Name: Enzyme-linked immunospot Assay (ELISPOT): Kwantificering van de Th-1 cellulaire immuunreacties tegen microbiële antigenen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-23T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: Leer de ELISPOT-methode om T-celreacties op microbiële antigenen te detecteren en te kwantificeren. Deze techniek helpt onderzoekers bij het begrijpen van adaptieve immuniteit in idiopathische ziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Mede ondersteund door Vanderbilt CTSA subsidie ​​1 UL1 RR024975 van het National Center for Research Resources, National Institutes of Health. Dit werk werd gefinancierd door NIH R01 HL 83839; R01 AI 65.744.

Voor de volgende protocol maken we gebruik van perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) als de cellen van belang. Dit kan echter protocol worden gebruikt met andere celtypen. Voer de test in een weefselkweek kap met steriele techniek. Dag 1: Voorbereiding van Plate en cellen <ol><li> Neem een ​​ELISPOT bord en open het in de motorkap. </li><li> Was de plaat 3 maal met 150 ul van 1X PBS met behulp van een multichannel pipet, indien beschikbaar, anders een goed pipetteren aanvaardbaar is. </li><li> Neem een ​​pakket van reservoirs en open het in de motorkap. </li><li> Voeg 2 ug / ml van de capture antilichaam, anti-humaan interferon-γ, tot 11 ml van 1X PBS. Vortex goed. Overdracht antilichaam meng tot een reservoir. </li><li> Plaats 100 pl van de coating oplossing in elk putje met behulp van de meerkanaals. </li><li> Wikkel de plaat in parafilm. </li><li> Plaats de plaat in de koelkast overnachten. De platen zijn goed voor weken. De vuistregel is dat als er nog vloeistof die overblijft in de putten, de plaat kan worden gebruikt. </li></ol> Celpreparaat Als de PBMC's vers zijn dan de telling van de cellen en incubeer overnacht bij 37 ° C met 5% CO 2. Voor de PBMC opgeslagen in vloeibare stikstof, ontdooien van de cellen nodig is. Het protocol is als volgt: <ol><li> Ontdooi de cryovial van cellen in 37 ° C waterbad tot bijna helemaal ontdooid. </li><li> Onmiddellijk opnieuw in suspensie in 5 ml van de R10 media. </li><li> Spin gedurende 5 minuten bij 225 x g. </li><li> Resuspendeer weer in 5 ml R10 media en tel de levensvatbare cellen met behulp van trypan blauw. </li><li> Breng concentratie 2 x 10 6 cellen / ml in R10 media. </li><li> Rust 's nachts bij 37 ° C met 5% CO 2. </li></ol> Dag 2: Opstarten van de Plate <ol><li> Label plaat deksel met het monster identificatienummer, goed omstandigheden, en de datum. </li><li> Was de plaat 6 keer met 150 ul van steriele 1x PBS met behulp van de dump en de blot-methode. Wees voorzichtig niet om de plaat te spatten tijdens het dumping. Dit kan ertoe leiden dat de putjes van de plaat te draaien paars. </li><li> Voeg 100 ul van R20 aan elk putje. </li><li> Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Terwijl de plaat is incuberen, tel de cellen die 's nachts werden uitgerust. </li><li> Spin de celsuspensie bij 1500 rpm gedurende 5 minuten. Giet het supernatant en resuspendeer de pellet, zodat je een uiteindelijke concentratie van 1x10 6 cellen per 1 ml in R10 media. </li><li> Na 1 uur incubatie, verwijder de R20 met de dump en de blot-methode. Wees voorzichtig niet om de plaat te spatten tijdens het dumping. </li><li> Voeg 100 ul van cel-oplossing (10 5 cellen) aan elk putje. Voeg het juiste peptiden en / of antigenen om de corresponderende putten in tweevoud. Gebruik een nieuwe pipettip elke keer dat je in de peptide-werkende oplossing. Normale peptide concentratie is 10-40 ug / ml. Sinds peptiden verschillen, moet iedere onderzoeker titreren peptiden om optimale resultaten te verkrijgen. </li><li> In de negatieve controle putten, alleen maar cellen (geen peptiden) </li><li> In de positieve controle putten, toe te voegen fytohemagglutinine (PHA, 10 ug / ml; Sigma). </li><li> Incubeer overnacht bij 37 ° C met 5% CO 2 (~ 18 uur). </li></ol> Dag 3: Ontwikkeling van de Plaat <ol><li> Was de plaat 6 keer met 150 pi 1xPBS het gebruik van de dump en de blot-methode. </li><li> Voeg 100 ul PBS aan elk putje van de plaat met behulp van de multichannel pipet. </li><li> Zet de plaat in de koelkast gedurende 15 minuten. </li><li> Haal de plaat uit de koelkast en plaats deze in de weefselkweek kap. </li><li> Bereid de biotine antilichaamoplossing <ul><li> Voeg 0,5 ug / ml van biotine antilichamen (MAB 7-B6-1) tot 11ml PBS. </li><li> Vortex de oplossing om goed te mengen. </li><li> Als u van plan om de oplossing toe te voegen met behulp van een multichannel, giet het in een reservoir. </li></ul></li><li> Gooi de PBS door flicking het in de