Name: Large Scale zebravis-Based In vivo Kleine Molecule Screen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Ontdek een grootschalige screening van kleine moleculen met zebrafishembryo's in 96-wellplaten. Deze methode identificeert verbindingen die de embryonale ontwikkeling en fysiologie moduleren voor drugsonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1) zebravis Ei Collectie <ol><li> Op de middag voorafgaand aan de dag van de chemische scherm, opgezet 10 tot 20 zebravis kweekbakken. Vul elke tank met water uit de aquacultuur systeem. Met behulp van een visnet, overdracht een volwassen man en een tot twee volwassen vrouwtjes tot innerlijke container in elk kweekbak. Scheiden de mannelijke en vrouwelijke vis uit elkaar met een divider. Het etiket van de kooien en doe een deksel over hen. </li><li> Op de ochtend van het scherm, verwijder de verdelers van de kweekbakken en laat zebravis om te paren. In de loop van volgende een uur, laat bevruchte eieren door het rooster vallen op de bodem van elke binnenverpakking container. </li><li> Na 1 uur, terug volwassen zebravissen naar permanente opslag tanks, verwijder dan de binnenste container en het verzamelen van de eieren door zeven het water van elk kweekbak door middel van een plastic theezeefje. </li><li> Keer de zeef op een petrischaaltje en voorzichtig spoel de zeef om de eieren te spoelen in de petrischaal met behulp van een wasfles met de E3 medium. </li><li> Alle onbevruchte eieren, die verschijnen ondoorzichtige, moeten worden verwijderd met een wegwerp plastic pipet. Elke paring kruis moet opleveren van ongeveer 200 embryo&#39;s. </li></ol> 2) Arraying embryo&#39;s in 96-well platen <ol><li> Breng ongeveer 5 embryo&#39;s in E3 medium in elke well van een 96-wells plaat met behulp van een glas Pasteur pipet. </li><li> Zodra embryo&#39;s worden geschaard op de 96-well plaat, verwijder zoveel mogelijk van de E3 medium mogelijk uit de bronnen met behulp van een 12-kanaals (30 - 300 ul) pipet, zorg ervoor dat u doorboren het embryo. Met behulp van de 12-kanaals pipet, leveren 250 ul van E3 medium dat 0.5μg/ml kanamycine aan elk putje zo snel mogelijk zo niet toe te staan ​​embryo&#39;s op te drogen. </li><li> Leg de 96-well platen in de 28,5 ° C incubator totdat ze de gewenste fase waarin de verbindingen worden toegevoegd. </li></ol> 3) Overdracht van kleine molecule Bibliotheek Terwijl de compound overdracht kan worden geautomatiseerd met robots overdracht methoden, beschrijven we de handleiding overdrachtmethode. <ol><li> Klein molecuul-bibliotheken worden meestal geleverd in een 96-wells formaat, met elke verbinding opgeslagen in DMSO als een 10 mM voorraad. Ongeveer 60 minuten voor de embryo&#39;s het podium te bereiken wanneer de verbindingen moeten worden toegevoegd, dooi een gewenst aantal 96-well platen bevattende fracties van kleine moleculen (bron plaat). Kennis te nemen van de seriële of ander identificatienummer van de bron platen. Te minimaliseren condensatie op de borden, kan ontdooien optreden in een kamer met verdroging Drierite (WA HAMMOND DRIERITE CO, Xenia, OH). </li><li> Kort spin down de platen in een tafelblad centrifuge uitgerust met een multi-well plaat adapter. </li><li> Verwijder de aluminium plakband van de bron plaat. Met behulp van een 12-kanaals pipet, verdunnen de verbindingen in de bron plaat om de concentratie van 0.5 mM (bijvoorbeeld wanneer beginnen met 250 nL fracties van 10mm voorraad, voeg 4,75 ul van DMSO aan elk putje). </li><li> Als de embryo&#39;s in de 96-well plaat (ontvanger plaat) het gewenste stadium te bereiken, gebruik dan een 12-kanaals (2-20 pi) pipet op 2.5μL van verbindingen (0,5 mm) over te dragen van de bron platen in de ontvanger platen met de embryo&#39;s. </li><li> Noteer het identificatienummer van de bron platen op de ontvanger embryo platen. Dek de ontvanger platen nu met de embryo&#39;s en verbindingen met deksels, meng de platen onder voorzichtig schudden, en leg ze in een 28,5 ° C incubator. </li><li> Bedek elke bron bord met ongebruikt kleine moleculen (0,5 mm) met een aluminium afdichting tape en plaats in een -80 ° C vriezer voor opslag op lange termijn. </li></ol> 4) Screening voor de effecten van kleine moleculen door visuele inspectie van fenotypes <ol><li> Voorafgaand aan het uitvoeren van het scherm, formuleren een specifiek criterium voor wat een &quot;hit&quot; vormen. </li><li> Op de gewenste tijden in ontwikkeling, verwijder de 96-well platen bevattende verbinding behandelde embryo&#39;s daarvan uit incubator en onderzoek elk goed onder een stereomicroscoop. Voor een betere visualisatie van subtiele veranderingen, zoals veranderingen in de bloedsomloop patroon, kan een fase-contrast omgekeerde microscoop worden gebruikt. Fluorescentie microscopie kan worden gebruikt om verstoring van de expressie van GFP of DsRed eiwitten te onderzoeken onder een weefsel-specifieke promotor. </li><li> Snel scannen van de 96-wells platen voor elke goed waarbij ten minste 3 van de 5 embryo&#39;s vertonen het voorgeschreven &quot;hit&quot; fenotype. Noteer de identiteit van de plaat en de goed plaats van elke potentiële hit. </li><li> Herbevestigen een potentieel getroffen door opnieuw testen van de effecten van de verbinding bij verschillende doses (1 uM, 5 uM, 10 uM en 50 uM). Voor elke dosis, worden 10 embryo&#39;s getest in 0,5 ml van de E3 media in een 48-wells plaat-formaat. De timing van samengestelde aanvulling voor hertesten moet identiek zijn aan die van de oorspronkelijke screening. Een hit wordt bevestigd wanneer de opgewekt fenotype wordt gereproduceerd op opnieuw testen van de compound </li><li> Identificeer de hit verbinding uit de database van kleine moleculen in de chemische bibliotheek. </li></ol>

