Inductie en Klinische Scoring van chronische-Relapsing experimentele autoimmune encefalomyelitis

Ik ben Christine Beaton. Ik ben assistent-onderzoeker in het laboratorium van George Chen van de afdeling Fysiologie en Biofysica van de University of California in Irvine. De komende dagen zal ik u laten zien hoe u chronisch recidiverende EAE, wat staat voor Experimentele Auto-immuun Encefalomyelitis, induceert en monitort in DA-ratten.

Dit is een diermodel voor multiple sclerose, of beter gezegd, een van de diermodellen voor multiple sclerose. Het wordt gekenmerkt door een opstijgende slapteverlamming bij deze dieren en histologische kenmerken die lijken op de menselijke ziekte. Dit proces zal enkele dagen in beslag nemen.

Op de eerste dag zal ik u laten zien hoe u de genische emulsie bereidt met naïef rood ruggenmerghomogenaat in compleet trans-adjuvans. Op de tweede dag zal ik u laten zien hoe u de ratten immuniseert voor EAE, waarna we zeven tot 15 dagen wachten om de eerste klinische tekenen bij deze dieren te observeren, waarna ik u de verschillende stadia van progressie van EAE in verschillende dieren zal tonen. Ik zal u eerst alle reagentia en materialen laten zien die nodig zijn om de emulsie te bereiden.

Ik gebruik compleet Freunds adjuvans H 37 Ra, maar hoewel dit al mycobacterium tuberculosis bevat, ga ik dit aanvullen tot 4 mg/ml met extra gedroogde mycobacterium tuberculosis IH 37 Ra. Om deze gedroogde bacteriën voor te bereiden, moet ik ze in een vijzel doen en met een stamper tot een fijn poeder malen. Zodra dat is gedaan, voeg ik deze bacteriën toe aan het adjuvans.

Vervolgens is het adjuvans klaar. De volgende stap is het voorbereiden van mijn antigeen. Daarom haal ik rattenrugmergen uit de vriezer die op minus 80 zijn ingevroren, en om ze echt bevroren te houden, plaats ik ze op een weegschaalbakje in droge ijs; ik haal ze één voor één eruit en minceer de rugmergen met eenvoudige scheermesjes in weegschaalbakjes.

Ik zal nu mijn aangevulde adjuvans op de vortexmixer plaatsen. Tijdens het vortexen voeg ik het ruggenmerg beetje bij beetje toe aan het adjuvans. Nadat al het ruggenmerg met het adjuvans op de vortexmixer is gemengd, vortexen we nogmaals vijf minuten. Daarna brengen we de bereide immersievloeistof over in glazen spuiten van 5 mL.

We gaan twee glazen spuiten van 5 ml verbinden met een 16 G brug, en we gaan de emulsie zo snel mogelijk voor die brug van de ene spuit naar de andere stuwen. Na een paar minuten, wanneer de emulsie begint dikker te worden, stappen we over op een kleinere brug. Deze is 18 G, en dat zal de emulsie nog dikker maken; we laten de emulsie in deze spuiten met deze brug, gewikkeld in aluminiumfolie, een nacht in de koelkast staan.

Ik heb 30 milligram Mycobacterium tuberculosis op het weegpapier gewogen. Ik heb deze overgebracht naar een vijzel. Vervolgens heb ik met een stamper de aggregaten bacteriën vermalen tot een fijn poeder.

Maar u wilt niet te hard drukken met de stamper om te voorkomen dat de bacteriën kapotgaan. Wanneer de bacteriën aan het begin van een procedure aggregeren, zijn ze geelbeige. Als u een zeer fijn poeder heeft verkregen, zult u aan het einde een wit poeder hebben, en dat is het doel, maar u mag niet te hard drukken om de bacteriën niet te beschadigen.