prullenbak. Wees voorzichtig niet om de plaat te spatten tijdens het dumping. </li><li> Plaats 100 pi van de oplossing in elk putje. </li><li> Incubeer de plaat in de weefselkweek kap bij kamertemperatuur gedurende een uur. </li><li> Was de plaat 6 keer met 150μL 1xPBS het gebruik van de dump en de blot-methode. Op de 6 e wassen, laat het PBS op de plaat tot u bereid de Streptavidine antilichaam. </li><li> Bereid de Streptavidine antilichaam. <ul><li> Voeg 5,5 μ l Streptavidine antilichaam (streptavidine-ALP) naar 11ml PBS (1:2000 verdunning). </li><li> Vortex de oplossing om goed te mengen. </li><li> Als u van plan om de oplossing toe te voegen met behulp van een multichannel, giet het in een reservoir. </li></ul></li><li> Gooi de PBS die nog in de putten en dep de plaat. </li><li> Voeg 100 ul van Streptavidine oplossing voor elk putje. </li><li> Incubeer de plaat in de weefselkweek kap bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. </li><li> Spoel de platen 6 keer met PBS met behulp van de dump en de blot-methode. Op de 6 e wassen, laat het PBS op de plaat totdat je hebt gemaakt van de kleur oplossing. </li><li> Werken in het donker. De voorbereiding van de alkalische fosfatase substraat oplossing (alkalische fosfatase Substrate Kit IV BCIP / NBT): <ul><li> Voeg 4 druppels substraat Reagens 1 tot 11 ml Tris-buffer, vortex goed. Voeg 4 druppels van substraat reagens 2 tot en met Tris-buffer, vortex goed. Voeg 4 druppels van substraat reagens 3 tot en met Tris-buffer, vortex goed. </li></ul></li><li> Gooi de resterende PBS en dep de plaat. </li><li> Voeg 100 ul van de kleur-oplossing in elk putje van de plaat met behulp van de multichannel. </li><li> Doe het licht aan na 5 tot 10 minuten van kleur te ontwikkelen. </li><li> Laat de kleur reagentia te blijven op het bord tot aan de vlekken beginnen te draaien paars en zijn heel donker. Dit moet ergens van 5 tot 20 minuten. Wees voorzichtig niet aan de ondergrond oplossing te laten staan ​​te lang, want dit kan hoge achtergrond veroorzaken. </li><li> Was de ELISPOT plaat 3 maal met kraanwater. </li><li> Laten drogen voor ongeveer een uur of 's nachts. </li><li> Lees plaat manueel of met ELISPOT plaat lezer. </li><li> Bewaar de plaat in een doos uit de buurt van blootstelling aan licht. </li></ol> Representatieve resultaten: ELISPOT is ontworpen om immuunrespons kwantificeren tegen microbiële antigenen. Elke plek markeert een afzonderlijke responsieve cel, de uiting van de cytokine van belang. De vlekken kunnen handmatig of met behulp van een ELISPOT plaat lezer worden geteld. Beoordeling dat de ELISPOT correct is uitgevoerd zou moeten beginnen met het onderzoek van de negatieve controle voor de achtergrond de productie van het cytokine van belang. In de negatieve controle putten men zou verwachten dat geen vlekken te zien, hoewel een beetje achtergrond (paarse kleur) aanwezig kunnen zijn. Normaal gesproken, zou er minder dan een gemiddelde van vijf spots per goed. De positieve controle putten te bevestigen dat de reactie correct is uitgevoerd en dat de cellen reageren op antigene stimulatie. In de positieve controle wells je zou verwachten dat een diep paarse achtergrond te wijten aan een samenloop van spots (Afb. 1) te zien. Er moeten weinig tot geen witte achtergrond. Als de positieve controle en negatieve controlemonsters geschikt zijn, kan men dan tellen de putten met het antigeen van belang. Een "niet optimaal" resultaat zou worden weerspiegeld door de hoge achtergrond (de putten zijn paars), geen vlekken of zeer weinig vlekken, leeg centrum, slecht gedefinieerde plekken of confluent vlekken. Een lijst met tips wordt voorzien (tabel 1). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/2221/2221fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Een vertegenwoordiger van ELISPOT plaat. Elke plaat moet een positieve controle, negatieve controle en peptide van interesse uitgevoerd op het minimum in twee putten. C9, C10, D9 en D10 zijn de positieve controle putten, zoals je kunt zien is er een diep paarse kleur, samenvloeiende cellen en nauwelijks een witte achtergrond. De negatieve controle putten zijn G11, G12, H11 en H12. Deze putten hebben geen paarse achtergrond en geen vlekken zoals verwacht. De vlekken G7, G8, H7 en H8, illustreren cellulaire reacties op microbiële peptiden, de paarse vlekken vormen een reagerende cel die het cytokine van belang. Tabel 1 <table border="1"><tbody><tr><td> Observatie </td><td> Mogelijk probleem </td><td> Mogelijke oplossing </td></tr><tr><td> Hoge achtergrond </td><td> 1. Beide zijden van membraan niet goed gewassen 2. Te veel cellen afscheiden cytokine 3. Plaat niet gedroogd goed 4. Over ontwikkelde plaat </td><td> 1. Was beide zijden van het membraan met gedestilleerd water voor en na de kleur ontwikkeling. Reagentia kunnen lekken door het membraan in de basis van de plaat, en deze kunnen hoge achtergrond veroorzaken als niet weggespoeld. 