Behoud van Wolbachia in Cell-vrij medium

Mijn naam is Courtney Ston. Ik werk bij de Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health in het laboratorium van Dr. Jason Rascon. Vandaag gaan we bacteriën zuiveren uit gekweekte insectencellen.

Het is in feite een zeer eenvoudige procedure. We beginnen met het oogsten van onze cellen en vervolgens worden de membranen van de eukaryote gastheercel fysiek afgebroken middels lysis met glaskralen. Daarna gebruiken we differentiële centrifugatie om de bacteriën te scheiden van het celpuin van de gastheer.

Vervolgens gebruiken we een reeks filtratiestappen om gastcelpartikels verder te verwijderen, zodat we aan het einde alleen het gezuiverde bacteriële pellet overhouden. Dit is overigens een van de belangrijkste vereisten. Dit is een celcultuurkap, die wordt gebruikt om alles steriel te houden omdat celculturen zeer gemakkelijk besmet raken.

We hebben ook celkweekmedium nodig, de cellen zelf, en we kweken deze in plastic kolfjes. Daarnaast hebben we glaskralen van drie millimeter, conische buizen van 50 ml en een centrifuge nodig die in staat is tot hoge centrifugatiesnelheden, ongeveer 18.000 G om onze bacteriën te pelleteren, maar die ook ongeveer 3000 G of 2500 G kan draaien om onze gastheercellen te pelleteren. De eerste stap is dat we beginnen met onze gekweekte cellen.

Ze zijn gekweekt, toch? Dit zijn T 75-flesjes. Ze bevatten 15 ml kweekmedium en onze cellen.

De eerste stap is het lossen van de cellaag en het verzamelen van de cellen in een centrifugebuis van 50 ml. Hierbij schraapt u de cellaag min of meer op en neer, waardoor alle cellen in het medium terechtkomen. Zodra de cellen in het medium zijn, pipetteert u deze in de conische buis van 50 ml.

Voeg nu glazen kraaltjes van drie millimeter toe aan de twee celsuspensies. Deze zijn geautoclaveerd en kunnen in feite worden hergebruikt. Ze kunnen worden gewassen en in bleekmiddel worden geweekt en vervolgens opnieuw worden geautoclaveerd voordat ze weer worden gebruikt.

Giet de glaskralen voorzichtig over, waarbij u ervoor zorgt dat de mond van glazen pot B de mond van de centrifugebuis niet raakt. We voegen ongeveer 5 ml glaskralen toe aan elke centrifugebuis, tot aan de vijfmilliliter-volumemarkering. Vervolgens gaan we de eierstokcellen fysiek disruptren om de bacteriën in de suspensie vrij te maken.

We gebruiken een vortexmixer, stellen deze in op de hoogste stand en vortexen vervolgens gedurende vijf minuten. We vortexen de cellen dus met de glazen kraaltjes van 3 mm gedurende vijf minuten en pipetteren daarna het supernatant met een schone pipette in een schone en steriele centrifugebuis van 50 mL. We verkrijgen hiermee onze nieuw gecreëerde suspensie, die bestaat uit de vrijgekomen bacteriën in oplossing alsof wel als het celdebris.

De volgende stap is een centrifugatiestap op lage snelheid, zodat we het grove materiaal kunnen bezinken en de bacteriën in suspensie kunnen laten. Hiervoor gebruiken we de centrifuge op 2.500 ×g gedurende 10 minuten. We centrifugeren daarnaast bij vier graden Celsius om het pellet onderin beter te kunnen verzamelen.

We plaatsen het hierin, zorgen dat het in balans is, sluiten het en centrifugeren gedurende 10 minuten. Ik heb nu ons supernatant, dat zowel gastcelresten als de gezuiverde bacteriën bevat, gecentrifugeerd. Ik heb dit gedaan bij 2.500 G gedurende 10 minuten.

En zoals u kunt zien, heb ik een pellet onderin mijn buis die bestaat uit celresten. Mijn onlangs vrijgemaakte bacteriën bevinden zich nog in het supernatant, omdat de centrifugatie niet krachtig genoeg was om ze ook te pelletiseren. De volgende stap is daarom het verwijderen van het supernatant en het filteren hiervan door een vijf micron filter.

Dit is een filter van vijf micron en dit past op elk type spuit. Ik ga een spuit van 30 ml gebruiken; trek de zuiger omhoog en bevestig vervolgens de spuit aan het filter door deze erin te schroeven, zonder het filter zelf aan te raken, in het bijzonder het onderste gedeelte, aangezien dit steriel moet blijven. Druk vervolgens voorzichtig op de zuiger om het supernatant door het filter in onze buis te laten vloeien.

U mag niet te hard drukken, want u kunt het filter beschadigen waardoor het niet meer werkt. Als het punt wordt bereikt waarop u veel druk moet uitoefenen, moet u het filter verwijderen en vervangen, omdat dit betekent dat het verstopt is met veel celresten. Op dit punt voegen we normaal gesproken, afhankelijk van ons volume en als aanvullende methode om een zeer zuivere bacteriële cultuur te verkrijgen, 250 millimol sucrose-oplossing toe die filtergesteriliseerd is aan onze hoge-snelheidscentrifugeebuis.

