Name: Gene Levering aan Postnatale Rat Brain door niet-ventriculaire Plasmide-injectie en elektroporatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-17T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Leer een niet-virale methode voor genlevering aan het postnatale rattenbrein via plasmide-injectie en elektroporatie. Deze techniek biedt een efficiënt alternatief voor virale vectoren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Ekaterina Karelina voor hulp bij het opnemen van soundtrack voor de video, Ivan Molotkov voor 3D animatie en dr. Peter Blaesse voor CAG-EGFP-plasmide voorbereiding. Het werk werd ondersteund door subsidies van het Centrum voor Internationale Mobiliteit van Finland, de Finse Cultural Foundation en de Academie van Finland.

1. Introductie Creatie van transgene dieren is een krachtige methode van onderzoek van de genetische functies in levende dieren en een voor het ontrafelen van de ziekte-mechanisme 2,3 evenals voor het manipuleren van de eigenschappen van cellen 4. Echter, de procedure is nogal bewerkelijk, zeer tijdrovend en duur, zo rechtvaardigt het gebruik van alternatieve gen delivery methoden zoals virale injectie 5, neonatale ventriculaire injectie met elektroporatie 6 en in de baarmoeder elektroporatie 7,8. De methode van postnatale non-ventriculaire injectie en elektroporatie heeft een unieke set van voordelen: gebruik van niet-virale genetische constructen, de mogelijkheid om een lokale uitdrukking patroon in het gebied van belang te creëren, in situ transfectie van niet-trekkende soorten cellen, zoals corticale astrocyten. In deze video, tonen we de gedetailleerde procedure van postnatale gen levering aan de neonatale rat hersenen met behulp van een plasmide dat codeert voor de verhoogde green fluorescent eiwit onder kip beta actine-promotor met CMV enhancer (pCAG-EGFP) 9. We illustreren de bereiding van het plasmide-bevattende oplossing voor injectie, productie van dunne glazen pipetten en assemblage van de microinjector op een stereotactische instrument. Dan praten we over verdovende jonge ratten met isofluraan, over het uitvoeren van de operatie, over de injectie procedure en over de elektroporatie met behulp van pincet elektroden en de in vivo porator. Tot slot bespreken we kort de verwachte resultaten, perspectieven en problemen die zich kunnen voordoen tijdens deze experimenten. 2. Plasmide Voorbereiding voor Elektroporatie <ol><li> We meestal voor te bereiden 10 ul van het plasmide injectie oplossing in een 200 ul dunne wand buis. Deze oplossing is voldoende voor een aantal experimenten. </li><li> We mix 8 ul van het plasmide-oplossing (zie materialen en apparatuur) met 1 pi van de 10X PBS (zie materialen en apparatuur) en een pi van 0,1% snel groen water-oplossing (zie materialen en apparatuur). </li><li> De uiteindelijke concentratie van het plasmide in de injectie-oplossing moet worden tussen de 1 en 3 ug / ul. Lagere concentraties van plasmide DNA vermindert de transfectie-efficiëntie, terwijl de hogere DNA-concentratie zal ook viskeuze voor injectie worden door de dunne uiteinde van de glazen capillair. </li></ol> 3. Glas Naald Voorbereiding <ol><li> Voor de glazen pipet voorbereiding maken we gebruik van borosilicaatglas capillair met een gloeidraad (zie materialen en apparatuur) en een verticale glazen elektrode trekker (zie