2. Vermindering van het aantal cellen per well, zal dit vereisen optimalisatie 3. Droog de plaat langer voordat het lezen van 4. Verminderen het ontwikkelen van de tijd </td></tr><tr><td> Geen vlekken / Zeer weinig Spots </td><td> 1. Niet genoeg cellen afscheiden cytokine / eiwit van belang 2. Zorg ervoor dat de cellen juist gestimuleerd 3. Cellen die niet geïncubeerd long genoeg of kan de tijd nemen om te reageren op stimulerende 4. Onvoldoende kleurontwikkeling 5. Niet genoeg primaire of secundaire antilichaam </td><td> 1. Verhoog het aantal cellen. Dit vereist optimalisatie 2. Gebruik ook een positieve stimulans controle - een stimulerend middel dat je weet dat expressie van je cytokine / eiwit van belang veroorzaken 3. Verhoog de cel incubatietijd of gebruik de indirecte methode (pre-behandelen cellen met stimulerende) 4. Monitor kleurontwikkeling met een overhead microscoop en ervoor te zorgen dat de zich ontwikkelende reagentia correct zijn opgeslagen en zijn niet verloren activiteit 5. Concentratie van de primaire en / of secundaire antilichaam zal moeten worden verhoogd. Dit vereist optimalisatie. </td></tr><tr><td> Lege Gebieden </td><td> 1. Membraan niet voorbehandeld 2. Membraan droog is op enig moment 3. Cellen ongelijk verdeeld </td><td> 1. Zorg ervoor dat membraan is voldoende voorbehandeld met 70% ethanol (alle membranen dit niet nodig dus contact op met uw leverancier). Goed te wassen met PBS 3X achteraf 2. Zorg ervoor dat membraan niet droog 3. Zorg ervoor dat u voorzichtig mengen de cellen om een ​​goede homologe celsuspensie hebben voordat pipetteren uit in de putten </td></tr><tr><td> Blanco Center </td><td> 1. Schade door het wassen </td><td> 1. Debiet op de automatische wasmachine (of pipetteren) kan te hoog zijn. Behoefte aan een meer zachte wasprocedure </td></tr><tr><td> Valse positieven </td><td> 1. Secundair antilichaam aggregaten 2. Cellen nog op het membraan 3. Celcultuur verontreiniging </td><td> 1. Filter het secundaire antilichaam 2. Zorg ervoor dat alle cellen worden gewassen van het membraan met PBS Tween 20 voor de secundaire antilichaam incubatie. Cellen links op het membraan zal geven onregelmatig gevormde vlekken 3. Houden reagentia zo steriel en schoon mogelijk. Zorg ervoor dat uw celcultuur techniek aseptische is. Controleren op valse positieven door het uitvoeren van een media-negatieve controle. Voor de plaat beweging, <a href="http://www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&amp;rid=11457#7">zie de slecht gedefinieerde plekken</a> </td></tr><tr><td> Confluent Spots </td><td> 1. Slechte coating, te veel antilichaam 2. Langdurige celcultuur 3. Cellen over-gestimuleerde </td><td> 1. Het primaire antilichaamconcentratie 2. Hoe langer de cellen worden geïncubeerd, des te meer cytokine / eiwit ze zullen afscheiden. Dit zal resulteren in grotere vlekken die zal beginnen samen te voegen en niet te onderscheiden te worden. 3. Verminder celcultuur stap incubatietijd. Over-stimulatie zal resulteren in een veel cytokine / eiwit wordt afgescheiden door de cel. Dit zal plekjes die zal beginnen samen te voegen en niet te onderscheiden te worden. Verminder de hoeveelheid van stimulantia in de cultuur media of de cultuur voor een kortere tijd </td></tr><tr><td> Slecht gedefinieerd Spots </td><td> 1. Membraan niet voorbehandeld (indien uw membraan dit vereist, contact op met de leverancier) 2. Plaatbeweging tijdens de celdeling incubatie </td><td> 1. Het membraan moet worden voorbehandeld met ethanol of dit kan leiden tot vage, slecht gedefinieerd plekken. Het zal moeilijk zijn voor de lezer om deze te onderscheiden 2. Sta niet toe dat de plaat te bewegen tijdens de celdeling incubatie als cellen die zijn verhuisd zal meer dan een plek te creëren. Indien mogelijk gebruik maken van een speciale couveuse die niet zal worden geopend tijdens de incubatie. Tik niet op de plaat na het toevoegen van cellen </td></tr><tr><td> Positieve controle putten is laag </td><td> 1. Onderontwikkeling - kan een gevolg van het gebruik Streptavidine-ALP en / of BCIP / NBT oplossingen die niet zijn op kamertemperatuur gebracht worden </td><td> 1. Breng reagentia op kamertemperatuur voordat u aan de wells </td></tr><tr><td> Dichtheid van de spots is het moeilijk te kwantificeren </td><td> 1. Te veel cellen werden toegevoegd aan de wells </td><td> 1. Maak verdunningen van cellen (dat wil zeggen, 1 x 10 6, 5 x 10 5, 1 x 10 5, 5 x 10 4, 1 x 10 4 cellen per well) om het optimale aantal cellen die zal resulteren in de vorming van verschillende plekken te bepalen </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Dosanjh, D. P., Hinks, T. S., Innes, J. A., Deeks, J. J., Pasvol, G., Hackforth, S., Varia, H., Millington, K. A., Gunatheesan, R., Guyot-Revol, V., Lalvani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+diagnostic+evaluation+of+suspected+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Improved diagnostic evaluation of suspected tuberculosis.</a> Ann Intern Med. 148, 325-336 (2008).</li>
