Large Scale zebravis-Based In vivo Kleine Molecule Screen

Het algemene doel van het volgende experiment is het ontdekken van kleine moleculen die specifiek belangrijke aspecten van de embryonale ontwikkeling en fysiologie moduleren. Dit wordt bereikt door een groot aantal bevruchte eitjes in 96-wells platen te plaatsen als tweede stap van het screeningsproces. Aliquots van een bibliotheek met kleine moleculen worden toegevoegd aan de 96-wells platen met embryo's.

De wellplaten worden onderzocht op fenotypes die door de kleine moleculen zijn opgewekt. De resultaten laten zien welke kleine moleculen specifiek invloed hebben op de ontwikkeling of fysiologie van super-vissen. Hallo, mijn naam is Charles Hong van de Vanderbilt University School of Medicine.

In ons laboratorium voeren we high-throughput chemische screenings uit met behulp van zebrafish-embryo's. Dit is een relatief eenvoudige techniek die breed kan worden toegepast om nieuwe bioactieve verbindingen te ontdekken. Richt op de middag voorafgaand aan de dag van de chemische screening 10 tot 20 kweekbakken voor zebrafish in.

Plaats een scheidingswand in elke tank en vul elke tank met water uit het aquacultuursysteem; breng met behulp van een visnet één volwassen mannetje en één tot twee volwassen vrouwtjes over naar de binnencontainer. Label de kweektanks en plaats op de ochtend van de screening een deksel op elke tank. Verwijder de scheidingswanden uit de kweektanks en laat de zebravissen paren.

Gedurende het volgende uur mogen de bevruchte eitjes door het rooster aan de onderzijde van elke binnencontainer vallen. Keer de volwassen zebravis na één uur terug naar de permanente opslagtanks.

Verwijder de binnencontainer en verzamel de eitjes door het water uit elk kweekvat door een plastic theezeefje te zeven. Keer het zeefje om boven een Petrischaal en spoel het zeefje voorzichtig af om de eitjes in de Petrischaal te spoelen. Gebruik een spuitfles met E three-medium om alle onbevruchte eitjes, die er opaak uitzien, te verwijderen.

Met behulp van een wegwerpplasticpipet moet elke paringskruising ongeveer 200 embryo's opleveren. Draag vervolgens ongeveer vijf embryo's in E3-medium met een glazen Pasteurpipet over naar elke put van een 96-wells plaat. De embryo's zijn nu gerangschikt op een 96-wells plaat.

Verwijder zoveel mogelijk van het E three-medium uit de wells met behulp van een 12-kanaals pipet. Let erop dat de embryo's niet worden doorprikt. Voeg met de 12-kanaals pipet 250 µL E three toe.

Voeg zo snel mogelijk medium met 0,5 µg/mL kanamycine toe aan elke put, zodat de embryo's niet uitdrogen. Plaats de 96-wells platen in een incubator op 28,5 °C tot ze het gewenste stadium hebben bereikt waarop de verbindingen moeten worden toegevoegd. In dit protocol zoeken we naar verbindingen die de vroege embryonale patroonvorming verstoren en zullen we de embryo's drie uur incuberen, of totdat meer dan 90% van de embryo's het 1000-celstadium heeft bereikt; kleine molecuulbibliotheken worden doorgaans geleverd.

In een bronplaat met 96 wells, waarin elke verbinding is opgeslagen in DMSO als een voorraad van 10 millimolair, laat een passend aantal 96-wells platen met aliquots van kleine moleculen ontdooien ongeveer 60 minuten voordat de embryo's het gewenste stadium bereiken. Noteer het serienummer of andere identificatienummer van de bronplaten om condensatie op de platen te minimaliseren. Plaats ze in een desiccatiekamer met droogmiddel.