de materialen en apparatuur) op maximum te trekken en verwarming parameters. </li><li> Vervolgens hebben we breken de punt van de pipet met behulp van een stukje papier om een ​​tip 10-20 micrometer in diameter bereiken. </li><li> Wij controleren de tip diameter en de vorm onder de microscoop doelstelling. </li></ol> 4. Microinjector Montage <ol><li> Met behulp van een dunne polymeerlaag capillair (zie materialen en apparatuur) vullen we ongeveer 1 / 3 van het volume van een 10 ul Hamilton spuit (zie materialen en apparatuur) met minerale olie (zie materialen en apparatuur). Vermijd luchtbellen! </li><li> Vervolgens vullen we de glazen pipet met minerale olie en steek de pipet in de Hamilton spuit. Vermijd luchtbellen! </li><li> De spuit met glazen pipet wordt vervolgens vastgesteld op de microinjector aangesloten op een controller (zie materialen en apparatuur). </li><li> De micro-injectie setup bevestigd op een stereotactische instrument (zie materialen en apparatuur) laat ons toe om het uiteinde van de glazen pipet veilig onder te dompelen in de buis met het plasmide oplossing voor injectie. </li><li> Wanneer de tip het oppervlak van de oplossing raakt, dip het verder door 1 of 2 mm en vul de pipet met ongeveer 1 pl van de injectie mengen met behulp van de micro-injector controller. </li></ol> 5. Verdovende dier Alle procedures die hier werden uitgevoerd volgens de Universiteit van Helsinki regelgeving voor dierproeven. <ol><li> Voor elk experiment, vullen we een gasdichte injectiespuit (zie materialen en apparatuur) met ongeveer 2 ml van isofluraan (zie materialen en apparatuur). </li><li> Dan de spuit wordt bevestigd op de anesthesie-eenheid (zie materialen en apparatuur) is aangesloten op de luchtstroom bron, het dier doos en het masker vast op stereotactische setup. </li><li> Op de anesthesie apparaat, passen we de luchtstroom tot ongeveer 250 ml / min en de isofluraan niveau tot 4%. </li><li> We plaatsen de rat pup in het dier box voor 2-5 minuten. </li><li> Als de pup stopt met bewegen, plaats het op het verwarmingselement (zie materialen en apparatuur) aan de stereotactische setup. </li><li> Plaats een rostrale deel van pup het hoofd in de verdovende masker. </li><li> Het duurt 5 tot 10 minuten voor depup naar de diepe narcose te gaan. </li><li> Controleer anesthesie diepte met een staart knijpen en afname van de instroom isofluraan om ongeveer 1,5 tot 2,0%. </li></ol> 6. Chirurgie, micro-injectie en elektroporatie <ol><li> Behandel de huid op de pup het hoofd met de 70% ethanol. </li><li> Met behulp van een klein schaartje (zie materialen en apparatuur) en dunne tang (zie materialen en apparatuur), snijd de huid van een nekvel van de pup aan zijn voorhoofd. </li><li> Zijwaarts buigen huid stukken en trek het oor bars iets in auditieve openingen van de schedel voor hoofd en huid fixatie. </li><li> Met behulp van een binoculaire microscoop, zoeken we de bregma punt op de schedel. </li><li> Identificeer de regio van belang het gebruik van de stereotactische coördinaten. </li><li> Plaats de injectie pipet boven dit gebied en markeer dit door te laten vallen 25-50 nl van de injectie-oplossing op de schedel oppervlak. </li><li> Boor de schedel zachtjes en voorzichtig op de gemarkeerde punt met behulp van een hoge snelheid chirurgische boor (zie materialen en apparatuur) onder de microscoop