<li>Sung, H. K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+abdominal+tuberculosis+by+T-cell+based+assays+on+peripheral+blood+and+peritoneal+fluid+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infection%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of abdominal tuberculosis by T-cell based assays on peripheral blood and peritoneal fluid mononuclear cells.</a> Journal of Infection. 59, 409-415 (2009).</li>
<li>Kim, S. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+Central+Nervous+System+Tuberculosis+by+T-Cell-Based+Assays+on+Peripheral+Blood+and+Cerebrospinal+Fluid+Mononuclear+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Vaccine+Immunology%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of Central Nervous System Tuberculosis by T-Cell-Based Assays on Peripheral Blood and Cerebrospinal Fluid Mononuclear Cells.</a> Clinical and Vaccine Immunology. , 1356-1362 (2008).</li>
<li>Drake, W. P., Dhason, M. S., Nadaf, M., Shepherd, B. E., Vadivelu, S., Hajizadeh, R., Newman, L. S., Kalams, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+recognition+of+Mycobacterium+tuberculosis+ESAT-6+and+KatG+peptides+in+systemic+sarcoidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Cellular recognition of Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 and KatG peptides in systemic sarcoidosis.</a> Infect Immun. 75, 527-530 (2007).</li>
<li>Allen, S. S., Evans, W., Carlisle, J., Hajizadeh, R., Nadaf, M., Shepherd, B. E., Pride, D. T., Johnson, J. E., Drake, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+dismutase+A+antigens+derived+from+molecular+analysis+of+sarcoidosis+granulomas+elicit+systemic+Th-1+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Res%22%5BJournal%5D)">Superoxide dismutase A antigens derived from molecular analysis of sarcoidosis granulomas elicit systemic Th-1 immune responses.</a> Respir Res. 25, 36-36 (2008).</li>
<li>Mutsvangwa, J., Millington, K. A., Chaka, K., Mavhudzi, T., Cheung, Y. B., Mason, P. R., Butterworth, A. E., Corbett, E. L., Lalvani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+recent+Mycobacterium+tuberculosis+transmission+in+the+setting+of+high+HIV+and+TB+burden%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Identifying recent Mycobacterium tuberculosis transmission in the setting of high HIV and TB burden.</a> Thorax. 65, 315-320 (2010).</li>
<li>Streeck, H., Frahm, N., Walker, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+IFN-gamma+Elispot+assay+in+HIV+vaccine+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The role of IFN-gamma Elispot assay in HIV vaccine research.</a> Nat Protoc. 4, 461-469 (2009).</li>
<li>Chaudhary, N., Staab, J. F., Marr, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Healthy+human+T-Cell+Responses+to+Aspergillus+fumigatus+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Healthy human T-Cell Responses to Aspergillus fumigatus antigens.</a> PLoS One. 5, e9036-e9036 (2010).</li>
<li>Manigold, T., Mori, A., Graumann, R., Llop, E., Simon, V., Ferr, S. M., Valdivieso, F., Castillo, C., Hjelle, B., Vial, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+differentiated%2C+resting+gn-specific+memory+CD8%2B+T+cells+persist+years+after+infection+by+andes+hantavirus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Highly differentiated, resting gn-specific memory CD8+ T cells persist years after infection by andes hantavirus.</a> PLoS Pathog. 6, e1000779-e1000779 (2010).</li>
<li>Ndongala, M. L., Kamya, P., Boulet, S., Peretz, Y., Rouleau, D., Tremblay, C., Leblanc, R., Côté, P., Baril, J. G., Thomas, R., Vézina, S., Boulassel, M. R., Routy, J. P., Sékaly, R. P., Bernard, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+function+of+HIV-specific+T-cell+responses+with+increasing+time+from+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Viral+Immunol%22%5BJournal%5D)">Changes in function of HIV-specific T-cell responses with increasing time from infection.</a> Viral Immunol. 2, 159-168 (2010).</li>
</ol>