Centrifuge de platen kort in een tafelcentrifuge die is uitgerust met een adapter voor multi-well platen. Verwijder de aluminium seal van de bronplaat met een 12-kanaals pipet en verdun de verbindingen in de bronplaat tot de gewenste concentratie met DMSO. In dit protocol gebruiken we een uiteindelijke concentratie van 0,5 millimolair en voegen we 4,75 µL DMSO toe om de 10 millimolaire stockplaat te verdunnen.

Wanneer de embryo's in de 96-wellsplaat het gewenste stadium hebben bereikt, gebruik dan een 12-kanaals pipet om 2,5 µL van de verbindingen van de bronplaten over te brengen naar de ontvangstplaten met de embryo's. Dek de platen die nu de embryo's en verbindingen bevatten af met deksels en noteer het identificatienummer van de bronplaten op de embryo-platen. Meng de platen door ze voorzichtig te ronddraaien en plaats ze in een incubator van 28,5 °C.

Dek elke bronplaat met ongebruikte kleine moleculen af met een aluminiumfolie, plak deze vast en plaats ze in een vriezer van -80 °C voor langdurige opslag. Formuleer vóór het uitvoeren van de visuele screening een specifiek hit-criterium. Bijvoorbeeld, bij een screening naar kleine molecuulremmers van four brain development kan een hit een verbinding zijn die leidt tot het verlies van de voorhersenen.

De afwezigheid van ogen is een eenvoudige visuele indicator voor het verlies van de voorhersenen en vereist geen fluorescentie om op gewenste tijdstippen tijdens de ontwikkeling te analyseren. Haal de 96-wells platen met de met verbindingen behandelde embryo's uit de incubator en onderzoek elke well onder een stereomicroscoop; bij het screenen op kleine molecuulremmers van de ontwikkeling van de voorhersenen moeten de platen na 28 uur worden gecontroleerd op het verlies van het oog als marker voor remming van de ontwikkeling van de voorhersenen. Noteer de identiteit van de plaat en de locatie van de well voor elke well waarin ten minste drie van de vijf embryo's het voorgeschreven fenotype vertonen. Plaats de 96-wells plaat terug in de incubator.

Bevestig opnieuw het verlies van de ogen en de voorhersenen na 48 uur. Hoewel de embryo's geen voorhersenen zullen hebben, overleven ze tot ten minste vier dagen. Bevestig een potentiële hit door de effecten van de verbinding bij verschillende doses opnieuw te testen; voor elke dosis worden 10 embryo's getest in 0,5 milliliter E3-medium in een 48-wells plaatformaat.

De timing van de compound-editie voor herhalingstests moet identiek zijn aan die van de oorspronkelijke screening. Een HIIT wordt bevestigd wanneer het opgeroepen fenotype bij herhalingstests van de compound op een dosisafhankelijke wijze wordt gereproduceerd. Identificeer tot slot de hi-compound uit de database met kleine moleculen in de chemische bibliotheek.

Met behulp van de visuele chemische screening op basis van zebravis hebben we een klein molecuul dat de hedgehog-signalering remt ontdekt, op basis van het effect ervan op de lichaamsas. Deze afbeelding toont embryo's die zijn blootgesteld aan de hedgehog-remmer en een duidelijke ventrale kromming van de staart vertonen. De embryo's die na 24 uur zijn onderzocht, vertonen na 48 uur nog steeds hetzelfde ventraal gekromde fenotype.

Deze afbeelding toont het met een verbinding behandelde embryo vergeleken met het embryo van een mutant in het hedgehog-pad. Zodra deze techniek onder de knie is, kan één persoon in slechts enkele uren ongeveer 400 verbindingen per week screenen. Deze techniek heeft daarnaast de weg vrijgemaakt voor chemisch biologen om zaken te bestuderen zoals celontwikkeling, cel-signaleringsroutes en embryonale ontwikkeling.

Bij het werken met niet-gekarakteriseerde kleine moleculen is het belangrijk om de juiste veiligheidsmaatregelen te nemen en laboratoriumjassen en handschoenen te gebruiken, aangezien deze niet-gekarakteriseerde moleculen potentieel gevaarlijk kunnen zijn.