Name: Feeder-vrije bewerking, Cultuur en passage van de Mens IPS cellen met behulp van complete KnockOut Serum Vervangende Feeder-vrij medium (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Leer menselijke iPS-cellen te kweken zonder feederlagen met KnockOut Serum Replacement-medium. Deze methode verbetert consistentie en efficiëntie in stamcelonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Opmerking: Om steriele cultuur voorwaarden te handhaven, zijn alle procedures in dit protocol uitgevoerd met steriele laboratorium-praktijken en uitgevoerd onder een laminaire stroming kap. Voorafgaand aan de start, zorg ervoor dat elk medium is evenwicht gebracht tot 37 ° C en adequaat vergast. Voorbereiden Geltrex-coated Cultuur Gerechten Let op: zie bijlage voor het gebruik van gecoate CELLstart kweekschalen <ol><li> Dooi een tube van Geltrex (1 ml) langzaam bij 2-8 ° C en verdund 1:100 in 99 ml Knockout D-MEM/F-12. Meng de oplossing. Opmerking: Sommige iPS cellijnen kan een andere Geltrex verwatering voor een optimale groei nodig hebben. Zie bijlage voor alternatieve verdunningen. </li><li> Het gehele oppervlak van elke cultuur schotel met de Geltrex oplossing (1 ml voor een 35-mm schaal, 1,5 ml voor een 60-mm schotel). </li><li> Seal ieder gerecht met Parafilm om het drogen te voorkomen en incubeer de gerechten gedurende 1 uur bij 37 ° C. NB: Op dit punt kunt u de Geltrex gecoate cultuur gerechten bewaren bij 4 ° C gedurende maximaal 1 maand. Seal ieder gerecht met Parafilm om de Geltrex niet uitdrogen. </li><li> Voorafgaand aan het gebruiken, de overdracht van de Geltrex-gecoate gerechten tot een laminaire stroming kap en laat ze op kamertemperatuur (ongeveer 1 uur). </li></ol> Voorbereiden Compleet KnockOut SR Feeder-vrij medium <ol><li> Voor te bereiden 1 ml van 10 ug / ml Basic FGF-oplossing aseptisch meng de hieronder genoemde componenten. Aliquot de oplossing en bewaar bij -20 ° C gedurende maximaal 6 maanden. <table border="0"><tbody><tr><td> Basic FGF </td><td> 10 pg </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> 990 uL </td></tr><tr><td> 10% BSA </td><td> 10 pi </td></tr></tbody></table> Opmerking: BSA kan worden vervangen door HSA of Knockout SR bij dezelfde concentratie. </li><li> Ter voorbereiding op 50 ml van 2 mg / ml Dispase oplossing aseptisch meng de hieronder genoemde componenten. Filter steriliseren de oplossing en bewaar bij 4 ° C gedurende maximaal 2 weken. <table border="0"><tbody><tr><td> Dispase </td><td> 100 mg </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> 50 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Aan 100 ml van complete KnockOut SR Feeder-Free (KSR-FF) medium aseptisch combineren van de componenten die in de tabel hieronder voor te bereiden. <table border="1"><tbody><tr><td> Bestanddeel </td><td> Concentratie voorraad </td><td> Uiteindelijke concentratie </td><td> Volume </td></tr><tr><td> Knockout DMEM/F12 (Cat. Nr. +12.660-012) </td><td> - </td><td> 1X </td><td> 76,8 mL </td></tr><tr><td> Glutamax-I (Cat. nr. 35050-061) </td><td> 200 mM </td><td> 2 mM </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> SR KnockOut (Cat. Nr. 10,828-028) </td><td> - </td><td> 20% </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> KnockOut SR-GFC (Cat. Nr. A10580-01) </td><td> 50X </td><td> 1X </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td> bFGF (Cat. Nr. PHG0024) </td><td> 10 ug / mL </td><td> 20 ng / mL </td><td> 200 pi </td></tr></tbody></table> U mag de KSR-FF medium bij 2-8 ° C gedurende maximaal een week. </li><li> Vlak voor de complete medium pre-equilibreren de temperatuur en gassen, aseptische wijze de vereiste hoeveelheid 2 mercaptoethanol (55 mM