tot vloeistof verschijnt in het geboorde gebied. </li><li> Fix een electropotation pincet elektroden (zie materialen en apparatuur) aan de zijkanten van de schedel met de huidige geleidende gel (zie materialen en apparatuur) om een ​​betere geleiding te bereiken. </li><li> Verwijder de vloeistof in het boorgat met behulp van kleine tampon (zie materialen en apparatuur) en dompel het glas naald om het gat op basis van de coördinaten van de plaats van injectie. </li><li> Trekken 25 tot 100 nl van de injectie-oplossing tegen het tarief van 5 tot 20 nl / sec. </li><li> Snel verwijderen van de pipet en electroporate onmiddellijk. Elektroporatie wordt gedaan door het toepassen van vijf rechthoek pulsen met de duur van 50 ms en een amplitude van 99 V op de frequentie van 1 Hz. </li><li> Verwijder de elektroden en oor bars. </li><li> Naai de cut huid met behulp van een combinatie van een stomme (zie materialen en apparatuur) en scherpe tang en chirurgische onderwerpen (zie de materialen en apparatuur). </li><li> Plaats de pup in de warme kamer voor 15-30 minuten om zijn herstel na anesthesie hulp. </li><li> Dan zet de pup terug naar zijn moeder kooi. </li></ol> 7. Representatieve resultaten De expressie van het transgen in het succes getransfecteerde cellen zal verschijnen ongeveer 10 uur na de elektroporatie, en het stabiel blijft gedurende enkele weken. We gemicroinjecteerd het plasmide ofwel in een diepe corticale lagen of striatum gebied van postnatale dag 2 (P2) Wistar ratten pups en uitgevoerd in vivo elektroporatie zoals hierboven beschreven. Brain plakken (400 um in dikte) werden gesneden na 2 tot 6 dagen (P4-P8) met behulp van een vibrotome in koud snijden medium (Hepes gebufferd Balanced Salt Solution Earle's) 10. Afbeelding acquisitie werd uitgevoerd met behulp van Zeiss Axioplan 2 LSM5 Pascal confocale microscoop (Zeiss, Duitsland) in het snijden medium bij kamertemperatuur. De injectieplaats in diepe corticale lagen en striatum bevatte veel getransfecteerde cellen die EGFP die zich in een compact gebied van ongeveer 200-300 micrometer in diameter (figuur 1A, B). Binnen de getransfecteerde cellen, het EGFP expressie niveau hoog genoeg is om beeldvorming van dunne cellulaire processen (figuur 1C) met inbegrip van dendrieten met stekels van verschillende vormen (figuur 1D) en axonen bundels (figuur 1E). De robuuste stabiliteit van EGFP en levensvatbaarheid van de cellen na elektroporatie toegestaan ​​traceren distale delen van axonen (tot 1,5 tot 2 mm van cellichamen) zoals corticale terminals (Figuur 1F). <img src="/files/ftp_upload/2244/2244fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. (A) succesvol getransfecteerde cellen in het striatum regio van P4 hersenen van de rat de afbakening van de plasmide injectieplaats. (B) Getransfecteerde cellen in diepe corticale lagen (circa 1000 pm onder corticale oppervlak) van P5 hersenen van de rat. (C) Een getransfecteerde cel in het striatum regio van P8 hersenen van de rat. (D) Dendritische processen van een getransfecteerde cel in het striatum regio van P8 hersenen van de rat; pijlen geven de verschillende soorten dendritische spines en filopodia. (E) axonen van getransfecteerde cellen in onderpand pad. (F) Axonen eindigen op de pial oppervlak van P8 rat cortex (pijlpunt). Schaal bars zijn 100 um op A, B, E en F; 10 urn op C en D.