Nadat ik dat had gedaan, nam ik een ampul van 10 ml compleet trans-adjuvans en zorgde ik ervoor dat alle bacteriën in suspensie waren. Ik heb deze ampul geopend en de volledige 10 ml compleet trans-adjuvans over de gedisaggregeerde mycobacterium tuberculosis in de vijzel gegoten. Vervolgens zal ik het aangevulde compleet trans-adjuvans overbrengen naar een buis van 50 ml.

Ik breng nu mijn aangevulde complete trans-adjuvans over naar een buisje. De bacteriën bevinden zich uiteraard onderaan de vloeistof, en ik zal proberen om het grootste deel daarvan in het buisje te krijgen. Mocht er echter wat achterblijven in de vijzel, dan vormt dat geen probleem, aangezien ik deze vijzel zonder voorafgaand te reinigen opnieuw zal gebruiken voor het bereiden van mijn ruggenmergemulsie.

Hier zijn de ruggenmergen. Deze werden bevroren bewaard bij -80 °C. Ik heb 10 gram hiervan afgewogen om toe te voegen aan 10 ml van mijn aangevulde adjuvans.

Ik ga deze ruggenmergen, terwijl ik ze zo lang mogelijk bevroren houd, zeer fijn hakken in deze weegschaaltjes met behulp van scheermesjes. Om de ruggenmergen zeer fijn te hakken, heb je twee scheermesjes en een weegschaaltje nodig. Wat ik doe is één ruggenmerg in mijn weegschaaltje leggen en beginnen met snijden; ik houd mijn hand eroverheen omdat het, aangezien het bevroren is, hard zal gaan springen. Eerst vang ik de grote stukken op, waarna het zeer snel begint te ontdooien en aan de zijkant van mijn scheermesje gaat plakken.

Daarom gebruik ik het andere scheermesje om het te verwijderen, en ik probeer het zo fijn en zo snel mogelijk te fijnmalen zodat het geen tijd heeft om te smelten, omdat het veel moeilijker te snijden is zodra het gesmolten is. Het is dus uiterst belangrijk dat het ruggenmerg volledig en zeer fijn wordt fijngehakt, want hoe fijner het is, hoe homogener de immersie zal zijn, waardoor meer ratten ziek zullen worden met een homogener ziekteverloop. Het is dus uiterst belangrijk om al deze ruggenmergen zeer goed fijn te malen.

Ik ga nu elk van deze ruggenmergen op precies dezelfde manier fijnmalen, totdat ik de volledige 10 gram ruggenmerg heb verwerkt. Vervolgens ga ik het ruggenmerg in de vijzel een beetje mengen om er zeker van te zijn dat ik alle Mycobacterium tuberculosis verzamel die nog in de vijzel achterbleef nadat ik het adjuvans had toegevoegd. Daarna plaats ik het adjuvans op de vortexmixer.

Terwijl ik continu zo snel mogelijk vortex, voeg ik mijn gemalen ruggenmerg stapsgewijs toe aan dit adjuvans. Nu heb ik mijn aangevulde adjuvans op de vortex en ga ik mijn gemalen ruggenmerg beetje bij beetje toevoegen. De reden waarom ik het antigeen zeer langzaam aan het adjuvans toevoeg, is dat we een water-in-olie-emulsie maken.

Het adjuvans bestaat grotendeels uit minerale olie en het antigeen is een gelijke oplossing. Wat we nu willen doen, is het antigeen zeer langzaam aan de olie toevoegen, zodat de olie het antigeen elke keer dat we het toevoegen volledig omhult. Als we het in één keer zouden toevoegen, zou het antigeen niet volledig worden omhuld.

Nu heb ik al het gemiddelde ruggenmerg aan het adjuvans toegevoegd op de vortex, en ik heb de buis op de vortex geplaatst om deze nog vijf minuten te laten draaien om er zeker van te zijn dat alles volledig gemengd wordt. Ik stel de snelheid zo in dat ik de hoogste vortex mogelijk heb zonder te veel te verliezen in de buis. De vijf minuten vortexen zijn nu voorbij, en ik ga de vortex stopzetten en mijn mengsel overbrengen naar glazen spuiten.

