Name: Visualisatie van UV-geïnduceerde Replicatie Intermediates in E. coli Met behulp van twee-dimensionale Agarose gel-analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-21T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Leer twee-dimensionale agarose gel-analyse voor DNA-replicatieonderzoek in E. coli na UV-beschadiging. Deze methode maakt visualisatie van replicatie-intermediaten mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Werken in ons lab wordt ondersteund door LOOPBAAN award MCB0551798 van de National Science Foundation en het gebied te verlenen R15GM86839 van de NIGMS-NIH.

1. Groei en UV-straling. <ol><li> 200μl van een verse 's nachts de cultuur die het plasmide pBR322 gekweekt in Davis medium 1 aangevuld met 0,4% glucose, 0,2% casamino zuren, en 10 ug / ml thymine (DGCthy medium) en 100 ug / ml ampicilline is gekorreld. De cel pellet wordt vervolgens geresuspendeerd in 200μl DGCthy medium zonder ampicilline en wordt gebruikt om 20 ml DGCthy medium enten. </li><li> Culturen zijn geteeld zonder ampicilline selectie in een incubator schudden bij 37 ° C tot een OD 600 van 0,5 (~ 5 x 10 8 cellen / ml). Groei zonder ampicilline vermijdt selectie tegen abnormaal of onproductieve replicatie tussenproducten die zich kunnen voordoen in een aantal mutanten. Bovendien, als met behulp van UV-licht om schade te veroorzaken, het verwijderen van de ampicilline van de media is nodig, omdat het absorbeert sterk op deze golflengten en schilden van de cellen, waardoor de effectieve dosis van UV. </li><li> Werken onder gele lichten, is de cultuur in een 15 cm diameter petrischaal op een draaiend platform voor agitatie. Onze culturen zijn geplaatst op een afstand van een 15-watt kiemdodende lamp die een exposure van ~ 1 J/m2/sec, die wordt gemeten met behulp van een UVC fotometer produceert. Culturen worden bestraald met 50 J/m2 en dan meteen teruggeplaatst in de schudden 37 ° C incubator voor de duur van het experiment. Deze dosis produceert, gemiddeld genomen, een cyclobutaan pyrimidine dimeer elk 4,5 kb van ssDNA. De gele verlichting voorkomt fotoreactivering-omkering van cyclobutaan pyrimidine dimeren door photolyase. </li></ol> 2. DNA-isolatie. <ol><li> Op momenten dat replicatie tussenproducten moeten worden onderzocht, is een 0,75 ml van de cultuur geplaatst in 0,75 ml ijskoude NET30 buffer (100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, 30 mM EDTA) en op ijs geplaatst tot het einde van het tijdsverloop. We hebben doorgaans een 90 minuten de tijd natuurlijk, met monsters onderzocht op 0, 15, 30, 45, 60 en 90 minuten. De EDTA-en koude temperaturen dienen om effectief te stoppen met replicatie-en nucleotide excisie reparatie. </li><li> Elk monster wordt vervolgens gepelleteerd, geresuspendeerd in 150 pi van 1,5 mg / ml lysozym en 0,2 mg / ml RNaseA in TE (10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA), en gelyseerd bij 37 ° C gedurende 20 minuten. Op dit moment zijn 10μl van proteïnase K (10mg/ml) en 10μl van 20% Sarkosyl toegevoegd en de incubatie wordt toegestaan ​​om door te gaan gedurende 1 uur. Proteinase K en Sarkosyl helpen om DNA-fragmenten die kunnen worden geassocieerd met het membraan of eiwitten voor fenolextractie optreedt release. Omdat actief replicerende DNA is vaak gebonden aan eiwitten of membraan complexen, dit helpt bij het verhogen van de opbrengst van de replicatie fragmenten, die zijn teruggewonnen. </li><li> Monsters worden vervolgens geëxtraheerd door toevoeging van 2 volumes van fenol aan elk monster en worden de buizen voorzichtig omgekeerd gedurende 5 minuten. Dan twee volumes van chloroform / isoamylalcohol (24 / 1) worden toegevoegd en worden de buizen voorzichtig weer omgekeerd gedurende 5 minuten. </li><li> De monsters worden gecentrifugeerd bij 14.000 rpm in een microcentrifuge gedurende 5 minuten en de top waterige fase van elk monster wordt verwijderd, en geplaatst in een nieuwe buis. Dan vier volumes van chloroform / isoamylalcohol (24 / 1) worden toegevoegd, worden de buizen voorzichtig omgekeerd gedurende 5 minuten, en opnieuw gecentrifugeerd bij 14.000 rpm gedurende 5 minuten. </li><li> De top, waterige fase in elk monster wordt vervolgens gedialyseerd gedurende 1 uur door het spotten van 100μl van elk monster op een 47mm Whatman 0,025 um porie-schijf die op 250 ml van 0.1X TE drijft in een bekerglas. Omdat replicerende structuren met enkele streng regio of branche punten zijn vatbaarder voor knippen, snijden we meestal onze pipetpunten af ​​met een scheermesje om de mond breder en schuifkrachten te minimaliseren. In het algemeen moet pipetteren worden tot een minimum beperkt nadat het DNA werd gedigereerd met restrictie-enzymen. </li><li> Elk monster wordt vervolgens gedigereerd met PvuII (New England Biolabs), die het plasmide linearizes net stroomafwaarts van de oorsprong van replicatie. </li><li> Voorafgaand aan het laden in de agarose gel, 100μl chloroform en 20μl van 6X laden kleurstof die broomfenolblauw en Xyleen Cyanol bevat, zijn aan elk monster toegevoegd en gemengd. Vervolgens wordt 40μl van de waterige fase die het laden kleurstof geladen in de gel. Te minimaliseren structurele vooroordelen, structurele artefacten, en DNA scheren, betekent dit isolement procedure geen enkele maatregel te verrijken voor enkele streng regio's, neerslag, of concentraat van de DNA-monsters volgende cel lysis. </li></ol> 3. 