<ol><li>Bayliss, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+modulation+of+receptor+signaling+inhibits+regenerative+angiogenesis+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Chemical modulation of receptor signaling inhibits regenerative angiogenesis in adult zebrafish.</a> Nature chemical biology. 2, 265-273 (2006).</li>
<li>Burns, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+assay+for+small+molecules+that+modulate+zebrafish+embryonic+heart+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput assay for small molecules that modulate zebrafish embryonic heart rate.</a> Nature chemical biology. 1, 263-264 (2005).</li>
<li>Hao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+structure-activity+relationship+study+of+dorsomorphin+analogues+identifies+selective+VEGF+and+BMP+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">In vivo structure-activity relationship study of dorsomorphin analogues identifies selective VEGF and BMP inhibitors.</a> ACS chemical biology. 5, 245-253 (2010).</li>
<li>Hong, C. C., Peterson, Q. P., Hong, J. Y., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artery%2Fvein+specification+is+governed+by+opposing+phosphatidylinositol-3+kinase+and+MAP+kinase%2FERK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Artery/vein specification is governed by opposing phosphatidylinositol-3 kinase and MAP kinase/ERK signaling.</a> Curr Biol. 16, 1366-1372 (2006).</li>
<li>Milan, D. J., Peterson, T. A., Ruskin, J. N., Peterson, R. T., MacRae, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugs+that+induce+repolarization+abnormalities+cause+bradycardia+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Drugs that induce repolarization abnormalities cause bradycardia in zebrafish.</a> Circulation. 107, 1355-1358 (2003).</li>
<li>Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+developmental+screens+reveal+the+logic+and+timing+of+vertebrate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 12965-12969 (2000).</li>
<li>Yu, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsomorphin+inhibits+BMP+signals+required+for+embryogenesis+and+iron+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism.</a> Nature chemical biology. 4, 33-41 (2008).</li>
<li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews%22%5BJournal%5D)">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nature reviews. 4, 35-44 (2005).</li>
<li>Stern, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+that+delay+S+phase+suppress+a+zebrafish+bmyb+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Small molecules that delay S phase suppress a zebrafish bmyb mutant.</a> Nature chemical biology. 1, 366-370 (2005).</li>
<li>Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+suppression+of+a+genetic+mutation+in+a+zebrafish+model+of+aortic+coarctation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation.</a> Nature biotechnology. 22, 595-599 (2004).</li>
</ol>

Bij het plannen van een zebravis-gebaseerde chemische scherm, moet bijzondere aandacht worden besteed aan de robuustheid van het fenotype in kwestie en de achtergrond van een dergelijke snelheid fenotype. Dit is vooral van belang voor schermen voor chemische onderdrukkers van een geïnduceerde fenotype. Bijvoorbeeld, voor een fenotype veroorzaakt door hitte-shock inductie van een transgen, de voorwaarde dat het fenotype induceert reproduceerbaar moet precies in kaart worden gebracht voordat wordt begonnen met het scherm ...