Ik heb nu de complete spuit geassembleerd. Ik heb deze bevestigd aan de brug met de grotere diameter, en aan de andere zijde van de brug heb ik alleen de huls van één spuit bevestigd; ik ga nu de emulsie in die spuit toevoegen. Dus nu, nee.

Nu ga ik alle vloeistof in de onderste spuit trekken, de bovenste spuit loskoppelen, de bovenste spuit afmaken en controleren of er geen luchtbellen in de onderste spuit of in de brug zitten. Daarna ga ik ze weer aan elkaar koppelen. Nu zijn beide spuiten via deze brug met elkaar verbonden.

De ene is gevuld met immersievloeistof, de andere is leeg. Wat ik nu ga doen, is de zuiger van de ene spuit naar de andere zo snel mogelijk heen en weer duwen. Nu ga ik de brug met de grote diameter vervangen door een kleinere, namelijk de 18 G brug.

De kleinere brug zal de emulsie nog dikker maken. Om van brug te wisselen, breng ik alle emulsie over in één spuit. Ik verwijder de lege spuit, zorg dat er niets in de brug verloren gaat, verwijder de brug, plaats de nieuwe brug, verdrijf alle luchtbellen en bevestig vervolgens de andere spuit opnieuw.

En ik herhaal de procedure; de emulsie is nu veel stroperiger, dus ik ben voorzichtig om deze brug, die erg fragiel is, niet te verbreken. Ik herhaal deze procedure met een andere set spuiten zolang er nog emulsie in mijn buis zit. Ik gebruik dus zoveel spuiten als nodig is om alle emulsie te verbruiken.

Ik heb de emulsie nu meerdere keren gemengd, misschien wel 10 tot 15 keer, hoewel dit per batch verschilt. Het wordt nu extreem zwaar om doorheen te mengen. Ik zal het nog een paar keer doen, nou ja, misschien niet.

Het zit nu echt vast, dus ik laat het zo staan. Anders is er een risico dat er ofwel een spuit of de bridge breekt. Dus wanneer het niet meer doorgaat, en dat gebeurt zeer vroeg in het proces, betekent dat dat de bridge mogelijk verstopt is.

Maar op dit punt, aangezien ik het ten minste 10 of 15 keer heb gemengd, betekent dit dat de emulsie klaar is. Het is zeer dik, dus ik moet het nu met rust laten. Nu ga ik het in aluminiumfolie wikkelen en een nacht in de koelkast zetten.

Gisteren hebben we de emulsie met rode ruggenmergen bereid en de emulsie een nacht in de koelkast laten staan. Vandaag halen we deze eruit en gaan we deze injecteren, 200 µL per rat, aan de basis van de staart. Maar voordat we injecteren, moeten we controleren of de emulsie goed is.

Het zou dus nog steeds vast moeten zijn, en het is inderdaad een mooie vaste stof. De barst die u hier ziet, geeft zelfs aan dat het een goede vaste stof is en dat deze niet is gescheiden in fasen, in twee fasen, wat ongewenst zou zijn. Deze emulsie is dus geschikt voor gebruik.

Elke kooi krijgt 200 µL van onze emulsie. Voor de injectie gebruiken we spuiten van 3 ml, waarbij we ervoor zorgen dat we spuiten met een Luer-lock aansluiting gebruiken; als we spuiten met een slip-tip gebruiken, is de emulsie zo dik dat de naald eruit kan schieten tijdens het injecteren.

Gebruik daarom altijd een spuit met luer-lock aansluiting. Voor de naald proberen we de kleinst mogelijke maat te gebruiken, maar bij een emulsie van deze dikte is een naald van 20 gauge noodzakelijk. Omdat we zeer nauwkeurig aan de basis van de staart moeten injecteren, anesthetiseren we de ratten gedurende enkele minuten en maken we gebruik van het feit dat de ratten diep in slaap zijn om ze te markeren.