voorraad concentratie) voor een 0,1 mM eindconcentratie. Bijvoorbeeld, om 100 ml KSR-FF medium voor te bereiden 182 pi van 55 mM 2-mercapto-ethanol (1:550 verdunning) alternatief toe te voegen, kan de 2-mercapto-ethanol worden toegevoegd aan het 1X voltooide medium en bewaard bij 2-8 ° C voor tot een week. </li></ol> Aanpassing iPSCs naar KSR-FF Medium <ol><li> Voorafgaand aan de start, pre-evenwicht je Geltrex gecoat gerechten op kamertemperatuur in de motorkap. </li><li> Cultuur van de iPSCs op MEF feeder-cellen tot ze 70-80% confluent. Raadpleeg de GIBCO muis embryonale Fibroblast handboek voor MEF-gebaseerde cultuur protocollen. </li&gt; <li> Pre-warm van het vereiste volume Dispase in een 37 ° C waterbad. Zie tabel 1 hieronder voor meer informatie over de vereiste volumes. </li><li> Pre-evenwicht van het vereiste volume KSR-FF in een 37 ° C waterbad for15 min. Zie tabel 1 hieronder voor meer informatie over de vereiste volumes. </li><li> Zuig het medium van de cultuur gerechten, en voeg een juiste hoeveelheid Dispase oplossing. Incubeer de gerechten bij 37 ° C gedurende 3-5 minuten. </li><li> Zuig het Dispase oplossing van elke cultuur schip en afwassen van de MEF feeder cellen voorzichtig met D-PBS (2 tot 3 keer). </li><li> Voeg een passend bedrag van complete KnockOut SR medium om elke cultuur schip. Gebruik een cel krabber of een 5 mL pipet om voorzichtig de cellen schrapen van het oppervlak van de cultuur schip. Let op: zie bijlage voor alternatieve aanpassing protocollen voor moeilijk te iPS passen cellijnen, </li><li> Verzamel de celsuspensie van elke cultuur schotel in aparte 15 ml conische buizen. Spoel elke cultuur schip met een geschikte hoeveelheid van complete KnockOut SR medium, en voeg de D-PBS spoelen medium in de 15 ml conische buizen met daarin de celsuspensie. Wees voorzichtig niet naar de cel klonten te breken in enkele cellen </li><li> Centrifugeer de 15 ml conische buizen op 200 xg gedurende 5 minuten om de pellet iPSCs. </li><li> Zuig het supernatans van de IPSC pellet. Resuspendeer de pellet in een geschikte hoeveelheid van de KSR-FF medium volgens de split ratio (tabel 1). Breken niet de cel klompen naar een kleiner formaat, omdat de kleinere klonters niet goed hechten aan het oppervlak. Opmerking: We raden een splitsing van 1:2 voor de eerste 3 passages na de iPSCs zijn direct passage uit de IPSC MEF Cultuur Middelgrote tot KSR-FF medium. Normaal gesproken, een splitsingsverhouding 1u03-01u05 geschikt is, maar passage op 01:02 zorgt ervoor dat de hogere dichtheid van de cellen die nodig zijn bij de aanpassing in een feeder-vrije cultuur. </li><li> Voorafgaand aan de beplating van de iPSCs op Geltrex gecoat gerechten, zuigen resterende Geltrex oplossing uit de pre-gecoate schaal, en langzaam een ​​gepaste hoeveelheid celsuspensie toe te voegen aan elke cultuur gerecht. Let op: niet voor spoelen gerechten plating. </li><li> Verplaats de cultuur schotel heen en weer en links naar rechts een paar keer naar de cellen over het oppervlak van de schotel te verspreiden. Plaats voorzichtig de cultuur schotel in een 37 ° C incubator met een vochtige atmosfeer van 4 tot 6% CO 2 in de lucht. Vervang de gebruikte medium met KSR-FF elke dag. </li></ol> Passage menselijke iPS cellen met behulp van KSR-FF <ol start="13"><li> Let op de menselijke iPSCs groeien in volledige KSR-FF onder de microscoop te bevestigen dat de cellen 70-80% confluent en klaar om te worden subcultuur. Zie figuur 1. Opmerking: Als kolonies worden te dicht of te groot is, meer differentiatie optreedt. </li><li> Knip en voorafgaande verwijder gedifferentieerde IPSC kolonies op passage van de cultuur. </li><li> Pre-warm van het vereiste