2D-Gel-en Zuid-Analysis. <ol><li> De 2-dimensionale agarose-gel-analyse is gewijzigd van 3. Voor de 1e dimensie, zijn de beperkte DNA-monsters lopen door een 0,4% agarosegel in 1x TBE op 1V/cm. Een liter 10x TBE voorraad oplossing bevat: <ul><li> 108 g Tris Base </li><li> 55 g boorzuur </li><li> 40 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0) </li></ul></li><li> Een lambda Hind III size marker is geladen in de eerste baan, dan monsters worden geladen in elke andere baan. We hebben doorgaans de eerste dimension ~ 12-15 uur. Overslaan rijstroken maakt het gemakkelijker om de rijstroken slice uit te brengen in de tweede dimensie. De lage voltage en lage procent agarosegel dient te scheiden van de DNA-fragmenten in de eerste plaats op basis van grootte. </li><li> Voor de tweede dimensie, zijn gel banen gesneden uit de eerste dimensie gel met een groot slagersmes. De eerste baan met de lambda Hind III-marker kan worden gekleurd met ethidiumbromide. Met behulp van de lambda Hind III marker als gids, bijsnijden en gooi de regio van de gel die lager is dan waar de gelineariseerde plasmide loopt naar verwachting. Onder deze omstandigheden, zien we dat gelineariseerde pBR322 loopt iets boven de xyleen cyanol vlek. </li><li> Te werpen de tweede dimensie, is elke rijstrook horizontaal over de bovenkant van een lege gel caster. Een oplossing van 1,0% agarose in 1X TBE is bereid en gekoeld tot 55 ° C. Op dit moment is de gel-oplossing gegoten in de tweede dimensie cast, en zorg ervoor dat volledig bedekken van de gel plakjes. Zodra de gel heeft ingesteld, wordt het uit te voeren op 6.5V/cm in een elektroforese-eenheid die het mogelijk maakt de buffer te recirculeren. We hebben doorgaans de tweede dimensie ~ 5,5-7 uur. De hoge spanning en hoge procent agarosegel scheidt effectief het DNA-fragmenten op basis van hun vorm, evenals grootte. Niet-lineaire vormen lopen langzamer door de tweede dimensie. </li><li> Na elektroforese, de gel wordt vervolgens gespoeld in H 2 O, tweemaal gewassen in 400 ml 0,25 M zoutzuur gedurende 15 minuten, gespoeld met H 2 O, en klik tweemaal op in 400 ml 0,4 M NaOH gewassen gedurende 30 minuten. Het zuur wast dienen om gedeeltelijk nick de DNA-moleculen in kleinere fragmenten die overdracht efficiënter. Deze stap is nodig vanwege de grote omvang en ongebruikelijke vormen van de DNA-replicatie tussenproducten. </li><li> Het DNA in de gels wordt dan overgebracht naar een Hybond N + nylon membraan 4. We maken gebruik van een neerwaartse alkali transfersysteem met 0,4 miljoen NaOH. In het kort, zijn twee vellen vloeipapier gedrenkt in 0,4 M NaOH geplaatst op een grote stapel papieren handdoeken. Het nylon membraan is ook geweekt in 0,4 M NaOH en geplaatst op de top van het vloeipapier. De gel wordt vervolgens zorgvuldig lagen op de top van deze, gevolgd door een ander stuk vloeipapier, bevochtigd in de NaOH-oplossing. Ten slotte wordt een lang stuk nat vloeipapier lagen aan de bovenkant en de twee uiteinden zijn geplaatst in een keuken met een L van 0,4 miljoen NaOH-oplossing om te dienen als een lont. We meestal laten de DNA-overdracht voor 6-12 uur. </li><li> Het nylon membraan wordt verwijderd, gewassen 20-30 sec in 5X SSC Buffer, en geplaatst in een hybridisatie roller fles met 10.5ml prehybridisatie Solution. Vervolgens wordt het membraan geïncubeerd bij 42 ° C met de rotatie van meer dan 6 uur. Prehybridisatie oplossing: <ul><li> 5,0 ml formamide </li><li> 0,5 ml 20% SDS </li><li> 2,5 ml 20x SSC * </li><li> 2,0 ml 50X Denhardt's * </li><li> 0,5 ml zalmsperma DNA (10mg/ml) * Recepten voor SSC en Denhardt's zijn te vinden in 5 </li></ul></li><li> Tijdens de prehybridisatie-periode, is 1 ug van plasmide pBR322 gelabeld met 32P door nick-translatie volgens het protocol geleverd door Roche met behulp van alfa label [32-P]-dCTP. Het radioactief gemerkte probe (100μl) wordt gedenatureerd door incubatie bij 98 ° C gedurende 10 minuten in een schroefdop microcentrifugebuis, en dan meteen op ijs geplaatst. </li><li> De gedenatureerde probe wordt toegevoegd aan 5,9 ml hybridisatie-oplossing, die bevat: <ul><li> 3,0 ml formamide </li><li> 1,5 ml SSC </li><li> 1,0 ml H 2 O </li><li> 0,15 ml 50X Denhardt's </li><li> 0,10 ml 20% SDS </li><li> 0,15 ml 10mg/ml zalmsperma DNA </li></ul></li><li> De prehybridisatie oplossing is uitgestort van de wals fles en de hybridisatie-oplossing wordt gegoten inch De rol fles wordt dan teruggestuurd naar de 42 ° C incubator en gedraaid voor meer dan 12 uur. </li><li> De hybridisatie-oplossing is uitgestort van de wals fles. Daarna wordt de blot gewassen vier keer voor 20 minuten in de roller fles met ~ 150 ml van een oplossing die was 0.5X SSC, 0,1% SDS bij 42 ° C met rotatie. </li><li> Na de laatste wasbeurt, wordt het membraan op een papieren handdoek tot de vloeistof is zichtbaar verdwenen. Het membraan wordt vervolgens verpakt in polyvinyl chloride-plasticfolie en blootgesteld aan een phosphorimager scherm. We visualiseren en kwantificeren van de radioactiviteit met behulp van een Storm 840 en de bijbehorende ImageQuant Software. </li></ol> 4. Representatieve resultaten: <img src="/files/ftp_upload/2220/2220fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Plasmide replicatie tussenproducten waargenomen in de aanwezigheid en afwezigheid van UV-geïnduceerde DNA-schade. Het migratiepatroon van PvuII verteerd pBR322 plasmide waargenomen door 2D-agarose-gel analyse diagram. Niet-lineaire replicerende plasmiden uitgevoerd als een lineaire 4,4-kb fragment. Replicerende plasmiden vorm Y-vormige structuren die migreren langzamer dan de niet-replicerende fragmenten door hun grotere omvang en geennlinear vorm. Deze migratie patroon vormt een boog die zich uitstrekt van het lineaire gebied naar de put. Naar aanleiding van UV-bestraling, dubbel-Y of X-vormige moleculen worden waargenomen in de conus regio die langzamer migreert dan de boog van de Y-vormige moleculen. Een voorbeeld van de Zuid-analyse van de 2D-gel gemerkt met 32P-gelabeld pBR322 is aangetoond voor cellen onmiddellijk na UV-bestraling en 15 minuten na UV-bestraling (gereproduceerd met toestemming van de uitgever).

