Feeder-vrije bewerking, Cultuur en passage van de Mens IPS cellen met behulp van complete KnockOut Serum Vervangende Feeder-vrij medium

Het algemene doel van deze procedure is om menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen aan te passen aan en te behouden in een feeder-vrije kweek met behulp van een feeder-vrij medium met complete knockout-serumvervanging. Dit wordt bereikt door eerst platen te prepareren die gecoat zijn met gelt, TRX of cell start. De tweede stap van de procedure is het passeren van de IPS van MEF's naar feeder-vrij medium met behulp van disc space.

De laatste stap van de procedure is om uw iPS-cellen voortdurend feeder-vrij te houden. Uiteindelijk kunnen resultaten worden behaald die een vergelijkbare celgroei en stamcelkarakteristieken laten zien als bij meth-culturen, aangetoond via immunokleuring met pluripotente markers. Hallo, ik ben Kate Wagner van de GIB co site bij Life Technologies.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande technieken is dat u tijd kunt besparen en de consistentie van uw celcultuur kunt verhogen wanneer u knockout serum replacement in uw volledige workflow gebruikt. Tegenwoordig omvat de familie van knockout-producten een volledige lijst met media en reagentia voor feeder-gebaseerde, feeder-vrije en xeno-vrije condities voor humane embryonale stamcellen, muizen embryonale stamcellen en geïnduceerde pluripotente stamcellen. KSR kan worden gebruikt voor derivatie, groei, expansie, cryopreservatie en de beginstappen van differentiatie.

De volgende video laat zien hoe u uw cellen adapteert en passageert met gebruik van KSR onder feeder-vrije condities. Gel TRX-gecoate kweekschalen zijn vereist voor het adapteren en passageren van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen onder feeder-vrije condities. Ontdooi één dag voor de bereiding van deze gecoate schalen één buisje gelt TRX langzaam door dit een nacht in de koelkast te laten staan. Verdun de volgende dag het ontdooide buisje gelt TRX 1:100 in basaal medium door één milliliter gel Rex over te brengen naar een fles met 99 milliliter basaal medium. Meng de oplossing voorzichtig.

Wij raden het gebruik van knockout D-M-E-M-F 12 aan als basaal medium, maar raadpleeg de tekst van het protocol voor andere opties. Bedek het gehele oppervlak van elke kweekschaal met gel Rex-oplossing. Voeg voor elke schaal van 60 millimeter 1,5 milliliters gel trek-oplossing toe.

Incubeer de schalen gedurende één uur bij 37 °C. Extra platen kunnen in Parafilm worden gewikkeld en tot vier weken in de koelkast worden bewaard. Extra verdunde gelt TRX kan worden afgezet en bewaard bij -20 tot -80 °C, maar meerdere vries-dooi cycli moeten vóór gebruik worden vermeden.

Breng de met gelt TRX gecoate schalen over naar een laminaire flowkast en laat ze equilibreren tot kamertemperatuur. Bereid daarnaast alle overige benodigde reagentia voor en zorg ervoor dat alle media zijn geëquilibreerd tot 37 °C en correct zijn verzadigd met gas. Om menselijke IPC's aan feeder-vrij medium aan te passen, wordt eerst de cultuur gestart.

De iPSC bevinden zich op meth-feeder-cellen totdat deze 70 tot 80% confluent zijn. Aspireer het medium uit elke 60 millimeter cultuurkweekschaal en voeg een passende hoeveelheid Dispa-oplossing toe, namelijk 1 ml. Incubeer de schalen in dit geval gedurende drie tot vijf minuten bij 37 °C.

Aspireer de dispa-oplossing uit elke kweekschaal en spoel de meth-feeder-cellen voorzichtig twee tot drie keer af met DPBS. Voeg vervolgens een passende hoeveelheid compleet serumvervangend medium toe aan elke kweekschaal. Gebruik een celschraper om de cellen voorzichtig van het oppervlak van de schaal af te schrapen.

Verzamel de celsuspensie uit elke petrischaal in afzonderlijke conische buizen van 15 milliliter. Spoel elke kweekschaal met een passende hoeveelheid compleet serumvervangend medium en voeg het spoelmedium toe aan de conische buizen van 15 milliliter met de celsuspensie. Centrifugeer de conische buizen van 15 milliliter bij 200 G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur om de cellen te pelletteren.