Vul de fles voor minimaal 80%. Normaal gesproken vullen we deze tot in de hals. Deze buizen moeten zo vol zijn om te voorkomen dat ze imploderen in onze hogesnelheidscentrifuge.

Nu gaan we het supernatant centrifugeren om onze gezuiverde bacteriën te verkrijgen bij 18.000 ×g in deze hogesnelheidscentrifuge. Zorg ervoor dat de buisjes natuurlijk in balans zijn geplaatst en sluit vervolgens het apparaat. We stellen de centrifuge in op 10 minuten.

We voeren dit uit bij 10 °C of lager, waarvoor onze temperatuur hier is ingesteld. De hoeksnelheid voor deze specifieke rotor in de centrifuge is 12,5 omwentelingen per minuut. We hebben een conversietabel, waardoor er wordt gecentrifugeerd bij ongeveer 18.670 ×g. We hebben nu de hogesnelheidscentrifugatie uitgevoerd om onze gezuiverde bacteriën te pelleteren.

Zoals u nu kunt zien, hebben we een mooie bacteriële pellet onderin onze centrifugebuis. We zullen nu al het supernatant overbrengen naar een container voor vloeibare afvalstoffen. De volgende stap is het resuspenderen van onze bacteriën.

Ik ga het resuspenderen in twee milliliter van ons kweekmedium, namelijk Schneider's insect medium, aangevuld met 10% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum. Vervolgens resuspendeer ik het pellet door met de pipet op en neer te zuigen totdat alle bacteriën weer in oplossing zijn. Nu de bacteriën weer in suspensie zijn, voeren we nog een zuiveringsstap uit om eventuele overgebleven resten van gastheercellen te verwijderen.

Hiervoor gaan we een filter van 2,7 micron gebruiken. Ik gebruik hiervoor graag de plastic behuizing van ons vijf micron filter als houder. We kunnen nu de oplossing opzuigen, de spuit op het filter van 2,7 micron schroeven en de vloeistof vervolgens filteren in een buisje voor langetermijnopslag.

Net als bij het andere filter drukt u nu voorzichtig op de zuiger. We hebben nu onze oplossing van gezuiverde bacteriën. Het volgende dat ik u zal laten zien, is hoe we de levensvatbaarheid bepalen.

We gebruiken de backlight live dead bacterial viability kit van Molecular Probes. Deze kit bevat twee kleurstoffen: propidiumjodide en cyto 9. Propidiumjodide fluoresceert rood en kleurt alleen bacteriën waarvan het bacteriële membraan niet volledig intact is, terwijl cyto 9 alle bacteriën kleurt.

Wanneer u deze bacteriën bekijkt onder een microscoop die is uitgerust met fluorescentie-optiek, zullen alle bacteriën groen fluoresceren, en een subgroep, namelijk de dode bacteriën, zal rood fluoresceren. We nemen een klein aliquot van ons gezuiverde monster; in dit geval neem ik slechts 10 µL, precies genoeg om één preparaat te maken. En ik ga dit overbrengen naar een andere buis.

Vervolgens voeg ik onze andere twee kleurstoffen toe, slechts één microliter van het mengsel van propidiumjodide en cyto 9, aan onze bacteriële suspensie. Daarna kunt u dit 15 minuten in het donker laten incuberen. We hebben echter gemerkt dat u het ook vrijwel direct kunt monteren en bekijken om uw resultaten te zien.

Oké, nu ga ik mijn preparaat met de bacteriën, gekleurd met de backlight live/dead-kleuring, onder de microscoop bekijken. Ik breng het aan op mijn objectglas, plaats een dekglas en bekijk het vervolgens. Ik gebruik ons rood-groene gemengde filter om de levensvatbaarheid van mijn bacteriën te kunnen beoordelen.

Dus wanneer ik de sluiter open, zie ik mijn bacteriën; ze zijn min of meer slechts kleine stipjes. Maar ik zie hier dat ongeveer 90 tot 95% van de bacteriën groen zijn, terwijl slechts ongeveer 5%, zou ik zeggen, rood zijn. Dus we hebben een zeer hoge levensvatbaarheid, toch?

Ik heb u zojuist door de zuivering van levensvatige Akia uit gekweekte insectencellen geleid. Dit protocol omvatte de fysieke disruptie van eukaryote gastheercellen en vervolgens differentiële centrifugatie om de gezuiverde bacteriën te isoleren, alsofmede een reeks filtratiestappen om de kwaliteit van uw gezuiverde bacteriën te waarborgen en deze volledig te zuiveren van alle gastheercelcomponenten. Daarna zijn we door de backlight live/dead-assay gegaan, waarbij twee kleurstoffen worden gebruikt om de levensvatbaarheid van uw bacteriën te beoordelen.

U kunt nu uw gezuiverde bacteriën gebruiken voor diverse toepassingen, waaronder het infecteren van andere gecultiveerde cellsystemen om de infectie van een specifiek systeem te verhogen. Daarnaast kunt u metabole studies of tal van andere onderzoeken uitvoeren met behulp van uw levende gezuiverde bacteriën.