<ol><li>Davis, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Isolation+of+Biochemically+Deficient+Mutants+of+Bacteria+by+Means+of+Penicillin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The Isolation of Biochemically Deficient Mutants of Bacteria by Means of Penicillin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 35, 1-10 (1949).</li>
<li>Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Damage-Induced+Replication+Fork+Regression+and+Processing+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">DNA Damage-Induced Replication Fork Regression and Processing in Escherichia coli.</a> Science. 299, 1064-1067 (2003).</li>
<li>Friedman, K. L., Brewer, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+replication+intermediates+by+two-dimensional+agarose+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Analysis of replication intermediates by two-dimensional agarose gel electrophoresis.</a> Methods Enzymol. 262, 613-627 (1995).</li>
<li>Spivak, G., Hanawalt, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+damage+and+repair+in+specific+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22METHODS%3A+A+Companion+to+Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Determination of damage and repair in specific DNA sequences.</a> METHODS: A Companion to Methods in Enzymology. 7, 147-161 (1995).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning+-+A+laboratory+manual%22">Molecular Cloning - A laboratory manual</a>. , CSHL Press. Cold Spring Harbor. (2001).</li>
<li>Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RuvABC+is+required+to+resolve+holliday+junctions+that+accumulate+following+replication+on+damaged+templates+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">RuvABC is required to resolve holliday junctions that accumulate following replication on damaged templates in Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 281, 28811-28821 (2006).</li>
<li>Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RuvAB+and+RecG+Are+Not+Essential+for+the+Recovery+of+DNA+Synthesis+Following+UV-Induced+DNA+Damage+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">RuvAB and RecG Are Not Essential for the Recovery of DNA Synthesis Following UV-Induced DNA Damage in Escherichia coli.</a> Genetics. 166, 1631-1640 (2004).</li>
<li>Chow, K. H., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecO+Acts+with+RecF+and+RecR+to+Protect+and+Maintain+Replication+Forks+Blocked+by+UV-induced+DNA+Damage+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">RecO Acts with RecF and RecR to Protect and Maintain Replication Forks Blocked by UV-induced DNA Damage in Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 279, 3492-3496 (2004).</li>
<li>Belle, J. J., Casey, A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+the+DnaB+helicase+leads+to+the+collapse+and+degradation+of+the+replication+fork%3A+a+comparison+to+UV-induced+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Inactivation of the DnaB helicase leads to the collapse and degradation of the replication fork: a comparison to UV-induced arrest.</a> J Bacteriol. 189, 5452-5462 (2007).</li>
<li>Chow, K. H., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecBCD+and+RecJ%2FRecQ+initiate+DNA+degradation+on+distinct+substrates+in+UV-irradiated+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">RecBCD and RecJ/RecQ initiate DNA degradation on distinct substrates in UV-irradiated Escherichia coli.</a> Radiat Res. 168, 499-506 (2007).</li>
<li>Al-Hadid, Q., Ona, K., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecA433+cells+are+defective+in+recF-mediated+processing+of+disrupted+replication+forks+but+retain+recBCD-mediated+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">RecA433 cells are defective in recF-mediated processing of disrupted replication forks but retain recBCD-mediated functions.</a> Mutat Res. 645, 19-26 (2008).</li>
</ol>