<ol><li> Minimum van 20 paren van volwassen zebravissen van de gewenste genotype. </li><li> Visnetten, Breeding tanks, met uitneembare binnenbak en verdelers (aquatische habitats). </li><li> Petrischalen (10 cm). </li><li> Plastic theezeefje. </li><li> Was de fles waarin zich embryo water. </li><li> Disposable polyethyleen overdracht pipetten. </li><li> Polystyreen 96-well ronde bodem assay platen (Corning COSTAR, Lowell, MA). </li><li> Glas Pasteur pipet (Fisher Scientific). </li><li> Handmatige pipet pomp, 10 ml (Bel-Art Products, Pequannock, NJ). </li><li> E3 embryo medium: 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO 4, met 0,003% PTU (fenylthio-carbamide, Sigma, St. Louis, MO). PTU kunnen worden bereid als een 10x-oplossing door het oplossen van 0,3 g-PTU in 1 L van de E3 embryo media. Oplossingen die PTU moeten worden beschermd tegen licht door afdekken met aluminiumfolie. </li><li> 12-kanaals pipetten, 2-20 pi (Eppendorf). </li><li> 12-kanaals pipetten, 300-300 pi (Eppendorf). </li><li> Wegwerp polystyreen pipet bekken, 50 ml (Fisher Scientific). </li><li> Kleine molecule bibliotheek van structureel diverse verbindingen gekleed in een 96-WLL-formaat op 10 mM voorraad in DMSO. Elke meester plaat is in hoeveelheden verdeeld in 96-well polypropyleen opslag platen (Corning), en opgeslagen bij -80 ° C tot gebruik. </li><li> Aluminium afdichting tape voor 96-well platen (Nunc, Rochester, NY). </li><li> DMSO (Sigma, St. Louis, MO). </li><li> Basic incubator, 28,5 ° C (Fisher Scientific). </li><li> Stereomicroscoop met doorvallend licht-basis (Leica Microsystems, Bannockburn, IL). </li></ol>

large scale zebravis-based in vivo kleine molecule screen

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Gezien hun geringe omvang embryo, snelle ontwikkeling, transparantie, vruchtbaarheid, en tal van moleculaire, morfologische en fysiologische overeenkomsten met zoogdieren, heeft zebravis ontpopt als een krachtig<em&gt; In vivo</em&gt; Platform voor fenotype-based drug-schermen en chemische genetische analyse. Hier demonstreren we een eenvoudige, praktische methode voor grootschalige screening van kleine moleculen met behulp van zebravis embryo&#39;s.

Zebravis heeft ontpopt als een krachtig<em&gt; In vivo</em&gt; Platform voor fenotype-based drug-schermen en chemische genetische analyse. Hier demonstreren we een eenvoudige, praktische methode voor grootschalige screening van kleine moleculen met behulp van zebravis embryo&#39;s.

Large Scale zebravis-Based In vivo Kleine Molecule Screen

Gezien hun kleine embryo-omvang, snelle ontwikkeling, transparantie, vruchtbaarheid en talrijke moleculaire, morfologische en fysiologische overeenkomsten met ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het ontdekken van kleine moleculen die specifiek belangrijke aspecten van de embryonale ontwikkeling en fysiologie moduleren. Dit wordt bereikt door een groot aantal bevruchte eieren in 96-putjesplaten te plaatsen als tweede stap tijdens het screenen. Aliquoten van een bibliotheek met kleine moleculen worden toegevoegd aan de 96-putjesplaten met embryo's in de 96-putjes.De wellplaten worden onderzocht op fenotypes die zijn opgewekt door de kleine moleculen. De resultaten tonen aan welke kleine moleculen specifiek de ontwikkeling of fysiologie van super fish beïnvloeden. Hallo, mijn naam is Charles Hong van de Vanderbilt University School of Medicine.In ons laboratorium voeren we high-throughput chemische screenings uit met zebrafish-embryo's. Dit is een relatief eenvoudige techniek die breed kan worden aangepast om nieuwe bioactieve verbindingen te ontdekken. Richt op de middag vóór de dag van de chemische screening 10 tot 20 kweekbakken voor zebrafish in.Plaats een scheidingswand in elk aquarium en vul elk aquarium met water uit het aquacultuursysteem; breng met een visnet één volwassen mannetje en één tot twee volwassen vrouwtjes o

large-scale-zebrafish-based-in-vivo-small-molecule-screen

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wij rapporteren de ontwikkeling van een systeem voor geautomatiseerde beeldvorming en analyse van transgene zebravis embryo's in multiwell platen. Dit toont de mogelijkheid om dosisafhankelijke effecten van een klein molecuul, BCI, meten op fibroblast groeifactor reporter-gen expressie en leveren van technologie voor de oprichting van high-throughput zebravis chemische schermen.