We gebruiken oorstansen, waarbij elke rat wordt geïdentificeerd door een specifiek stanspatroon. We zijn nu klaar om de ratten te injecteren; we dienen elke rat 200 µL emulsie toe aan de basis van de staart en markeren tegelijkertijd de oren. Ik bereid de emulsie in de injectiespuit slechts voor één rat tegelijk voor, omdat injecteren vaak erg moeilijk is en ik hard moet drukken, en ik wil voorkomen dat een rat meer krijgt dan nodig is.

Ik vul de spuit dus telkens voor slechts één hu. Om de spuit te vullen, verbind ik mijn plastic injectiespuit met de brug die op zijn beurt is verbonden met de glazen spuit waarin de emulsie zich bevindt. Ik breng ongeveer 300 microliters emulsie aan in mijn plastic spuit.

Vervolgens bevestig ik de naald en druk ik de lucht uit de naald, zodat ik deze 50 µL dode ruimte in de naald niet verlies. Ik zorg ervoor dat ik precies 200 µL heb en injecteer dit vervolgens aan de basis van de staart van de rat. Nu we al onze harten hebben geïnjecteerd, zullen we deze dagelijks monitoren.

We zullen ze elke ochtend wegen en tweemaal daags controleren op klinische tekenen van EAE. De eerste tekenen, die ik zal laten zien zodra ze zich voordoen, zullen een slappe staart zijn; we verwachten deze tekenen bij de eerste ratten rond dag zeven of acht na injectie te zien. De meeste ratten zullen rond dag 10 tot 12 ziek worden, en de laatst zieke ratten rond dag 15 tot 17.

We zijn nu op dag 13 nadat we de harten hebben geïmmuniseerd met de ruggenmergemulsie, en ik ga nu deze dieren monitoren om hun klinische score te controleren. Maar voordat ik dat doe, laat ik u zien hoe we onze dieren huisvesten. Auto-immuunziekten hebben namelijk de eigenschap dat elk pathogeen dat in het dier aanwezig is, de auto-immuunrespons zal verminderen.

Om dit tot een minimum te beperken, huisvesten we onze ratten onder specifieke omstandigheden. Ze verblijven in deze cabine, die voorzien is van gefilterde lucht en onder overdruk staat; de dieren zelf worden gehuisvest in geautoclaveerde kooien. Alles in de kooi wordt dus absoluut geautoclaveerd voordat we de ratten erin plaatsen.

En ze hebben filters bovenop de kooien. Het voer is het standaard knaagdiervoer. Het is I-georigineerd.

Daarnaast geven we onze ratten aangezuurd water. We nemen normaal drinkwater en voegen zoutzuur toe volgens standaardprotocollen; we gebruiken aangezuurd water om de darmflora tot een minimum te beperken, wat het risico op een belemmering van onze auto-immuunrespons vermindert. Ik ben nu klaar om de klinische scoring van mijn ratten uit te voeren.

De score varieert van nul, wat betekent dat er geen klinische symptomen zijn, tot zes, wat een morbide toestand is waarbij de dieren worden geofferd. Ik zal u nu stap voor stap voorbeelden laten zien van elke klinische score die we in dit model kunnen vinden. We bevinden ons nu op dag 13 na de immunisatie van de ratten met UCAE.

En in die kooi heb ik twee ratten die nog niet ziek zijn geworden. Ze vertonen dus absoluut geen klinische tekenen van ziekte. Beide ratten zijn dus nog gezond.

Ze rennen rond, rennen heen en weer, en zoals u kunt zien, tillen ze hun staart op uit de strooisel wanneer ze bewegen. Soms laten ze de staart drogen, maar meestal proberen ze deze uit het strooisel te tillen. En als ze de kans krijgen, klimmen ze ook uit de kooi, wat betekent dat ze volledige controle hebben over alle vier de ledematen en dat ze kunnen opstaan indien nodig.