De ELISPOT assay heeft ontpopt als een van de belangrijkste en meest gebruikte testen om te controleren immuunrespons bij de mens en een verscheidenheid aan andere soorten. Met de ELISPOT-test, kan het immuunsysteem cel frequenties worden gemeten aan de enkele cel niveau zonder uitbreiding of manipulatie van celpopulaties. ELISPOT test is op grote schaal toegepast om antigeen specifieke immuunrespons te onderzoeken in verschillende ziekten, waaronder infecties, kanker, allergieën en auto-immuunziekten. De toepassing van...

A. Bereiding van Media <img src="/files/ftp_upload/2221/2221materialsA.jpg" alt="Materialen Een"> B. Bereiding van Tris buffer <ol><li> Voeg 800 ml van DDH 2 O tot en met 1 L beker. </li><li> Maatregel 12 gram Tris en toe te voegen aan de beker. </li><li> Voeg 0,12 gram magnesium hexahydraat (MgCl 2: 6H 2 O) in de beker. </li><li> Roer met magnetische roerstaaf op de automatische roeren plaat. </li><li> Eenmaal opgelost, de pH van de oplossing tot 9,5. </li><li> Voeg 200 ml van DDH 2 O in het bekerglas, waardoor het tot 1000mL. </li><li> Filtreer de oplossing met een 0,22 urn filter. </li></ol> C. Materialen nodig voor ELISPOT analyse: <img src="/files/ftp_upload/2221/2221materialsb.jpg" alt="Materiaal B">