Aspireer na centrifugatie voorzichtig het supernatant en gooi dit weg zonder de cellpellet te verstoren. Tik zachtjes tegen de buis om de cellpellet volledig van de bodem van de buis los te maken. Voeg een passende hoeveelheid compleet serumvervangend, feeder-vrij medium toe volgens de gewenste splitsingsverhouding.

Resuspendeer het pellet vervolgens voorzichtig. Breek de celklonters niet op in kleinere fragmenten, omdat kleinere klonters niet goed aan het oppervlak hechten. Aspireer alle resterende gel TRE-oplossing uit de eerder voorbereide met gel Rex gecoate kweekschaaltjes en voeg langzaam een passende hoeveelheid celсусpensie toe aan elk kweekschaaltje.

Beweeg de kweekschaal meerdere keren heen en weer en van links naar rechts om de cellen over het oppervlak van de schaal te verspreiden. Plaats de kweekschalen voorzichtig in een incubator van 37 °C met een bevochtigde atmosfeer van 4 tot 6% CO2 in lucht. Vervang daarna dagelijks het verbruikte medium totdat de cellen ongeveer 70 tot 80% confluent zijn.

Wanneer de menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen die groeien in een volledig serumvrij, feeder-vrij medium 70 tot 80% confluent zijn, kunnen ze worden gesubcultured. Verwijder eventuele gedifferentieerde cellen voordat u overgaat tot het passeren. Aspireer het gebruikte medium uit de 60 millimeter cultuurpetrischaal met een pipet en spoel de cellen twee keer af.

Voeg met DPBS voorzichtig één milliliter voorverwarmde schijfgebaseerde oplossing toe aan de kweekschaal. Draai de kweekschaal rond om het gehele celoppervlak te coaten. Incubeer de kweek bij 37 °C gedurende drie tot vijf minuten.

Aspire vervolgens de dis space-oplossing en was de cellen voorzichtig tweemaal met DPBS, voeg compleet serumvervangingsmedium toe, feeder-vrij medium en schraap de cellen voorzichtig van het oppervlak van de kweekschaal. Draag de cellen met een celschraper over naar een steriele centrifugebuis van 15 milliliter. Spoel de kweekschaal tweemaal met compleet serumvervangingsmedium.

Spuit voorzichtig feeder-vrij medium over de cellen om alle cellen die nog niet losgekomen zijn te verwijderen. Verzamel het medium van beide spoelbeurten met de cellen in de 15 milliliter buis. Centrifugeer de buis 5 minuten bij 200 G bij kamertemperatuur om de cellen te pelletten zonder het celpellet te verstoren.

Aspireer het supernatant voorzichtig en gooi dit weg. Tik zachtjes tegen de buis om de celpellet volledig los te maken van de bodem van de buis. Resuspendeer de cellen voorzichtig in compleet serumvervanger.

Feeder-vrij medium met behulp van een serologische pipette van vijf milliliter. Niet tritueren. Draag de cellen over naar een nieuwe Geltrex-gecoate schaal van 60 millimeter met de gewenste splitsingsverhouding.

Beweeg de kweekschaal meerdere keren heen en weer en van links naar rechts om de cellen over het oppervlak te verspreiden. Plaats de kweekschaal de volgende dag in een incubator van 37 °C met een bevochtigde atmosfeer van 4 tot 6% koolstofdioxide in lucht. Vervang het gebruikte medium voorzichtig door volledig serumreplacement.

Voeg vers medium toe om celresten te verwijderen. Vervang het gebruikte medium vanaf dat moment dagelijks. Deze fasecontrastopname toont menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen die zijn gekweekt op met gelt TRX gecoate kweekschalen met gebruik van compleet serumvervanger, feeder-vrij medium.

De morfologie van de IPC's vertoont gelijkenissen met menselijke embryonale stamcellen, gekenmerkt door grote kernen en weinig cytoplasma; immunokleuring laat zien dat IPC's gekweekt in knockout serum replacement medium plus de groeifactorcocktail de pluripotente markers OCT four en SSEA four tot expressie brachten. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u uw IPC's kunt adapteren en onderhouden in knockout serum replacement, feeder-vrije condities. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.