volume Dispase in een 37 ° C waterbad. Zie tabel 1 hieronder voor meer informatie over de vereiste volumes. </li><li> Pre-evenwicht van het vereiste volume KSR-FF in een 37 ° C waterbad for15 min. Zie tabel 1 hieronder voor meer informatie over de vereiste volumes. </li><li> Zuig het bestede medium van de cultuur schip met behulp van een pipet, en tweemaal spoelen van de cellen met D-PBS. </li><li> Voorzichtig toe te voegen voorverwarmde Dispase oplossing voor de cultuur vat (bijv. 1 ml Dispase oplossing per 60-mm cultuur schotel). Swirl de cultuur schip voor het coaten van de hele cel oppervlak. </li><li> Incubeer de cultuur vat bij 37 ° C gedurende 3 minuten. </li><li> Verwijder het schip uit de incubator, zuigen de Dispase oplossing, en voorzichtig wassen van de cellen met D-PBS. </li><li> Zachtjes schrapen van de cellen van het oppervlak van de cultuur schotel met behulp van een cel schraper, en breng de cellen om een ​​steriele 15 ml centrifugebuis. </li><li> Twee keer Spoel de cultuur schotel met KSR-FF, zacht &quot;spuiten uit&quot; alle cellen die niet los. Het zwembad van het spoelen medium met de cellen in de 15 ml buis. </li><li> Centrifugeer de buis op 200 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om pellet de cellen. </li><li> Voorzichtig het supernatans aspireren zonder de celpellet en gooi hem weg. </li><li> Tik zachtjes tegen de buis om volledig de cel pellet verjagen uit de tube bodem. </li><li> Voorzichtig resuspendeer de cellen in de pre-evenwicht gebracht KSR-FF met behulp van een serologische pipet 5 ml. Niet vermaal. Let op: het is van cruciaal belang bij de stap om voorzichtig de cellen resuspenderen zonder geweld te gebruiken om schade te voorkomen. </li><li> Overdracht van de cellen om een ​​frisse 60-mm Geltrex-gecoate schaal op de gewenste split ratio en beweeg de cultuur schotel heen en weer en links naar rechts een paar keer naar de cellen over het oppervlak verspreiden. </li><li> Zet de schotel in een cultuur van 37 ° C incubator met een vochtige atmosfeer van4 tot 6% CO 2 in de lucht. </li><li> De volgende dag, zachtjes vervangt de gebruikte medium met KSR-FF naar cel vuil te verwijderen. Daarna vervangen door de gebruikte medium alledaagse. Let op de iPS cellen dagelijks en passage als dat nodig is (ongeveer om de 4-5 dagen). Passage wordt aanbevolen wanneer de cellen 70-80% confluentie bereiken. Voor iPS cellen cryopreservatie en ontdooien, zie ons protocol met de titel &quot;Cryopreserving en herstellen van de Mens iPS cellen met behulp van complete KnockOut Serum Vervangende Feeder-vrij medium&quot;. </li></ol> Verwachte resultaten <img src="/files/ftp_upload/2236/2236fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. De fase contrast afbeelding hieronder toont iPSCs geteeld op Geltrex gecoate cultuur gerechten met complete KnockOut Serum Vervangende Feeder-vrij medium. De iPSCs vertonen morfologie lijken op hESC &#39;s, die wordt gekenmerkt door grote kernen en weinig cytoplasma. (40x vergroting) <table border="1"><tbody><tr><td> Bestanddeel </td><td> 35mm Dish </td><td> 60mm Dish </td><td> 100mm Dish </td></tr><tr valign="top"><td> Compleet KnockOut SR medium </td><td> 2 mL </td><td> 4 mL </td><td> 10 ml </td></tr><tr valign="top"><td> Geltrex Solution </td><td> 1 mL </td><td> 1,5 ml </td><td> 4-5 ml </td></tr><tr valign="top"><td> Dispase </td><td> 0,5 ml </td><td> 1 mL </td><td> 3-4 ml </td></tr><tr valign="top"><td> D-PBS voor het spoelen </td><td> 2 mL </td><td> 4 mL </td><td> 10 ml </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Aanbevolen Volumes <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2236/2236appendix.pdf">Klik hier om de bijlage te zien</a> .