Typische resultaten van wild-type cellen in de aanwezigheid en afwezigheid van UV-geïnduceerde schade zijn weergegeven in figuur 1. Bij het ontbreken van schade, kan ~ 1% van de totale plasmide DNA te vinden in de Y-boog wanneer de cellen groeien snel in exponentiële fase. Na de bestraling, is een tijdelijke toename van Y-vormige moleculen waargenomen als geblokkeerd replicatie vorken zich ophopen aan beschadigd sites. De X-vormige replicatie tussenproducten ook tijdelijk ophopen en blijven bestaan ​​totdat er een momen...

<table><tbody><tr><td>Een voorbeeld van de Southern-analyse van de gehybrideerde 2D-gel</td><td>GE Healthcare</td><td>G15T8</td><td>Yellow Lighting</td></tr><tr><td>15 &amp;mu;watt kiemdodende lamp</td><td>Sylvania</td><td>F20T12/GO</td><td>UV-lamp</td></tr><tr><td>Blak-Ray UV-intensiteitsmeter 254nm</td><td>Daigger</td><td>EF28195T</td><td>UVC-fotometer</td></tr><tr><td>0,025 &amp;mu;m poriediscs</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>VSWP04700</td><td>Drijvende dialysediscs</td></tr><tr><td>PvuII</td><td>Fermentas</td><td>ER0632</td><td>Restrictie-endonuclease</td></tr><tr><td>Nick-translatiekit</td><td>Roche Group</td><td>976776</td><td>Voor het maken van 32P-gelabelde probes</td></tr><tr><td>Blotpapier</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>3030-704</td><td>Voor Southern-transfer</td></tr><tr><td>Nylonmembraan</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN203S</td><td>Voor Southern-transfer</td></tr></tbody></table>

visualisatie van uv-geïnduceerde replicatie intermediates in e. coli met behulp van twee-dimensionale agarose gel-analyse