<ol><li>Gerlai, R., Clayton, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+hippocampal+function+in+transgenic+mice%3A+an+ethological+perspective.+Trends+Neurosci%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Analyzing hippocampal function in transgenic mice: an ethological perspective. Trends Neurosci.</a> 22, 47-51 (1999).</li>
<li>McGowan, E., Eriksen, J., Hutton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+modeling+Alzheimer%27s+disease+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">A decade of modeling Alzheimer's disease in transgenic mice.</a> Trends Genet. 2, 281-289 (2006).</li>
<li>Cryan, J. F., Holmes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ascent+of+mouse%3A+advances+in+modeling+human+depression+and+anxiety%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">The ascent of mouse: advances in modeling human depression and anxiety.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 4, 775-790 (2005).</li>
<li>Wells, T., Carter, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+neural+function+in+transgenic+rodents%3A+towards+a+comprehensive+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of neural function in transgenic rodents: towards a comprehensive strategy.</a> J. Neurosci. Methods. 108, 111-130 (2001).</li>
<li>Pilpel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((reproducible+transduction+of+select+forebrain+regions+by+targeted+recombinant+virus+injection+into+the+neonatal+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain.</a> J. Neurosci. Methods. 182, 55-63 (2009).</li>
<li>Boutin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+vivo+electroporation+of+the+postnatal+rodent+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain.</a> PLoS One. 3, e1883-e1883 (2008).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).</li>
<li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101, 16-22 (2004).</li>
<li>De Simoni, A., Yu, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+organotypic+hippocampal+slice+cultures%3A+interface+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method.</a> Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).</li>
<li>Walantus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> J. Vis. Exp. , (2007).</li>
<li>Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E16+rat+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos.</a> J. Vis. Exp. , (2007).</li>
<li>Umeshima, H., Hirano, T., Kengaku, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-based+nuclear+movement+occurs+independently+of+centrosome+positioning+in+migrating+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Microtubule-based nuclear movement occurs independently of centrosome positioning in migrating neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 16182-16187 (2007).</li>
<li>Ashwell, K., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshwell%2C+K+%22Atlas+of+the+Developing+Rat+Nervous+System%22">Atlas of the Developing Rat Nervous System</a>. , 3rd edition, Academic Press. (2008).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , 6th edition, Academic Press. (2007).</li>
</ol>

Methoden van gen delivery in levende knaagdieren hersenen zijn goed ingeburgerd in utero elektroporatie 7,8,11,12 en, meer recentelijk, voor postnatale elektroporatie 6. Echter, deze methoden op basis van intraventriculaire injectie van het plasmide DNA, die kunnen worden beperkt voor verschillende toepassingen. Bijvoorbeeld, hebben deze methoden niet toe richten cellen in bepaalde hersengebieden, zoals de hippocampus, noch transfectie van dergelijke niet-trekkende soorten cellen zoals cor...

<table><tbody><tr><td>2A-sa dumb pincet, 115mm</td><td>apparatuur</td><td>XYtronic</td><td>XY-2A-SA</td><td>Behandel met 70% ethanol voor desinfectie vóór gebruik bij chirurgische manipulaties</td></tr><tr><td>Biologische temperatuurregelaar met verwarmingsmat van roestvrij staal</td><td>apparatuur</td><td>Supertech</td><td>TMP-5b</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicaatbuis met filament</td><td>materiaal</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF120-69-10</td><td>Glazen naald</td></tr><tr><td>Wegwerpboren</td><td>materiaal</td><td>Meisinger</td><td>HP 310 104 001 001 008</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeco&amp;rsquo;s PBS 10X</td><td>reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 pincet, 110 mm</td><td>apparatuur</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td>Behandel met 70% ethanol voor desinfectie vóór gebruik bij chirurgische manipulaties</td></tr><tr><td>Ealing micro&amp;#8211;elektrode