<ol><li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+and+techniques+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).</li>
<li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rat+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+combining+genetic+reprogramming+and+chemical+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.</a> Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).</li>
<li>Liao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+adult+rat+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 11-15 (2009).</li>
<li>Dimos, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+patients+with+ALS+can+be+differentiated+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.</a> Science. 321, 1218-1221 (2008).</li>
<li>Aasen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnli%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnli. 26, 1276-1284 (2008).</li>
<li>Park, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 3, 1180-1186 (2008).</li>
</ol>

De auteurs van dit artikel zijn werkzaam bij Life Technologies, dat reagentia en instrumenten gebruikt in dit artikel oplevert.

<table><tbody><tr><td>Knockout DMEM/F12</td><td></td><td>Cat. nr. 12660-012</td><td>Opmerking: zie bijlage voor het gebruik van alternatieve DMEM-producten</td></tr><tr><td>GlutaMAX-I</td><td></td><td>Cat. nr. 35050-061</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td></td><td>KnockOut SR, Cat. nr. 10828-028</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail</td><td></td><td>KnockOut SR-GFC, Cat. nr. A10580-01</td><td></td></tr><tr><td>FGF-basic, humaan recombinant eiwit, 10 &amp;mu;g</td><td></td><td>bFGF, Cat. nr. PHG0024</td><td>Opmerking: zie bijlage voor alternatieve bFGF-verpakkingsgroottes.</td></tr><tr><td>2-Mercapto&amp;#8211;ethanol</td><td></td><td>Cat. nr. 21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td></td><td>Cat. nr. 17105-041</td><td>Opmerking: zie bijlage voor alternatieve passagemethoden.</td></tr><tr><td>Geltrex hESC-gekwalificeerde basaalmembraanmatrix met gereduceerde groeifactoren, 1 mL</td><td></td><td>Cat. nr. A10480-01</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s fosfaatgebufferde zoutoplossing (D-PBS) zonder calcium en magnesium </td><td></td><td>Cat. nr. 14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Steriele weefselkweekkast</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator ingesteld op 37&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette-Aid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waterbad ingesteld op 37&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steriele serologische pipetten (5 mL, 10 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL centrifugebuisjes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60mm weefselkweek-behandelde schalen</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

feeder-vrije bewerking, cultuur en passage van de mens ips cellen met behulp van complete knockout serum vervangende feeder-vrij medium

Feeder-Free Adaptation, Culture and Passaging of Human IPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