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

Onnauwkeurige replicatie in de aanwezigheid van DNA-schade is verantwoordelijk voor het merendeel van de cellulaire herschikkingen en mutagenese waargenomen in alle celtypes en wordt algemeen aangenomen dat direct geassocieerd met de ontwikkeling van kanker bij de mens. DNA-schade, zoals die veroorzaakt door UV-straling, vermindert sterk het vermogen van replicatie naar de genomische template nauwkeurig te dupliceren. Een aantal van gen-producten zijn geïdentificeerd die nodig zijn voor het replicatie ontmoetingen DNA laesies in de sjabloon. Er is echter een resterende uitdaging is hoe deze eiwitten te bepalen laesies tijdens replicatie<em&gt; In vivo</em&gt;. Met behulp van Escherichia coli als een modelsysteem, beschrijven we een procedure waarin twee-dimensionale agarose-gel-analyse kan worden gebruikt om de structurele tussenproducten die ontstaan ​​bij replicerende plasmiden te identificeren<em&gt; In vivo</em&gt; Na UV-geïnduceerde DNA-schade. Deze procedure is gebruikt om aan te tonen dat de replicatie vorken geblokkeerd door UV-geïnduceerde schade een tijdelijke omkering die wordt gestabiliseerd door RecA en verschillende genproducten worden geassocieerd met het RecF pad ondergaan. De techniek laat zien dat deze replicatie tussenproducten worden gehandhaafd tot een moment dat correleert met de verwijdering van de letsels door nucleotide excisie reparatie en replicatie hervat.

We presenteren een procedure waarbij twee-dimensionale agarose-gel analyse kan worden gebruikt om de structuur van de replicatie tussenproducten die optreden na UV-straling te identificeren.

Visualisatie van UV-geïnduceerde Replicatie Intermediates in E. coli Met behulp van twee-dimensionale Agarose gel-analyse

Onnauwkeurige replicatie in aanwezigheid van DNA-schade is verantwoordelijk voor de meerderheid van de cellulaire herschikkingen en mutagenese die in alle celtypen worden waargenomen ...