Het eerste klinische teken van EA is een slapstaart. Als ik een rat oppak en met mijn vinger tegen de staart druk, zal de rat de neiging hebben om met de staartpunt vast te grijpen. Zoals u zojuist heeft gezien, heeft deze rat geen slappe staart, en ik kan dit ook bij de andere rat doen.

De staart grijpt de vinger, wat betekent dat deze ratten een volledig reactieve staart hebben. Ze hebben een klinische score van nul, wat in feite betekent dat er helemaal geen symptomen zijn. Hier is een rat met een klinische score van 0,5.

Als u het dier gewoon in de kooi observeert, vertoont het absoluut normaal gedrag; het rent rond en klimt tegen de wand van de kooi op, maar de punt van de staart raakt het strooisel nooit. Deze rat kan dus een gedeeltelijke staartlaesie hebben. Daarom pak ik de rat vast en voer ik dezelfde test uit, en hoewel de staart enige tonus vertoont, krult het uiteinde niet volledig om mijn vinger.

Ik geef deze rat daarom een score van 1,5, wat duidt op een gedeeltelijk slap staartje. Een klinische score van 1 wordt gekenmerkt door een volledig slappe staart, waarbij geen enkel deel van de staart spierspanning vertoont, maar de rat nog wel de achterpoten kan gebruiken. Zoals u kunt zien, staat deze rat tegen de zijkant van de kooi, wat aantoont dat de achterpoten normaal functioneren.

Maar als ik de staart van die ratten controleer door ze op te tillen, is er absoluut geen spierspanning in hun staart. Een andere test die u kunt uitvoeren is wanneer de RU zich onderin de kooi bevindt; als u de staart optilt bij een normale ru, zal de staart langzaam zakken of bij een RU met een score van één misschien zelfs de grond niet bereiken. Als u de staart optilt bij deze ratten, zal deze onmiddellijk naar de grond vallen.

Deze RU kan alle vier de ledematen bewegen, maar de achterpoten zijn te zwak om deze RU in staat te stellen op te staan. Daarom classificeer ik deze RU met een klinische score van twee. Het belangrijkste verschil tussen een score van één en twee is dat een score van één enkel een slap staartje inhoudt.

De achterpoten zijn volledig functioneel, en bij een score van drie zou de rat op zijn zij vallen. Twee is een tussenstadium, waarbij de rat zijn achterzijde, zijn achterpoten, kan gebruiken, maar deze zijn veel zwakker dan die van een normale rat. Deze rat vertoont dus een ongebruikelijk kenmerk van EAE.

Normaal gesproken wordt EAE gekenmerkt door een opstijgende slapteverlamming, maar in sommige gevallen, die vrij zeldzaam zijn, zoals hier, ontwikkelen de ratten eerst verlamming van de voorpoten voordat de achterpoten verlamd raken. Dat is het geval bij deze rat. Als u ernaar kijkt, ziet u dat de kop lager ligt dan de rest van het lichaam, omdat de rat problemen heeft met de voorpoten en niet tegen de zijkant van de kooi kan klimmen.

En hoewel zijn achterpoten normaal functioneren, kan hij zich niet met zijn voorpoten afzetten. Daarom zou ik deze rat nog steeds een score van twee geven, wat zou overeenkomen met milde parese, hoewel we dat normaal gesproken bij de achterpoten zien in deze RU; we zien het hier bij de vier ledematen. Deze RU heeft dus een veel ernstiger fenotype dan de vorige.

Het heeft een klinische score van drie. Zoals ik u zal laten zien, functioneren de voorpoten volkomen normaal, maar de twee achterpoten vertonen een matige parese. Beide achterpoten kunnen door het proefdier worden gebruikt om te bewegen, maar het proefdier valt op zijn zij en kan deze poten niet volledig controleren.