puller</td><td>apparatuur</td><td>Ealing</td><td>50-2013</td><td>Verticale glazen elektrode puller</td></tr><tr><td>Ethilon monofil polyamide 6-0 FS-3 16 mm 3/8c</td><td>materiaal</td><td>Johnson &amp;amp; Johnson</td><td>EH7177H</td><td>Chirurgische hechtdraden</td></tr><tr><td>Exmire microspuit 10,0 ml</td><td>apparatuur</td><td>Exmire</td><td>MS*GLLX00</td><td>Gasdichte spuit</td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>Pincetelektroden</td><td>apparatuur</td><td>BEX</td><td>LF650P3</td><td>Behandel met 70% ethanol voor desinfectie vóór gebruik</td></tr><tr><td>Foredom boorregelaar</td><td>apparatuur</td><td>Foredom</td><td>FM3545</td><td>Stroomvoorziening en regelaar voor chirurgische boor. Momenteel beschikbaar analoog is micromotorkit K.1070 (Foredom)</td></tr><tr><td>Foredom micromotor handstuk</td><td>apparatuur</td><td>Foredom</td><td>MH-145</td><td>Momenteel beschikbaar analoog is micromotorkit K.1070 (Foredom)</td></tr><tr><td>Gasanesthesieplatform voor muizen</td><td>apparatuur</td><td>Stoelting Co.</td><td>50264</td><td>Gemonteerd op stereotaxisch instrument</td></tr><tr><td>Isofluraan</td><td>reagens</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>FDG9623</td><td></td></tr><tr><td>Micro-verbandpincet, 105 mm</td><td>apparatuur</td><td>Aesculap</td><td>BD302R</td><td>Behandel met 70% ethanol voor desinfectie vóór gebruik bij chirurgische manipulaties</td></tr><tr><td>Microfil</td><td>materiaal</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MF34G-5</td><td>Capillairen voor het vullen van microspuiten</td></tr><tr><td>Minerale olie</td><td>reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>NanoFil spuit 10 microliter</td><td>apparatuur</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>NANOFIL</td><td>Hamilton-spuit</td></tr><tr><td>plasmide CAG-EGFP</td><td>reagens</td><td></td><td></td><td>Geëxtraheerd en gezuiverd met EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen) en opgelost in nucleasevrij water tot een concentratie van 1,5 mg/ml</td></tr><tr><td>Pulsgenerator CUY21Vivo-SQ</td><td>apparatuur</td><td>BEX</td><td>CUY21Vivo-SQ</td><td></td></tr><tr><td>Schiller elektrodegel</td><td>reagens</td><td>Schiller AG</td><td>2.158000</td><td>Geleidende gel</td></tr><tr><td>Stereotaxisch instrument voor kleine dieren</td><td>apparatuur</td><td>David Kopf Instruments</td><td>900</td><td></td></tr><tr><td>St&amp;#8211;lting adapter voor muis en neonatale rat</td><td>apparatuur</td><td>Stoelting Co.</td><td>51625</td><td>Gemonteerd op stereotaxisch instrument. Behandel oorstaven met 70% ethanol voor desinfectie vóór gebruik bij chirurgische manipulaties</td></tr><tr><td>Student iris-schaar, recht 11,5 cm</td><td>apparatuur</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td>Behandel met 70% ethanol voor desinfectie vóór gebruik bij chirurgische manipulaties</td></tr><tr><td>Sugi absorberende wattenstaafjes 17 x 8 mm</td><td>materiaal</td><td>Kettenbach</td><td>31602</td><td>Chirurgische tampons</td></tr><tr><td>UMP3 microspuitpomp en Micro 4 microspuitpompregelaar</td><td>apparatuur</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>UMP3-1</td><td>Micro-injector en regelaar</td></tr><tr><td>Univentor 400 anesthesie-unit</td><td>apparatuur</td><td>Univentor</td><td>8323001</td><td></td></tr></tbody></table>

gene levering aan postnatale rat brain door niet-ventriculaire plasmide-injectie en elektroporatie

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

Creatie van transgene dieren is een standaard aanpak in het bestuderen van de functies van een gen van belang in vivo. Echter veel knock-out of transgene dieren zijn niet levensvatbaar zijn in die gevallen waarin het gemodificeerde gen wordt uitgedrukt of verwijderd in het hele organisme. Bovendien is een aantal compenserende mechanismen maken het vaak moeilijk om de resultaten te interpreteren. De compenserende effecten kunnen worden verlicht door ofwel de timing van de gen-expressie of het beperken van de hoeveelheid van de getransfecteerde cellen. De methode van postnatale non-ventriculaire microinjectie en in vivo elektroporatie maakt gerichte toediening van genen, siRNA of kleurstofmoleculen rechtstreeks naar een kleine regio van belang in de pasgeboren knaagdieren hersenen. In tegenstelling tot conventionele ventriculaire injectietechniek, deze methode maakt het mogelijk transfectie van niet-trekkende celtypen. Dieren getransfecteerd door middel van de hier beschreven methode kan worden gebruikt, bijvoorbeeld voor twee-foton in vivo imaging of in elektrofysiologische experimenten op acute hersenen plakjes.

