Enzyme-linked immunospot Assay (ELISPOT): Kwantificering van de Th-1 cellulaire immuunreacties tegen microbiële antigenen

Het algemene doel van deze procedure is het detecteren van T-celresponsen op antigenen van belang. Dit wordt bereikt door eerst te coaten met capture-antilichamen. De tweede stap van de procedure is het toevoegen van cellen en antigenen van belang, gevolgd door een incubatie gedurende de nacht.

De derde stap van de procedure is het toevoegen van detectie-antilichamen. De laatste stap van de procedure is het ontwikkelen van de plaat met substraatreagentia en het analyseren van de spots. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen voor de geselecteerde cytokinen van belang door analyse van de spot-forming units.

Hallo, mijn naam is dr. Ki Richter en ik ben onderzoeksinstructeur in het laboratorium van dr. Wonder Drake aan de Vanderbilt University in de afdeling Infectieziekten. Vandaag demonstreren we de ELISpot-techniek, ook bekend als de enzyme linked immuno spot assay. Dr. Isfahan Chambers en Tiffany Cone zullen de techniek vandaag aan u demonstreren.

Om de standaarden voor celcultuur te handhaven, dienen de handelingen onder steriele omstandigheden in de zuurkast te worden uitgevoerd; open een ally spot plate en was deze drie keer met PBS. Bereid een coatingoplossing van het capture-antilichaam in PBS. Meng dit voor het gemak goed door middel van vortexen.

Overbreng de antilichaamoplossing naar een reservoir voor de multichannelpipet en pipetteer 100 µL van de coatingoplossing in elke well. Sluit de plaat af met Parafilm en plaats deze gedurende de nacht in een koelkast. Deze met antilichamen gecoate platen blijven wekenlang bruikbaar.

De vuistregel is dat een plaat gebruikt kan worden als er nog vloeistof in de wells aanwezig is. Om de cellen voor deze assay voor te bereiden, kleuren vers geïsoleerde perifere mononucleaire bloedcellen met tryaanblauw voor de levensvatbaarheid en tellen deze. Zaai de PBMC uit op 2 miljoen cellen per milliliter in 10 media en incubeer deze gedurende de nacht bij 37 °C met 5% CO2. Om het overzicht over het experiment te bewaren, labelt u het deksel van de Ali spot plate met het identificatienummer van het monster, de well-condities en de datum.

Was de plaat zes keer met steriele PBS met behulp van de dump-and-blot-methode. Let erop dat u de plaat niet bespat tijdens het legen, omdat dit ertoe kan leiden dat de wells van de plaat paars kleuren. Voeg 20 µL medium toe aan elke well en incubeer de plaat gedurende één uur bij 37 °C.

Terwijl de plaat incubeert, telt u de cellen die gedurende de nacht zijn gerust. Oogst de pbmc door middel van centrifugatie. Schenk het supernatant af en resuspendeer het pellet in 10 media bij een concentratie van 1 miljoen cellen per milliliter.

Verwijder na de incubatie van één uur van de ally spot plate het R 20-medium met de dump-and-blot-methode. Let erop dat u de plaat niet bespat tijdens het legen. Voeg vervolgens 100 µL celсусpensie toe aan elk putje.

Volg het experimentele ontwerp door peptiden en antigenen toe te voegen aan de overeenkomstige testputjes. Neem altijd een negatieve controle mee van cellen zonder peptiden en gebruik tevens positieve controleputjes waaraan fytohemagglutinine is toegevoegd. Incubeer de plaat overnacht bij 37 °C met 5% carbon dioxide.

Was de plaat zes keer met 150 µL XPBS met behulp van de dump-and-blot-methode. Voeg 100 µL PBS toe aan elke well van de plaat en plaats de plaat gedurende 15 minuten in de koelkast of bij kamertemperatuur. Bereid ondertussen de biotinyleringsantilichaamoplossing in PBS.

Haal de ALI-spotplaat uit de koelkast en verwijder de PBS door deze in de afvalbak te schudden. Let erop dat de plaat niet bespat wordt terwijl u een aliquot van de biotinyl-antilichaamoplossing in elke put aanbrengt en incubeer de plaat in de weefselkweekkap bij kamertemperatuur gedurende één uur. Was de plaat zes keer met PBS, waarbij bij de laatste wasbeurt de dump-and-blot-methode wordt gebruikt.

Laat de PBS nu op de plaat achter. Bereid de STREPTAVIDIN-antilichaamoplossing in PBS voor en zorg ervoor dat de oplossing wordt gevortext om deze te mengen. Verwijder de laatste PBS-wasbeurt uit de wells en plot de ALI-spotplaat.

Voeg streptavidine-antilichaamoplossing toe aan elke well en incubeer de plaat in de weefselkweekkast bij kamertemperatuur gedurende één uur. Om overtollig streptavidine-antilichaam te verwijderen, wordt de plaat zes keer gewassen met PBS met behulp van de dump-and-blot-methode; laat bij de laatste wasbeurt de PBS op de plaat achter. Gezien de lichtgevoeligheid van de B-C-I-P-M-B-T alkalische fosfatase-substraatoplossing.

Werk in het donker bij het bereiden van de stikstofoplossing, zoals beschreven door de fabrikanten in de instructies van de alkalische fosfatase-substraatkit; verwijder het resterende PBS uit de putjes en dep de ly spot plate droog. Voeg substraatoplossing toe aan elk putje en zet het licht aan. Laat de kleuren vijf tot 10 minuten ontwikkelen en laat de reagentia op de plaat blijven totdat de spots paars beginnen te worden en vrij donker zijn.

Dit duurt tot 20 minuten. Was de Ali spot plate drie keer met kraanwater en laat deze aan de lucht drogen. Elke plaat bevat een positieve controle, een negatieve controle en het peptide van belang, uitgevoerd in ten minste dubbele bepalingen.

De putjes van de positieve controle hebben een dieppaarse kleur, wat duidt op een confluente cellaag en nauwelijks een witte achtergrond. De putjes van de negatieve controle hebben, zoals verwacht, geen paarse achtergrond en geen vlekken. De putjes met de testmonsters illustreren hier de cellulaire respons op microbiële peptiden.

De paarse stippen vertegenwoordigen een enkele responsieve cel die het cytokine van belang tot expressie brengt bij het uitvoeren van de LA-spottechniek. Wees voorzichtig om het membraan niet met de pipetpunten te doorprikken of de plaat uit te laten drogen, omdat dit zal leiden tot een hoge achtergrond.