schuddende incubator bij 37 graden Celsius tot een OD 600 van 0,5, wat overeenkomt met ongeveer vijf keer 10 tot de achtste cellen Per milliliter groei zonder ampicilline vermijdt selectie tegen abnormale of onproductieve replicatie-tussenproducten die in sommige mutanten kunnen ontstaan.

Bovendien, als UV-licht wordt gebruikt om schade te induceren, is het noodzakelijk om het ampicilline uit het medium te verwijderen omdat het sterk absorbeert op deze golflengten en afschermt. De cellen verminderen de effectieve dosis UV terwijl de cellen groeien. Gebruik een UVC fotometer om de afstand van een 15 watt kiemdodende lamp te bepalen die een blootstellingssnelheid produceert van ongeveer een JUUL per meter meter vierkant per seconde.

De volgende stappen moeten onder geel licht worden uitgevoerd, omdat dit zal voorkomen dat fotoreactivatie omkering van cyclobutaan perine dimers door fotoliase na UV-bestraling. Zodra de gewenste celdichtheid is bereikt, gebruikt u een pipet om de cultuur over te brengen naar een Petri-schaal met een diameter van 15 centimeter op een roterend platform om gelijkmatige bestraling van de gehele celpopulatie te garanderen. Vervolgens bestraalt u de culturen met 50 joule per meter vierkant en brengt u ze onmiddellijk over in een steriele voorverwarmde flacon en plaatst u ze terug in de schuddende incubator bij 37 graden Celsius.

Voor de duur van het experiment produceert deze dosis gemiddeld één cyclobutaan perine dimer, elke 4,5 kilobase van enkelstrengs DNA voor elk tijdstip dat moet worden onderzocht. Pipetteer een 0,75 milliliter aliquot van de cultuur in 0,75 milliliter ijskoud net 30. Buffer net 30 dient als stopbuffer dat voorkomt dat replicatie en nucleotide excisie reparatie doorgaan.

Zodra de stopbuffer is toegevoegd, kan het monster op ijs worden bewaard tot het einde van de tijdscursus. Na de tijdscursus pellet elk monster en resuspendeer de pellets. In 150 microliters van lysisbuffer lyce de cellen bij 37 graden Celsius gedurende 20 minuten zonder agitatie.

Omdat replicerende structuren met enkelstrengs gebieden of takpunten vatbaarder zijn voor afscherming, snijdt u de pipettetips af met een scheermes om de mond breder te maken en de afschermingskrachten te minimaliseren. In het algemeen moet pipetten en agiteren tot een minimum worden beperkt tot nadat het DNA is verteerd met restrictie-enzymen. Na lysis voegt u proteinase K en sarcascel toe en laat u de incubatie een uur voortduren. Dit dient om DNA-fragmenten die aan eiwitten zijn gebonden vrij te maken.

Aangezien actief replicerend DNA vaak gebonden is aan eiwit- of membraancomplexen, helpt dit om de opbrengst van replicatiefragmenten te verhogen. Na een uur extraheert u de monsters door twee volumes fenol toe te voegen aan elk monster en de buisjes gedurende vijf minuten voorzichtig om te keren. Voeg vervolgens twee volumes chloroform, isoamyalcohol toe en draai de buisjes nogmaals gedurende vijf minuten voorzichtig om.

Centrifugeer vervolgens de monsters gedurende vijf minuten bij 14.000 RPM in een microcentrifuge en breng de bovenste waterige fase van elk monster over in een nieuwe buis. Voeg vervolgens vier volumes chloroform ISO-alcohol toe en draai de buisjes opnieuw gedurende vijf minuten voorzichtig om. Centrifugeer de monsters opnieuw gedurende vijf minuten bij 14.000 RPM.

Plaats een dialysemembraan op 250 milliliters van 0,1 xte in een beker en breng 100 microliters van elk monster aan op het membraan. Laat de monsters een uur dialyseren na dialyse. Plaats 80 microliters van elk monster in een nieuwe 1,5 milliliter buis met 20 microliters enzymmix.

Verteer de monsters een nacht bij 37 graden Celsius. PV twee lineairiseert het plasmide net stroomafwaarts van de replicatie-oorsprong. Voordat u het agros-gel laadt, voegt u 100 microliters chloroform en 20 microliters zes x laadbuffer toe die bromo bevat.

Fenylblauw en xyleencyan voor elk monster en meng. Chloroform zal eventueel aanwezig zijn PV twee dat gebonden is aan DNA-einden verwijderen. Begin met tweedimensionale aros-gelanalyse door de beperkte DNA-monsters door de eerste dimensie te leiden. Laad eerst een Lambda hind drie maatstaf in de eerste baan van een eerder voorbereide 0,4% agros-gel in