Dit protocol beschrijft een niet-virale manier van levering van genetische constructen tot een bepaald gebied van wonen knaagdieren hersenen. De methode bestaat uit plasmide voorbereiding, micropipet fabricage, neonatale rattenpup chirurgie, micro-injectie van het construct, en<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroporatie.

Gene Levering aan Postnatale Rat Brain door niet-ventriculaire Plasmide-injectie en elektroporatie

Het creëren van transgene dieren is een standaardbenadering bij het bestuderen van de functies van een gen van belang in vivo. Veel knockout- of transgene dieren ...

Hallo, ik ben RI Ov. En ik ben Alexia Ying. Wij zijn promovendi aan de Cent University. In deze video presenteren we een methode voor in vivo elektroporatie voor de aflevering van een doelgen in een specifiek gebied van het voorste hersenweefsel.Laten we kijken. De methode van in vivo elektroporatie biedt een snelle en efficiënte manier om genen van belang of klein interfererend RNA af te leveren in levend hersenweefsel.Het biedt een kostenefficiënt alternatief voor het creëren van transgene dieren en voor de virale gentransfermethode. In deze video demonstreren we een gedetailleerde procedure voor postnatale gentransfer naar de neonatale rad cortex. We maken gebruik van het plasmide dat codeert voor het enhanced green fluorescent protein en de chicken beta actin-promotor met een CMV-enhancer.Wij voeren alle chirurgische handelingen uit in de laminaire flowkast om de steriliteit te waarborgen en het risico op bacteriële of schimmelcontaminatie van het dier te minimaliseren. Voor de toediening van plasmiden aan de cortex gebruiken we een WPI micro-injector met elektronische regelaar en een Hamilton-spuit van 10 µL bevestigd aan een stereotactische manipulator. De rode pup wordt geanestheseerd met een anesthesie-unit bestaande uit een box en een masker.De pup wordt vervolgens gefixeerd met oorstaven op de warmteplaat die is bevestigd aan de stereotactische manipulator. Voor de chirurgische manipulatie en het monitoren van de micro-injectie gebruiken we een binoculaire microscoop. Voor electroporatie maken we gebruik van de CYV 21 in vivo electro operator met pincetvormige elektroden.Voor het herstel van de pup. Na de anesthesie wordt een verwarmde kamer gebruikt. Meestal bereiden we 10 µL van de plasmide-injectieoplossing voor in een dunwandige buis van 200 µL. Deze oplossing is voldoende voor meerdere experimenten.We mengen acht µL van de plasmidoplossing met één µL van de 10 XPBS en één µL van een 0,1% waterige oplossing van fast green. De uiteindelijke concentratie van het plasmid in de injectieoplossing moet tussen één en drie µg/µL liggen. Het gebruik van lagere concentraties plasmid-DNA zal de transfectie-efficiëntie verminderen, terwijl een hogere DNA-concentratie te viskeus zal zijn voor injectie via de dunne tip van de glazen capillair.Voor de preparatie van de glazen pipet gebruiken we een borosilicaatglazen capillair met een filament en de verticale elektrode glaspuller op maximale trek- en verhittingsparameters. Vervolgens breken we de punt van de pipet af met een stukje papier om een tipdiameter van 10 tot 20 micrometer te verkrijgen. We controleren de diameter en de vorm van de punt onder het objectief van de microscoop.Met behulp van een dunne polymeer capillaire vullen we ongeveer een derde van het volume van een 10 µL Hamilton-spuit. We gebruiken minerale olie en zorgen ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan. Vervolgens