enzyme-linked immunospot assay (elispot): kwantificering van de th-1 cellulaire immuunreacties tegen microbiële antigenen

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Adaptive immuniteit is een belangrijk onderdeel van de klaring van intracellulaire pathogenen. De mogelijkheid om te detecteren en kwantificeren van deze reacties bij de mens is een belangrijk diagnostisch hulpmiddel. Het enzym-linked immunospot assay (ELISPOT) wint aan populariteit om zijn vermogen om cellulaire immuunresponsen te identificeren tegen microbiële antigenen, waaronder immuunsysteem populaties zoals die met HIV-infectie, transplantatie, en het gebruik van steroïden. Deze test heeft de capaciteit om de immuunrespons tegen specifieke microbiële antigenen, evenals onderscheiden of deze reacties zijn Th1 of Th2 van karakter te kwantificeren. ELISPOT is niet beperkt tot de plaats van de ontsteking. Het is veelzijdig in zijn vermogen om te beoordelen voor de immuunrespons in het perifere bloed, maar ook als gebieden van actieve betrokkenheid, zoals bronchoalveolaire lavage, cerebrospinale vloeistof, en ascites. Detectie van immuunresponsen gericht tegen een of meerdere antigenen is mogelijk, evenals specifieke epitopen binnen de microbiële eiwitten. Deze test maakt detectie van immuunreacties in de tijd, evenals verschillen in antigenen herkend door gastheer T-cellen. Tweekleurige ELISPOT-tests zijn beschikbaar voor de detectie van gelijktijdige expressie van twee cytokines. Recente toepassingen voor deze techniek onder de diagnose van extrapulmonale tuberculose, evenals onderzoek naar de bijdrage van besmettelijke antigenen aan auto-immuunziekten.

Identificatie van microbiële doelstellingen van adaptieve immuniteit in idiopathische ziekte kan worden bewerkstelligd door het gebruik van het enzym-linked immunospot assay.

Enzyme-linked immunospot Assay (ELISPOT): Kwantificering van de Th-1 cellulaire immuunreacties tegen microbiële antigenen

Adaptieve immuniteit is een belangrijk onderdeel van de klaring van intracellulaire pathogenen. Het vermogen om deze responsen bij mensen te detecteren en te kwantificeren is een ...