De ontdekking in 2006 dat de mens en muis fibroblasten kunnen worden geherprogrammeerd om iPS cellen 1-3 met kwaliteiten opvallend vergelijkbaar met embryonale stamcellen te genereren heeft een belangrijke nieuwe bron van pluripotente cellen voor drug discovery, celtherapie en fundamenteel onderzoek. GIBCO media en reagentia zijn in de voorhoede van de pluripotente stamcel-onderzoek voor jaren. Knockout DMEM aangevuld met Knockout Serum Vervanging is in de media van de keuze voor embryonale stamcellen de groei en nu iPS celcultuur 3-9. Deze gouden standaard media systeem kan nu worden gebruikt voor feeder-vrije cultuur met de toevoeging van Knockout SR Growth Factor Cocktail. Traditionele menselijke ES en iPS celcultuurmethoden vereisen het gebruik van muis of mens fibroblast feeder lagen, of feeder-geconditioneerd medium. Deze cultuur methoden zijn arbeidsintensief, moeilijk op schaal en het is moeilijk te onderhouden HIPS cellen ongedifferentieerd te wijten aan de undefined voorwaarden. Invitrogen heeft ontwikkeld Knockout SR Growth Factor Cocktail, zodat u gemakkelijk de overgang je heupen celculturen aan feeder-vrij met behoud van uw gebruik van Knockout SR.

Het volgende protocol bevat instructies voor het aanpassen van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen aan feeder-vrije cultuur met complete KnockOut Serum Vervangende Feeder-vrij medium (KSR-FF). Een keer aangepast, instructies voor de voortdurende onderhoud zijn ook aanwezig.

Feeder-vrije bewerking, Cultuur en passage van de Mens IPS cellen met behulp van complete KnockOut Serum Vervangende Feeder-vrij medium

De ontdekking in 2006 dat menselijke fibroblasten en fibroblasten van muizen konden worden hergeprogrammeerd om iPS-cellen 1-3 te genereren met eigenschappen die opmerkelijk veel lijken op die van embryonale stam...