Ontwikkeling van geautomatiseerde beeldvorming en analyse voor de zebravis chemische schermen.

In dit artikel worden zebravisembryo's gebruikt voor het screenen van chemische toxiciteit. Chemische toxiciteit is gecorreleerd met fenotype-uitlezingen. Het monsterprotocol toont een methodologische benadering van het uitvoeren van de chemische toxiciteitsscreening.

Embryo-gebaseerd chemisch toxiciteitsscherm: effecten op de ontwikkeling van zebravisembryo's beoordelen

Hier beschreven is een protocol voor de semi-geautomatiseerde beeldvorming van weefsel-specifieke fluorescentie in zebravis embryo's.

Semi-geautomatiseerde beeldvorming van Tissue-specifieke fluorescentie in zebravis embryo&#39;s

Deze video artikel beschrijft de high throughput pijpleiding die is met succes tot infectie en analyseren van grote aantallen zebravis embryo's die een nieuw krachtig hulpmiddel voor beproeving en drug discovery met geheel gewerveld organisme.

Oprichting en Optimalisatie van een High Throughput Setup om te studeren<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; En<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infectie als een model voor Drug Discovery

De zebravis is een uitstekend experimenteel organisme om gewervelde ontwikkelingsprocessen en model menselijke ziekten te bestuderen. Hier, een protocol over hoe je een handmatige high-throughput chemische scherm presteren in de zebravis embryo's met een beschrijven we whole-mount in situ hybridisatie (WISH) uitgelezen.

A Manual Small Molecule Screen Naderend High-throughput Met behulp van zebravis embryo&#39;s

De zebravis is een uitstekend modelsysteem voor genetische en ontwikkelingsstudies. Het implanteren van kralen is een waardevolle techniek voor weefselmanipulatie die kan worden gebruikt om ontwikkelingsmechanismen te onderzoeken door veranderingen in lokale cellulaire omgevingen te introduceren. Dit protocol beschrijft hoe microkralenimplantatie in de zebravis-embryo moet worden uitgevoerd.

Microkraal Implantatie in de zebravis embryo

Zebravis embryo's worden gebruikt voor het evalueren van de toxiciteit van chemische verbindingen. Ze ontwikkelen zich extern en zijn gevoelig voor chemicaliën, waardoor subtiele fenotypische veranderingen kunnen worden opgespoord. Het experiment vereist slechts een kleine hoeveelheid stof, die direct wordt toegevoegd aan de plaat die embryo's bevat, waardoor het testsysteem efficiënt en kosteneffectief is.

Snelle evaluatie van de toxiciteit van chemische verbindingen met behulp van zebravis embryo's

Zebrafish xenograft modellen zorgen voor high-throughput drug screening en fluorescerende beeldvorming van menselijke kankercellen in een in vivo micro-omgeving. We ontwikkelden een workflow voor grootschalige, geautomatiseerde medicijnscreening op patiënt-afgeleide leukemiemonsters bij zebravissen met behulp van een geautomatiseerde fluorescentiemicroscoop uitgeruste imaging unit.

Drug Screening van primaire patiënt afgeleid tumor Xenografts bij zebravissen

Dit protocol beschrijft een screeningprocedure voor geneesmiddelen bij zebravislarven 3-7 dagen na de bevruchting, gevolgd door morfologische beoordeling.

Screening van kleine moleculen en toxiciteitstesten bij zebravislarven in een vroeg stadium

RASopathieën zijn multisysteem-genetische syndromen die worden veroorzaakt door hyperactivering van de RAS-MAPK-route. Potentieel pathogene varianten die wachten op validatie duiken continu op, terwijl slecht preklinisch bewijs de therapie beperkt. Hier beschrijven we ons in vivo protocol voor het testen en kruisvalideren van RASopathie-geassocieerde ERK-activeringsniveaus en de farmacologische modulatie ervan tijdens de embryogenese door middel van live FRET-beeldvorming in Teen-reporter...

Een efficiënt protocol om ERK-activiteitsmodulatie te beoordelen in vroege zebravismodellen van het Noonan-syndroom via live FRET-microscopie en immunofluorescentie

Ontdek een grootschalige screening van kleine moleculen met zebrafishembryo's in 96-wellplaten. Deze methode identificeert verbindingen die de embryonale ontwikkeling en fysiologie moduleren voor drugsonderzoek.

Large Scale zebravis-Based In vivo Kleine Molecule Screen

Meer video's verkennen