Het algemene doel van deze procedure is het detecteren van T-celresponsen op antigenen van belang. Dit wordt bereikt door eerst te coaten met capture-antilichamen. De tweede stap van de procedure is het toevoegen van cellen en antigenen van belang, gevolgd door een incubatie gedurende de nacht.De derde stap van de procedure is het toevoegen van detectie-antilichamen. De laatste stap van de procedure is het ontwikkelen van de plaat met substraatreagentia en het analyseren van de spots. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen voor de geselecteerde cytokinen van belang door analyse van de spot-forming units.Hallo, mijn naam is dr. Ki Richter en ik ben onderzoeksinstructeur in het laboratorium van dr. Wonder Drake aan de Vanderbilt University in de afdeling Infectieziekten. Vandaag demonstreren we de ELISpot-techniek, ook bekend als de enzyme linked immuno spot assay. Dr. Isfahan Chambers en Tiffany Cone zullen de techniek vandaag aan u demonstreren.Om de standaarden voor celcultuur te handhaven, dienen de handelingen onder steriele omstandigheden in de zuurkast te worden uitgevoerd; open een ally spot plate en was deze drie keer met PBS. Bereid een coatingoplossing van het capture-antilichaam in PBS. Meng dit voor het gemak goed door middel van vortexen.Overbreng de antilichaamoplossing naar een reservoir voor de multichannelpipet en pipetteer 100 µL van de coatingoplossing in elke well. Sluit de plaat af met Parafilm en plaats deze gedurende de nacht in een koelkast. Deze met antilichamen gecoate platen blijven wekenlang bruikbaar.De vuistregel is dat een plaat gebruikt kan worden als er nog vloeistof in de wells aanwezig is. Om de cellen voor deze assay voor te bereiden, kleuren vers geïsoleerde perifere mononucleaire bloedcellen met tryaanblauw voor de levensvatbaarheid en tellen deze. Zaai de PBMC uit op 2 miljoen cellen per milliliter in 10 media en incubeer deze gedurende de nacht bij 37 °C met 5% CO2. Om het overzicht over het experiment te bewaren, labelt u het deksel van de Ali spot plate met het identificatienummer van het monster, de well-condities en de datum.Was de plaat zes keer met steriele PBS met behulp van de dump-and-blot-methode. Let erop dat u de plaat niet bespat tijdens het legen, omdat dit ertoe kan leiden dat de wells van de plaat paars kleuren. Voeg 20 µL medium toe aan elke well en incubeer de plaat gedurende één uur bij 37 °C.Terwijl de plaat incubeert, telt u de cellen die gedurende de nacht zijn gerust. Oogst de pbmc door middel van centrifugatie. Schenk het supernatant af en resuspendeer het pellet in 10 media bij een concentratie van 1 miljoen cellen per milliliter.Verwijder na de incubatie van één uur van de ally spot plate het R 20-medium met de dump-and-blot-methode. Let erop dat u de plaat niet bespat tijdens het legen. Voeg vervolgens 100 µL celсусpensie toe aan elk putje.Volg het experimentele ontwerp door peptiden en antigenen toe te voegen aan de overeenkomstige testputjes. Neem altijd een negatieve controle mee van cellen zonder peptiden en gebruik tevens positieve controleputjes waaraan fytohemagglutinine is toegevoegd. Incubeer de plaat overnacht bij 37 °C met 5% carbon dioxide.Was de plaat zes keer met 150 µL XPBS met behulp van de dump-and-blot-methode. Voeg 100 µL PBS toe aan elke well van de plaat en plaats de plaat gedurende 15 minuten in de koelkast of bij kamertemperatuur. Bereid ondertussen de biotinyleringsantilichaamoplossing in PBS.Haal de ALI-spotplaat uit de koelkast en verwijder de PBS door deze in de afvalbak te schudden. Let erop dat de plaat niet bespat wordt terwijl u een aliquot van de biotinyl-antilichaamoplossing in elke put aanbrengt en incubeer de plaat in de weefselkweekkap bij kamertemperatuur gedurende één uur. Was de plaat zes keer met PBS, waarbij bij de laatste wasbeurt de dump-and-blot-methode wordt gebruikt.Laat de PBS nu op de plaat achter. Bereid de STREPTAVIDIN-antilichaamoplossing in PBS voor en zorg ervoor dat de oplossing wordt gevortext om deze te mengen. Verwijder de laatste PBS-wasbeurt uit de wells en plot de ALI-spotplaat.Voeg streptavidine-antilichaamoplossing toe aan elke well en incubeer de plaat in de weefselkweekkast bij kamertemperatuur gedurende één uur. Om overtollig streptavidine-antilichaam te verwijderen, wordt de plaat zes keer gewassen met PBS met behulp van de dump-and-blot-methode; laat bij de laatste wasbeurt de PBS op de plaat achter. Gezien de lichtgevoeligheid van de B-C-I-P-M-B-T alkalische fosfatase-substraatoplossing.Werk in het donker bij het bereiden van de stikstofoplossing, zoals beschreven door de fabrikanten in de instructies van de alkalische fosfatase-substraatkit; verwijder het resterende PBS uit de putjes en dep de ly spot plate droog. Voeg substraatoplossing toe aan elk putje en zet het licht aan. Laat de kleuren vijf tot 10 minuten ontwikkelen en laat de reagentia op de plaat blijven totdat de spots paars beginnen te worden en vrij donker zijn.Dit duurt tot 20 minuten. Was de Ali spot plate drie keer met kraanwater en laat deze aan de lucht drogen. Elke plaat bevat een positieve controle, een negatieve controle en het peptide van belang, uitgevoerd in ten minste dubbele bepalingen.De putjes van de positieve controle hebben een dieppaarse kleur, wat duidt op een confluente cellaag en nauwelijks een witte achtergrond. De putjes van de negatieve controle hebben, zoals verwacht, geen paarse achtergrond en geen vlekken. De putjes met de testmonsters illustreren hier de cellulaire respons op microbiële peptiden.De paarse stippen vertegenwoordigen een enkele responsieve cel die het cytokine van belang tot expressie brengt bij het uitvoeren van de LA-spottechniek. Wees voorzichtig om het membraan niet met de pipetpunten te doorprikken of de plaat uit te laten drogen, omdat dit zal leiden tot een hoge achtergrond.

enzyme-linked-immunospot-assay-elispot-quantification-th-1-cellular

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Het karakteriseren van T-cel-epitopen van pathogenen die lokale infecties veroorzaken, zoals het humaan papillomavirus, is een uitdaging vanwege het beperkte aantal circulerende T-cellen. Er wordt een methode beschreven waarbij zeldzame T-cellen werden geïsoleerd en gekarakteriseerd, beginnend met een zeer klein aantal cellen.

Het gebruik van interferon-γ Enzyme-linked immunospot Assay om nieuwe T-cel epitopen van het humaan papillomavirus karakteriseren

This video demonstrates the use of the ELISpot assay to assess the function of antibody-secreting B cells, ASCs. The antibodies secreted by the ASCs interact with the membrane-bound polyclonal antibody fragments, which are detected by the enzyme-conjugated IgG or IgM antibodies. The colored spot produced in each well indicates the presence of the specific antibody's isotype, which correlates with the B cells' secretory activity.