Het algemene doel van deze procedure is om menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen aan te passen aan en te behouden in een feeder-vrije kweek met behulp van een feeder-vrij medium met complete knockout-serumvervanging. Dit wordt bereikt door eerst platen te prepareren die gecoat zijn met gelt, TRX of cell start. De tweede stap van de procedure is het passeren van de IPS van MEF's naar feeder-vrij medium met behulp van disc space.De laatste stap van de procedure is om uw iPS-cellen voortdurend feeder-vrij te houden. Uiteindelijk kunnen resultaten worden behaald die een vergelijkbare celgroei en stamcelkarakteristieken laten zien als bij meth-culturen, aangetoond via immunokleuring met pluripotente markers. Hallo, ik ben Kate Wagner van de GIB co site bij Life Technologies.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande technieken is dat u tijd kunt besparen en de consistentie van uw celcultuur kunt verhogen wanneer u knockout serum replacement in uw volledige workflow gebruikt. Tegenwoordig omvat de familie van knockout-producten een volledige lijst met media en reagentia voor feeder-gebaseerde, feeder-vrije en xeno-vrije condities voor humane embryonale stamcellen, muizen embryonale stamcellen en geïnduceerde pluripotente stamcellen. KSR kan worden gebruikt voor derivatie, groei, expansie, cryopreservatie en de beginstappen van differentiatie.De volgende video laat zien hoe u uw cellen adapteert en passageert met gebruik van KSR onder feeder-vrije condities. Gel TRX-gecoate kweekschalen zijn vereist voor het adapteren en passageren van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen onder feeder-vrije condities. Ontdooi één dag voor de bereiding van deze gecoate schalen één buisje gelt TRX langzaam door dit een nacht in de koelkast te laten staan. Verdun de volgende dag het ontdooide buisje gelt TRX 1:100 in basaal medium door één milliliter gel Rex over te brengen naar een fles met 99 milliliter basaal medium. Meng de oplossing voorzichtig.Wij raden het gebruik van knockout D-M-E-M-F 12 aan als basaal medium, maar raadpleeg de tekst van het protocol voor andere opties. Bedek het gehele oppervlak van elke kweekschaal met gel Rex-oplossing. Voeg voor elke schaal van 60 millimeter 1,5 milliliters gel trek-oplossing toe.Incubeer de schalen gedurende één uur bij 37 °C. Extra platen kunnen in Parafilm worden gewikkeld en tot vier weken in de koelkast worden bewaard. Extra verdunde gelt TRX kan worden afgezet en bewaard bij -20 tot -80 °C, maar meerdere vries-dooi cycli moeten vóór gebruik worden vermeden.Breng de met gelt TRX gecoate schalen over naar een laminaire flowkast en laat ze equilibreren tot kamertemperatuur. Bereid daarnaast alle overige benodigde reagentia voor en zorg ervoor dat alle media zijn geëquilibreerd tot 37 °C en correct zijn verzadigd met gas. Om menselijke IPC's aan feeder-vrij medium aan te passen, wordt eerst de cultuur gestart.De iPSC bevinden zich op meth-feeder-cellen totdat deze 70 tot 80% confluent zijn. Aspireer het medium uit elke 60 millimeter cultuurkweekschaal en voeg een passende hoeveelheid Dispa-oplossing toe, namelijk 1 ml. Incubeer de schalen in dit geval gedurende drie tot vijf minuten bij 37 °C.Aspireer de dispa-oplossing uit elke kweekschaal en spoel de meth-feeder-cellen voorzichtig twee tot drie keer af met DPBS. Voeg vervolgens een passende hoeveelheid compleet serumvervangend medium toe aan elke kweekschaal. Gebruik een celschraper om de cellen voorzichtig van het oppervlak van de schaal af te schrapen.Verzamel de celsuspensie uit elke petrischaal in afzonderlijke conische buizen van 15 milliliter. Spoel elke kweekschaal met een passende hoeveelheid compleet serumvervangend medium en voeg het spoelmedium toe aan de conische buizen van 15 milliliter met de celsuspensie. Centrifugeer de conische buizen van 15 milliliter bij 200 G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur om de cellen te pelletteren.Aspireer na centrifugatie voorzichtig het supernatant en gooi dit weg zonder de cellpellet te verstoren. Tik zachtjes tegen de buis om de cellpellet volledig van de bodem van de buis los te maken. Voeg een passende hoeveelheid compleet serumvervangend, feeder-vrij medium toe volgens de gewenste splitsingsverhouding.Resuspendeer het pellet vervolgens voorzichtig. Breek de celklonters niet op in kleinere fragmenten, omdat kleinere klonters niet goed aan het oppervlak hechten. Aspireer alle resterende gel TRE-oplossing uit de eerder voorbereide met gel Rex gecoate kweekschaaltjes en voeg langzaam een passende hoeveelheid celсусpensie toe aan elk kweekschaaltje.Beweeg de kweekschaal meerdere keren heen en weer en van links naar rechts om de cellen over het oppervlak van de schaal te verspreiden. Plaats de kweekschalen voorzichtig in een incubator van 37 °C met een bevochtigde atmosfeer van 4 tot 6% CO2 in lucht. Vervang daarna dagelijks het verbruikte medium totdat de cellen ongeveer 70 tot 80% confluent zijn.Wanneer de menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen die groeien in een volledig serumvrij, feeder-vrij medium 70 tot 80% confluent zijn, kunnen ze worden gesubcultured. Verwijder eventuele gedifferentieerde cellen voordat u overgaat tot het passeren. Aspireer het gebruikte medium uit de 60 millimeter cultuurpetrischaal met een pipet en spoel de cellen twee keer af.Voeg met DPBS voorzichtig één milliliter voorverwarmde schijfgebaseerde oplossing toe aan de kweekschaal. Draai de kweekschaal rond om het gehele celoppervlak te coaten. Incubeer de kweek bij 37 °C gedurende drie tot vijf minuten.Aspire vervolgens de dis space-oplossing en was de cellen voorzichtig tweemaal met DPBS, voeg compleet serumvervangingsmedium toe, feeder-vrij medium en schraap de cellen voorzichtig van het oppervlak van de kweekschaal. Draag de cellen met een celschraper over naar een steriele centrifugebuis van 15 milliliter. Spoel de kweekschaal tweemaal met compleet serumvervangingsmedium.Spuit voorzichtig feeder-vrij medium over de cellen om alle cellen die nog niet losgekomen zijn te verwijderen. Verzamel het medium van beide spoelbeurten met de cellen in de 15 milliliter buis. Centrifugeer de buis 5 minuten bij 200 G bij kamertemperatuur om de cellen te pelletten zonder het celpellet te verstoren.Aspireer het supernatant voorzichtig en gooi dit weg. Tik zachtjes tegen de buis om de celpellet volledig los te maken van de bodem van de buis. Resuspendeer de cellen voorzichtig in compleet serumvervanger.Feeder-vrij medium met behulp van een serologische pipette van vijf milliliter. Niet tritueren. Draag de cellen over naar een nieuwe Geltrex-gecoate schaal van 60 millimeter met de gewenste splitsingsverhouding.Beweeg de kweekschaal meerdere keren heen en weer en van links naar rechts om de cellen over het oppervlak te verspreiden. Plaats de kweekschaal de volgende dag in een incubator van 37 °C met een bevochtigde atmosfeer van 4 tot 6% koolstofdioxide in lucht. Vervang het gebruikte medium voorzichtig door volledig serumreplacement.Voeg vers medium toe om celresten te verwijderen. Vervang het gebruikte medium vanaf dat moment dagelijks. Deze fasecontrastopname toont menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen die zijn gekweekt op met gelt TRX gecoate kweekschalen met gebruik van compleet serumvervanger, feeder-vrij medium.De morfologie van de IPC's vertoont gelijkenissen met menselijke embryonale stamcellen, gekenmerkt door grote kernen en weinig cytoplasma; immunokleuring laat zien dat IPC's gekweekt in knockout serum replacement medium plus de groeifactorcocktail de pluripotente markers OCT four en SSEA four tot expressie brachten. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u uw IPC's kunt adapteren en onderhouden in knockout serum replacement, feeder-vrije condities. Dat is alles.Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