Het algemene doel van deze procedure is om de structurele DNA-intermediairen die ontstaan wanneer replicatie DNA-laesies tegenkomt, te visualiseren met behulp van tweedimensionale gelanalyse. Dit wordt bereikt door eerst het DNA te isoleren uit actief delende cellen waarin replicatieblokkerende laesies zijn geïnduceerd. Vervolgens wordt gelelektroforese gebruikt om het teruggewonnen DNA op basis van grootte te scheiden.Vervolgens worden de banen uitgesneden en horizontaal opnieuw gegoten in een tweede gel, die het DNA verder scheidt op basis van zowel grootte als vorm. Ten slotte wordt Southern-analyse gebruikt om de DNA-structuren te visualiseren die geassocieerd zijn met replicerende DNA-fragmenten vóór en op verschillende tijdstippen na de introductie van UV-geïnduceerde schade. Uiteindelijk kan deze procedure worden gebruikt om aan te tonen dat het onvermogen om DNA-laesies te verwerken bij bepaalde mutanten resulteert in de accumulatie van DNA-reparatie-intermediairen.Hoi, mijn naam is Arthur Ian. Ik kom van het Corella Lab aan de Portland State University. Hoi, mijn naam is Brand she, ik kom ook van het Corella Lab.Vandaag tonen we u een procedure voor tweidimensionale gelelektroforese. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om DNA-replicatie- en reparatie-intermediairen te bestuderen. Laten we beginnen.Om deze procedure te starten, wordt een overnight-cultuur van 200 µL e coli gekweekt die het plasmide PBR 3 22 bevat in DGC thigh-medium met ampicilline bij 37 °C. Het gebruik van DGC thigh-medium minimaliseert UV-afscherming. Na de overnight-incubatie worden de cellen gepellet bij 14.000 RRP M gedurende 30 seconden.Resuspendeer vervolgens het celpellet in 200 µL DG C th-medium zonder ampicilline en inoculeer. Kweek culturen in 20 mL DG C thigh-medium zonder ampicillineselectie in een schudincubator bij 37 °C tot een OD 600 van 0,5, wat overeenkomt met ongeveer 5 × 10⁸ cellen per milliliter. Groei zonder ampicilline voorkomt selectie tegen abnormale of niet-productieve replicatie-intermediairen die in sommige mutanten kunnen voorkomen.Bovendien is het, indien UV-licht wordt gebruikt om schade op te wekken, noodzakelijk om de ampicilline uit het medium te verwijderen, omdat deze sterk absorbeert bij deze golflengten en zo een afscherming vormt. De cellen verminderen de effectieve dosis UV terwijl de cellen groeien. Gebruik een UVC-fotometer om de afstand tot een germicide lamp van 15 watt te bepalen die een blootstellingssnelheid van ongeveer één J/m² per seconde produceert.De volgende stappen moeten onder geel licht worden uitgevoerd om te voorkomen dat fotolyase de fotoreactivatie-omkering van cyclobutaan-pyrimideendimeren na UV-bestraling veroorzaakt. Zodra de gewenste celdichtheid is bereikt, wordt de cultuur met een pipet overgebracht naar een Petrischaal met een diameter van 15 centimeter op een draaiplateau om een gelijkmatige bestraling van de gehele celpopulatie te garanderen. Bestraal de culturen vervolgens met 50 joules per meter squared en breng ze onmiddellijk over in een steriele, voorverwarmde kolf en plaats deze terug in de schudincubator bij 37 degrees Celsius.Gedurende de experimentduur produceert deze dosis gemiddeld één cyclobutaan-pyrimidine-dimeer per 4,5 kilobasen enkelstrengs DNA voor elk tijdstip dat onderzocht moet worden. Pipetteer een aliquot van 0,75 milliliter van de cultuur in 0,75 milliliter ijskoud net 30-buffer. Net 30-buffer dient als stopbuffer die voorkomt dat replicatie en nucleotide-excisie-herstel plaatsvinden.Zodra de stopbuffer is toegevoegd, kan het monster op ijs bewaard worden tot het einde van de tijdreeks. Pelleteer na de tijdreeks elk monster en resuspendeer de pellets. Lyseer de cellen in 150 µL lysisbuffer gedurende 20 minuten bij 37 °C zonder agitatie.Omdat replicerende structuren met enkelstrengs regio's of vertakkingspunten vatbaarder zijn voor afschuiving, kunnen pipetpunten met een scheermesje worden afgeknipt om de opening te verbreden en afschuifkrachten te minimaliseren. In het algemeen moet pipetteren en agitatie tot een minimum worden beperkt totdat het DNA is gedigesteerd met restrictie-enzymen; voeg na lysis proteinase K en sarcas cell toe en laat de incubatie nog een uur voortduren. Dit dient om DNA-fragmenten die geassocieerd zijn met eiwit vrij te maken.Aangezien actief replicerend DNA vaak gebonden is aan eiwit- of membraancomplexen, helpt dit de opbrengst van replicatiefragmenten te verhogen. Extraheer na één uur de monsters door twee volumes fenol aan elk monster toe te voegen en de buisjes gedurende vijf minuten voorzichtig te keren. Voeg vervolgens twee volumes chloroform-isoamylalcohol toe en keer de buisjes nogmaals vijf minuten voorzichtig.Centrifugeer de monsters vervolgens gedurende vijf minuten bij 14, 000 RPM in een microcentrifuge en breng de bovenste waterige fase van elk monster over in een nieuw buisje. Voeg daarna vier volumes chloroform-isoalcohol toe en keer de buisjes opnieuw gedurende vijf minuten voorzichtig om. Centrifugeer de monsters opnieuw vijf minuten bij 14, 000 RPM.Plaats een dialysemembraan bovenop 250 milliliters van 0,1 xte in een bekerglas en breng 100 microliters van elk monster aan op het membraan. Laat de monsters één uur dialyseren. Breng 80 microliters van elk monster over in een schone 1,5 milliliter buis die 