Enzyme-linked immunospot Assay (ELISPOT): Kwantificering van de Th-1 cellulaire immuunreacties tegen microbiële antigenen

Het algemene doel van deze procedure is om T-celreacties op antigenen van belang te detecteren. Dit wordt bereikt door eerst te coderen met captuurantilichamen. De tweede stap van de procedure is het toevoegen van cellen en antigenen van belang en vervolgens een nacht te incuberen.

De derde stap van de procedure is het toevoegen van detectieantilichamen. De laatste stap van de procedure is het ontwikkelen van de plaat met substraatreagentia en het analyseren van spots. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die cytokinen van belang kiezen door analyse van spotvormende eenheden.

Hallo, mijn naam is Dr. Ki Richter en ik ben een onderzoeksdocent in het laboratorium van Dr. Wonder Drake aan de Vanderbilt University in de afdeling Infectieziekten. Vandaag demonstreren we de Ellie Spot-techniek, ook bekend als de enzymgekoppelde immunospot-assay. Dr. Isfahan Chambers en Tiffany Cone zullen de techniek voor u demonstreren vandaag.

Om celkweekstandaarden te handhaven, voer manipulaties uit onder steriele omstandigheden in de kap, open een Ally Spot-plaat en was drie keer met PBS. Bereid een coatingoplossing van het captuurantilichaam in PBS. Meng goed door te vortexen voor het gemak.

Breng de antilichaamoplossing over naar een reservoir voor de meerkanaals pipet en verdeel 100 microliters coatingoplossing in elk. Verzegeld de plaat met perfil en plaats in een koelkast overnacht. Deze met antilichamen beklede platen zijn wekenlang goed.

De vuistregel luidt dat een plaat kan worden gebruikt als er nog vloeistof in de putjes zit. Om de cellen voor deze test voor te bereiden, kleurt u vers geïsoleerde perifere mononucleaire bloedcellen met trienblauw voor levensvatbaarheid en tel ze. Plate de PBMC bij 2 miljoen cellen per milliliter in onze 10 media en incubeer overnacht bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Om het experiment bij te houden, labelt u de Ali Spot plaatdeksel met het identificatienummer van het specimen, de putjescondities en de datum.

Was de plaat zes keer met steriel PBS met de dump and blot methode. Wees voorzichtig om de plaat niet te spetteren tijdens het dumpen, omdat dit ervoor kan zorgen dat de putjes van de plaat paars worden. Voeg onze 20 media toe aan elke put en incubeer de plaat een uur bij 37 graden Celsius.

Terwijl de plaat incubeert, telt u de cellen die overnacht hebben rusten. Oogst de PBMC door centrifugatie. Decanteer het supernatant en suspendeer de pellet in onze 10 media met een concentratie van 1 miljoen cellen per milliliter.

Na de incubatie van één uur van de Ally Spot plaat, verwijdert u het R 20 media met de dump and blot methode. Wees voorzichtig om de plaat niet te spetteren tijdens het dumpen. Voeg 100 microliters celsuspensie toe aan elk.

Volg het experimentele ontwerp met toevoeging van peptiden en antigenen aan de corresponderende testputjes. Bevat altijd een negatieve controle van cellen zonder peptiden en ook positieve controleputjes met toegevoegd fytohemagglutinine. Incubeer de plaat een nacht bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide.

Was de plaat zes keer met 150 microliters van een XPBS met de dump and blot methode. Voeg 100 microliters PBS toe aan elke put van de plaat en plaats de plaat in de koelkast of op kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Bereid ondertussen de biotin antilichaamoplossing in PBS voor.

Haal de ALI spot plaat uit de koelkast en gooi het PBS weg door het in de prullenbak te draaien. Wees voorzichtig om de plaat niet te spetteren tijdens het dumpen, verdeel de biotin antilichaamoplossing in elke put en incubeer de plaat in de weefselkweekkap bij kamertemperatuur gedurende een uur. Was de plaat zes keer met PBS met de dump and blot methode op de laatste wasbeurt.

Laat het PBS nu op de plaat. Bereid de STREPTAVIDINE antilichaamoplossing in PBS voor, zorg ervoor dat u de oplossing vortext om te mengen. Gooi de laatste PBS-was uit de putjes weg en plot de ALI spot plaat.

Voeg streptavidin antilichaamoplossing toe aan elke put en incubeer de plaat in de weefselkweekkap bij kamertemperatuur gedurende een uur. Om overtollig trevain-antilichaam te verwijderen, was de plaat zes keer met PBS met de dump and blot methode op de laatste wasbeurt, laat het PBS op de plaat. Gezien de lichtgevoeligheid van de B-C-I-P-M-B-T alkalische fosfatas substraatoplossing.

Werk in het donker bij het bereiden van de staloplossing zoals beschreven in de instructies van de alkalische fosfatas substraatkit. Gooi het resterende PBS weg uit de putjes en blot de ly spot plaat. Voeg substraatoplossing toe aan elke put en zet het licht aan. Laat de reagentia vijf tot tien minuten de kleur ontwikkelen, laat de reagentia op de plaat tot de spots paars beginnen te worden en behoorlijk donker zijn.

Dit duurt maximaal 20 minuten. Was de Ali spot plaat drie keer met kraanwater en laat hem aan de lucht drogen. Elke plaat bevat een positieve controle, negatieve controle en peptide van belang uitgevoerd in het minimum in duplicaat.

De positieve controleputjes hebben een dieppaarse kleur, weerspiegelen een confluente laag cellen en nauwelijks een witte achtergrond. De negatieve controleputjes hebben geen paarse achtergrond en geen spots zoals verwacht. De testmonsterputjes illustreren cellulaire reacties op microbiële peptiden hier.

De paarse spots vertegenwoordigen een enkele responsieve cel die het cytokine van belang tot expressie brengt. Bij het uitvoeren van de LA spot-techniek, wees voorzichtig om het membraan niet te puncteren met uw pipetpunten of om uw plaat te laten uitdrogen, omdat dit zal leiden tot een hoge achtergrond.