feeder-free-adaptation-culture-passaging-human-ips-cells-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol beschrijft de gedetailleerde procedure voor cryopreserving menselijke iPS cellen in KnockOut SR cryopreservatie medium en het herstellen van deze cellen in complete KnockOut SR Feeder Free (KSR-FF) medium of feeder-based KnockOut SR medium.

Cryopreserving en herstellen van de Mens iPS cellen met behulp van complete KnockOut Serum Vervangende Feeder-vrij medium

De kwaliteit van muizen embryonische fibroblasten (MEF) wordt bepaald door de juiste spanning van muis zoals CF-1. Pluripotentie-ondersteunende MEFs en geconditioneerde media (CM), verkregen van deze moeten bevatten optimale concentraties van Activin A, Gremlin en Tgfβ1 nodig is voor de Activin / Nodal en FGF wegen naar co-operatief te behouden zelfvernieuwing en pluripotentie.

Voorbereiding van muis embryonale Fibroblast cellen die geschikt zijn voor het kweken van menselijke embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen

Ondanks aanhoudende inspanningen om de overgang culturen aan feeder-vrije omstandigheden, de afleiding en de cultuur van menselijke embryonale stamcellen (hESC) blijven grotendeels afhangen van co-culturen met muis embryonale feeders (MEF). Hier laten we zien een nieuwe methodologie voor het snel verwijderen van feeders van hESC culturen voorafgaand aan de experimenten.

Snelle Fibroblast Verwijdering uit High Density menselijke embryonale stamcellen culturen

Neurale lijst (NC) cellen afkomstig van menselijke pluripotente stamcellen (HPSC) hebben een groot potentieel voor het modelleren van de menselijke ontwikkeling en ziekte en voor celvervangingstherapieën. Hier, een voedingsvrije aanpassing van de momenteel...