20 microliters enzymmix bevat.Verteer de monsters een nacht lang bij 37 °C. PV two lineariseert het plasmide net stroomafwaarts van de replicatie-oorsprong. Voeg vóór het laden van de agarosegel 100 µL chloroform en 20 µL zes x laadkleurstof met broom toe.Voeg fenolblauw en xyleen-cyaan toe aan elk monster en meng; chloroform verwijdert alle resterende PV2 die aan de DNA-uiteinden is gebonden. Begin de tweedimensionale agarosegelanalyse door de restrictie-digestere DNA-monsters door de eerste dimensie te laten lopen. Laad eerst een Lambda HindIII-sizemarker in de eerste baan van een vooraf bereide 0,4% agarosegel in 1x TBE.Laad vervolgens 40 µL van de waterige fase met de laadkleurstof voor elk monster, waarbij lanes worden overgeslagen om het snijden van de gel te vergemakkelijken. Voer na de elektroforese de eerste dimensie uit bij één volt per centimeter gedurende ongeveer 12 tot 15 uur. De lage spanning en het lage percentage AGROS-gel dienen om de DNA-fragmenten primair op basis van grootte te scheiden.Nadat de eerste dimensie is voltooid, gebruikt u een groot slagmes om de eerste baan die de Lambda Hind III-marker bevat uit te snijden en kleurt u deze met ethidiumbromide. Snijd voor de tweede dimensie de gelbanen uit met het grote slagmes, waarbij u de Lambda Hind III-marker als richtlijn gebruikt; snijd het gebied onder de verwachte positie van het gelineariseerde plasmide in elke baan weg en gooi dit weg. Om de tweede dimensie te gieten, plaatst u elke strip horizontaal bovenop een lege gelvorm.Bereid een oplossing van 1%AROS in één XTBE voor en koel deze af tot 55 °C. Giet de geloplossing na het afkoelen om de tweede dimensie te gieten, waarbij u ervoor zorgt dat de gelplakjes volledig bedekt zijn. Het is belangrijk om te controleren of de plakjes gelijkmatig georiënteerd zijn en of de gietvorm waterpas staat voordat de gel wordt gegoten.Zodra de gel is gestold, wordt de tweede dimensie uitgevoerd gedurende vijf en een halve tot zeven uur bij 6,5 V per centimeter in een elektroforesee-unit die recirculatie van de buffer mogelijk maakt; de hoge spanning en het hoge percentage Agros-gel scheiden de DNA-fragmenten effectief op basis van zowel hun vorm als hun grootte. Niet-lineaire vormen migreren langzamer door de tweede dimensie na de elektroforese. Spoel de gel eenmaal met water en was deze vervolgens twee keer gedurende 15 minuten met zachte agitatie in 400 milliliter 0,25 molair zoutzuur.De zuurwassingen dienen om de DNA-moleculen gedeeltelijk in kleinere fragmenten te knippen die efficiënter overdragen tijdens de Southern-analyse; dit is noodzakelijk vanwege de grote omvang en de ongebruikelijke vorm van de DNA-replicatie-intermediairen. Om de gel voor alkalische overdracht voor te bereiden, spoelt u de gel opnieuw af met water en wast u deze vervolgens twee keer gedurende 30 minuten in 400 milliliters 0,4 molar natriumhydroxide. Het DNA in de gels wordt vervolgens overgebracht naar een high bond n plus nylonmembraan met behulp van een neerwaartse alkalische overdrachtssysteem met 0,4 molar natriumhydroxide, zoals beschreven in het geschreven gedeelte van deze procedure. Laat het DNA zes tot 12 uur overdragen; ga na de DNA-overdracht verder met de probe-hybridisatie zoals uiteengezet in het geschreven protocol.Zodra het membraan is geprobeerd en gewassen, wordt het membraan op een papieren handdoek geplaatst totdat de vloeistof zichtbaar is verdwenen. Wikkel het membraan vervolgens in polyvinylchloride-plasticfolie en stel het bloot aan een fosfor-imager-scherm. Ten slotte kan de radioactiviteit worden gevisualiseerd en gekwantificeerd met behulp van een storm eight 40 en de bijbehorende image quant.Het migratiepatroon van PV twee gedigesteerd PBR 3 22 plasmide, waargenomen via 2D agarosegelanalyse, is in het schema weergegeven. Niet-replicerende lineaire plasmiden migreren als lineaire 4.4 KB fragmenten; replicerende plasmidevormen vormen Y-vormige structuren die langzamer migreren dan de niet-replicerende fragmenten vanwege hun grotere omvang en niet-lineaire vorm. Dit migratiepatroon vormt een boog die na UV-bestraling vanuit het lineaire gebied richting de put uitstrekt.Dubbele Y- of X-vormige moleculen worden waargenomen in het conusgebied en migreren langzamer dan de boog van Y-vormige moleculen. Een voorbeeld van de zuidelijke analyse van de 2D-gel, gesonde met P 32-gelabeld PBR 3 22, wordt getoond voor cellen direct na UV-bestraling en 15 minuten na UV-bestraling direct na UV-bestraling. Ongeveer 1% van het totale plasma-DNA kan worden aangetroffen in de Y-boog wanneer cellen zich in een snelle exponentiële groeifase bevinden na bestraling.Een tijdelijke toename van Y-vormige moleculen wordt waargenomen wanneer geblokkeerde replicatievorken zich ophopen bij beschadigde sites. De L-vormige replicatie-intermediaten hopen zich ook tijdelijk op en blijven aanwezig tot een tijdstip dat correleert met het moment waarop de laesies worden hersteld. We hebben zojuist laten zien hoe DNA-reparatie-intermediaten gevisualiseerd kunnen worden met behulp van tweedimensionale gelelektroforese.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om rekening te houden met schuifkrachten die de opbrengst kunnen verminderen; wees daarom voorzichtig met alle monsters en gels. Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