Deze sporen worden veel zwakker dan ze normaal gesproken zouden zijn zonder EE. In dat stadium maken we ons geen zorgen meer over slapheid van de staart, omdat veel van die ratten na verloop van tijd een zeer stugge staart krijgen. Deze heeft nog steeds een zeer slappe staart, maar soms is er dystonie zichtbaar. De staart begint dan op een ongecoördineerde manier te bewegen.

We kijken op dit niveau niet langer naar de staart, maar alleen naar hoe de ledematen functioneren. We geven dit een score van 3,5 omdat wanneer we naar de achterpoten kijken, er één beweegt, maar de andere volledig verlamd is en totaal niet bijdraagt aan de voorwaartse beweging van de rat. Dit wordt beschouwd als een volledige verlamming van één achterpoot en daarom volgt een score van 3,5.

Deze RU heeft een klinische score van vier, wat duidt op een complete verlamming van de achterpoten, gekenmerkt door een volledige onmogelijkheid om de achterpoten te bewegen. De rat in deze kooi heeft een klinische score van vijf, wat overeenkomt met een complete verlamming van de achterpoten in combinatie met incontinentie. Dit dier is incontinent, zoals we kunnen zien aan het feit dat het volledig nat is in dit gebied, wat we niet zien bij de andere dieren die niet incontinent zijn.

Wanneer onze HUS-scores drie of hoger zijn, geven we ze waterflessen met lange drinkbuisjes om er zeker van te zijn dat ze toegang hebben tot het water. Daarnaast plaatsen we voedsel op de bodem van de kooi en geven we ze gelpacks. Ondanks al deze maatregelen bieden we de ratten telkens wanneer we ze monitoren, wat twee keer per dag gebeurt, water aan, voor het geval ze gedurende de dag onvoldoende water hebben kunnen drinken.

Hier heb ik een rat met een klinische score van vier. In dat stadium moeten deze dieren een beetje worden aangemoedigd om te eten. Daarom maak ik hun voer nat, waardoor het voor hen veel gemakkelijker is om te kauwen.

Gedurende de afgelopen twee weken heb ik u laten zien hoe u chronisch relapsing EAE kunt induceren en monitoren bij DA-ratten. In de eerste stap heb ik u getoond hoe u de immersie van het ruggenmerg bereidt en vervolgens hoe u dit injecteert aan de basis van de staart van deze ratten. Vandaag heb ik u laten zien hoe u deze ratten kunt scoren op basis van verschillende stadia van de ziekte.

Natuurlijk is dit een chronisch recidiverend model, dus we verwachten dat de ratten fluctuerende scores zullen vertonen. De ziekte zal over een paar dagen in remissie gaan en zal na verloop van tijd recidiveren. Sommige ratten zullen overgaan in een meer chronische fase van de ziekte.

Dit zal per dier verschillen. Nu we deze video afronden, wil ik nog één ding benadrukken over het testen van geneesmiddelen in deze modellen. Een zeer belangrijk punt is om de dieren zo goed mogelijk te randomiseren.

Een zeer belangrijk punt om te weten is dat hoe eerder het dier ziek wordt, hoe ernstiger de ziekte is. Daarom wilt u niet alle controledieren op de eerste dag groeperen en de behandelde dieren in de daaropvolgende dagen. Wat we doen, is dat we de dieren op de dag dat ze ziek worden en we de behandeling willen starten, willekeurig in twee verschillende groepen plaatsen.

Als we bijvoorbeeld één controlegroep en één behandelde groep hebben, komt het eerste hart in de controlegroep, het tweede in een behandelde groep, enzovoort totdat alle dieren in hun eigen groep zijn geplaatst. We zorgen er echter voor dat deze randomisatie zo vroeg mogelijk in het protocol plaatsvindt. Ik hoop dat deze video nuttig voor u was en dat u in staat zult zijn om chronisch recidiverende EAE in D-ratten te induceren en te monitoren.

En veel succes met uw experimenten.