Functional Assessment of Antibody-Secreting B Cells Using ELISpot Assay

Nieuwe generaties van functionele testen zoals gamma interferon (IFN-γ) ELISPOT, die cytokineproductie detecteren op enkele cel en bieden zowel kwantitatieve als kwalitatieve karakterisering van T cel responsen kunnen worden gebruikt om celgemedieerde immuunresponsen tegen varicella zoster beoordelen virus (VZV).

Ontwikkeling van een IFN-γ ELISpot Assay aan varicella-zoster virus-specifieke-cel gemedieerde immuniteit na transplantatie van navelstrengbloed

Lange-termijn gekweekte interferon-γ enzymgebonden immunospot assay wordt gebruikt als maat voor centraal geheugen responsen en correleert met beschermende anti-mycobacteriële vaccinresponsen. Met deze assay worden perifeer bloed mononucléaire cellen gestimuleerd met mycobacteriële antigenen en interleukine-2 voor 14 dagen, waardoor differentiatie en expansie van centrale geheugen T-cellen.

Toepassing van Lange-termijn gekweekte interferon-γ Enzyme-linked immunospot Assay voor het beoordelen van effector en geheugen T cel responsen in Vee

Menselijk perifeer bloed wordt vaak gebruikt voor de beoordeling van de humorale immuunrespons. Hier worden de methoden beschreven voor het isoleren van menselijke B-cellen uit perifeer bloed, het differentiëren van menselijke B-cellen in antilichaam (Ab)-secreterende B-cellen (ASC's) in cultuur en het tellen van het totale aantal IgM- en IgG-ASC's via een ELISpot-assay.

De isolatie, differentiatie en kwantificering van menselijk antilichaam-uitscheidende B-cellen uit bloed: ELISpot als functionele Uitlezing van humorale immuniteit

QA-1 (HLA-E in mens) behoort tot een groep van niet-klassieke grote histocompatibility complex 1b moleculen. Immunisatie met QA--1-bindende epitopes heeft aangetoond dat weefsel-specifieke immuunregulatie vergroten en verbeteren van verschillende auto-immuunziekten. Hierin beschrijven we een overlappende peptide bibliotheek strategie voor de identificatie van QA--1 epitopes in een eiwit.

Overlappende Peptide bibliotheek Qa-1 Epitopes in een proteïne in kaart

In deze paper beschrijven we een protocol karakteriseren T-afhankelijke en T-onafhankelijke immunoglobulin (Ig) isotype reacties in muizen met behulp van ELISA. Deze methode gebruikt alleen of in combinatie met stroom cytometry onderzoekers te identificeren van verschillen in de B-cel-gemedieerde Ig isotype reacties in muizen na T-afhankelijke en T-onafhankelijke antigeen immunisatie zal toestaan.

Karakterisering van zwezerik-afhankelijke en Thymus-onafhankelijke Immunoglobulin Isotype reacties in muizen met behulp van Enzyme-linked Immunosorbent Assay

De ontwikkeling van de interferon-gamma ELISpot assay voor cavia PBMCs kunt de karakterisatie van T-cel reacties in dit zeer relevant model voor het bestuderen van besmettelijke ziekten. Wij hebben de test voor het meten van de T cel reacties gekoppeld intradermale levering van vaccin dat DNA toegepast.

Geoptimaliseerde Interferon-gamma ELISpot Assay maatregel T cel antwoorden in het Model van de cavia na vaccinatie

Hier presenteren we een protocol voor de ex vivo kwalitatieve detectie van antigeen-specifieke CD8+ T cellen. Analyse is mogelijk met eencellige schorsingen van organen of van kleine hoeveelheden bloed. Een breed scala van studies vereisen de analyse van de reacties van de cytotoxische T-cel (vaccinatie en kanker immunotherapie studies).

Gelijktijdige kwantificering van anti-vector en Anti-transgenic-specifieke CD8+ T cellen Via MHC ik tetrameer kleuring na vaccinatie met een virale Vector

Het protocol presenteert gedetailleerde methoden om te evalueren of de nano-emulsie ophiopogonine D adjuvans effectieve cellulaire immuunresponsen bevordert.

In vitro Cellulaire activiteit Evaluatie van het nano-emulsievaccin Adjuvans Ophiopogonine D

Leer de ELISPOT-methode om T-celreacties op microbiële antigenen te detecteren en te kwantificeren. Deze techniek helpt onderzoekers bij het begrijpen van adaptieve immuniteit in idiopathische ziekten.

Enzyme-linked immunospot Assay (ELISPOT): Kwantificering van de Th-1 cellulaire immuunreacties tegen microbiële antigenen

Meer video's verkennen