visualization-uv-induced-replication-intermediates-e-coli-using-two

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol laat een eenvoudige single-molecule fluorescentie microscopie technieken voor het visualiseren van DNA-replicatie door individuele replisomes in real time.

Visualiseren van Single-molecule DNA-replicatie met fluorescentiemicroscopie

DT40, een model gewerveld genetisch systeem, biedt een krachtig hulpmiddel om eiwit functie te analyseren. Hier beschrijven we een eenvoudige methode die kwalitatieve analyse van de parameters die invloed hebben DNA-synthese in de S-fase in DT40-cellen op de single molecule-niveau mogelijk maakt.

Visualisatie van DNA-replicatie in de gewervelde Model Systeem DT40 met behulp van de DNA-Fiber Techniek

Source: Cayron, J., and Lesterlin, C. Multi-scale Analysis of Bacterial Growth Under Stress Treatments. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the procedure for assessing E. coli filamentation and DNA replication under cell division-inhibiting antibiotic treatment using plating to measure viability and flow cytometry to analyze cell size and DNA content.

Assessing Antibiotic-Induced Filamentation in E. coli Using Plating Assay and Flow Cytometry

Source: Mettrick, K. A., Lawrence, et al., Inducing a Site-Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates site-specific replication fork blockage in Escherichia coli using arabinose-induced expression of yellow fluorescent protein-tagged TetR that binds chromosomal tetO arrays.

Fluorescently Tagged Repressor Protein-Mediated Replication Blockage in Escherichia coli

Source: Bratton, B. P., et al., Three-dimensional Imaging of Bacterial Cells for Accurate Cellular Representations and Precise Protein Localization. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the method for acquiring and analyzing three-dimensional fluorescence images of bacterial cells to study protein organization at the single-cell level.

Visualizing Bacterial Protein Distribution in Three Dimensions by Fluorescence Imaging

Source: Philip, A. A., et al., Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the isolation of rotavirus double-stranded RNA from clarified cell lysates. It further illustrates the separation and visualization of genome segments through polyacrylamide gel electrophoresis.

Isolation and Visualization of Rotavirus Genome via Gel Electrophoresis

Fotogeactiveerde lokalisatie microscopie (PALM) in combinatie met single-molecule-tracking maakt directe observatie en kwantificering van eiwit-DNA-interacties in levende Escherichia coli cellen.

Visualiseren eiwit-DNA-interacties in levende bacteriële cellen met behulp Photoactivated Enkelmolecuul Tracking

We presenteren een strategisch plan en protocol voor het identificeren van niet-coderende genetische varianten die de binding van transcriptiefactoren (TF) aan DNA beïnvloeden. Er wordt een gedetailleerd experimenteel protocol gegeven voor elektroforetische mobiliteitsverschuivingsassay (EMSA) en DNA-affiniteitsprecipitatie-assay (DAPA) analyse van genotype-afhankelijke TF DNA-binding.

Screening voor Functionele niet-coderende genetische varianten Met behulp van Electroforetische Mobility Shift Assay (EMSA) en DNA-affiniteit Neerslag Assay (DAPA)

We beschrijven hier een systeem dat gebruikmaakt van een locatie-specifieke, omkeerbare in vivo eiwitblokkering om replicatievorken in Escherichia coli te stoppen en te laten instorten. De totstandkoming van de replicatieblokkering wordt geëvalueerd door middel van fluorescentiemicroscopie en neutrale-neutrale 2-dimensionale agarosegelelektroforese wordt gebruikt om replicatie-intermediaten te visualiseren.

Induceren van een Site Specific Replication Verstopping in<i&gt; E. coli</i&gt; Met behulp van een TL-repressor aandrijfsysteem

Hier schetsen we de procedure voor het analyseren van replicatieprogressie door pathogene, structuurgevoelige herhalingen met behulp van 2-dimensionale gelelektroforese.

Elektroforetische analyse van replicatie door middel van structuurgevoelige DNA-herhalingen binnen het op SV40 gebaseerde menselijke episoom

Leer twee-dimensionale agarose gel-analyse voor DNA-replicatieonderzoek in E. coli na UV-beschadiging. Deze methode maakt visualisatie van replicatie-intermediaten mogelijk.

Visualisatie van UV-geïnduceerde Replicatie Intermediates in E. coli Met behulp van twee-dimensionale Agarose gel-analyse

Meer video's verkennen