Voedingsvrije Afleiding van neurale stamcellen uit humane pluripotente stamcellen

Dit protocol verschaft een werkwijze voor het verzamelen van muis embryonale stamcellen (mES) -geconditioneerd medium (mES-CM) verkregen uit serum (foetaal bovine serum, FBS) - en feeder (muis embryonale fibroblasten MEF) vrij voorwaarden voor een cel -gratis aanpak. Het kan dienstig voor de behandeling van veroudering en veroudering-geassocieerde ziekten.

Het verzamelen van serum en Feeder-vrij muis embryonale stamcellen geconditioneerd medium voor een Cell-free Approach

Regelmatige karakterisering van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's), om het behoud van hun pluripotente toestand vast te stellen, is een belangrijke stap voordat deze cellen voor andere toepassingen worden gebruikt. Hier beschrijven we een methode voor de kleinschalige vermenigvuldiging van menselijke iPSC's, specifiek ontworpen om hun eenvoudige en routinematige karakterisering via immunocytochemie mogelijk te maken.

Kleinschalig Voortplanting van Human iPSCs in serum-vrij Voorwaarden voor Routine Immunocytochemisch karakterisering

De productie van gespecialiseerde netvlies cellen uit pluripotente stamcellen is een keerpunt in de ontwikkeling van stamcel gebaseerde therapie voor retinale ziekten. De huidige paper beschrijft een eenvoudige methode voor een efficiënte generatie van retinale organoids en retinale pigment epitheel voor fundamenteel, translationeel, en klinisch onderzoek.

Gedefinieerde Xeno-vrij en kweekomstandigheden Feeder-gratis voor de generatie van menselijke iPSC afkomstige Retinal cel modellen

Wij presenteren hier een protocol voor de differentiatie van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen in elke Somiet derivaat (myotome, sclerotome, dermatoom en syndetome) in chemisch gedefinieerde voorwaarden, die toepassingen heeft in de toekomst ziekte modellering en cel-gebaseerde therapieën in orthopedische chirurgie.

In Vitro generatie van Somiet derivaten uit menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen-cellen

Om de beperkingen te vermijden die gepaard gaan met het enzymatisch of mechanisch passeren van menselijke embryonale stamcellen (hESC's) en door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) gekweekt op feedercellen, hebben we een snelle, effectieve, kostenefficiënte methode met een hoge opbrengst ontwikkeld voor het oogsten van hESC- of hiPSC-kolonies die worden onderhouden op een voedingscellaag van menselijke voorhuidfibroblasten met behulp van EDTA-gemedieerde kkleefkracht.

Snelle, kostenefficiënte, enzymvrije passaging van menselijke pluripotente stamcellen op voedingscellen door ethyleendiaminetetra-azijnzuur-gemedieerde dis-adhesie

Hier presenteren we een methode om menselijke iPSC-afgeleide chimere antigeenreceptor (CAR)-tot expressie brengende natural killer-cellen te differentiëren en uit te breiden met verbeterde doding tegen verschillende maligniteiten. Dit protocol demonstreert de differentiatie en uitbreiding van voor natural killer (NK) geoptimaliseerde iPSC-afgeleide CAR-NK-cellen en de meting van antitumoractiviteit tegen verschillende tumorcellijnen.

Vooruitgang in door mensen geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide chimere antigeenreceptor-expressie natuurlijke killercellen

Leer menselijke iPS-cellen te kweken zonder feederlagen met KnockOut Serum Replacement-medium. Deze methode verbetert consistentie en efficiëntie in stamcelonderzoek.

Feeder-vrije bewerking, Cultuur en passage van de Mens IPS cellen met behulp van complete KnockOut Serum Vervangende Feeder-vrij medium (Video) | JoVE Journal

Feeder-vrije bewerking, Cultuur en passage van de Mens IPS cellen met behulp van complete KnockOut Serum Vervangende Feeder-vrij medium

Meer video's verkennen