vullen we de glazen pipet met minerale olie en plaatsen we de pipet in de Hamilton-spuit.Vermijd opnieuw de vorming van luchtbellen. De spuit met glazen pipet wordt vervolgens bevestigd aan een micro-injector die is verbonden met een controller. De micro-injectieopstelling, bevestigd op een stereotactisch instrument, stelt ons in staat om de punt van de glazen pipet veilig in de buis met de plasmide-injectieoplossing te dompelen.Wanneer de tip het oppervlak van de oplossing raakt, dringen we deze nog één tot twee millimeter verder door. Vervolgens gebruiken we de controller van de micro-injector om de pipette te vullen met ongeveer 1 µL van de injectiemix. Alle hier gepresenteerde experimenten zijn uitgevoerd in overeenstemming met de regelgeving van de Universiteit van Helsinki voor dierproeven.Voor elk experiment vullen we een gasdichte spuit met isofluraan. We bevestigen de spuit aan de anesthesie-eenheid die is aangesloten op de luchtstroombron; het dier loopt en het masker is bevestigd aan de stereotactische opstelling. Op de anesthesie-eenheid stellen we de luchtstroom in op ongeveer 250 milliliters minute en het isofluraanniveau op 4%. We plaatsen de rode dop op de dierbox gedurende twee tot vijf minuten.Wanneer de P stopt met bewegen, plaatsen we deze op het warmtekussen dat aan de stereotactische opstelling is bevestigd. We positioneren het rostrale deel van de kop van de P in het masker. Meestal duurt het vijf tot 10 minuten voordat de pup in een diepe anesthesie is.Zodra dit is bereikt, verlagen we de isofluraan-toevoer naar ongeveer 1,5 tot 2%. We behandelen de huid op de kop van de pup met 70% ethanol met behulp van kleine wattenstaafjes en dunne pincetten. We snijden de huid in van de nekvel van de pup tot aan het voorhoofd, buigen de huidflappen zijwaarts en trekken de oorstaven voorzichtig in de orale openingen van de schedel voor de fixatie van de kop en de huid. Met behulp van een binoculair microscoop lokaliseren we het bregma-punt op de schedel om de regio van interesse te identificeren aan de hand van de stereotactische coördinaten; we positioneren de injectiepipet boven deze regio en markeren deze door 25 tot 50 nanoliters van de injectie-oplossing op het schedeloppervlak te druppelen.We boren voorzichtig en nauwkeurig in de schedel op het gemarkeerde punt met een chirurgische hogesnelheidsboor onder de microscoop, totdat er vloeistof verschijnt in het geboorde gebied. We bevestigen de elektroporatie-tang en de elektroden aan de zijkanten van de schedel. We brengen een geleidende gel aan om een betere geleidbaarheid te bereiken.We verwijderen de vloeistofdruppel uit het geboorde gebied met een klein wattenstaafje en brengen de glazen naald in het gaatje. Op basis van de coördinaten van de injectieplaats infunderen we 25 tot 100 nanoliters van de injectieoplossing met een snelheid van 5 tot 20 nanoliter per seconde. Vervolgens verwijderen we de pipet snel en gaan we onmiddellijk over tot electroporatie.Elektroporatie wordt uitgevoerd door vijf pulsen toe te passen met een duur van 50 milliseconden bij een pulsamplitude van 99 volt en een frequentie van één hertz. We verwijderen de elektroden en de oorstaven. We hebben de ingesneden huid gehecht met behulp van een combinatie van stompe en scherpe pincetten en chirurgisch hechtmateriaal.We hebben de pup gedurende 15 tot 30 minuten in een warme kamer geplaatst om het herstel na de anesthesie te bevorderen. Vervolgens hebben we de pup teruggeplaatst in de kooi van de moeder. De expressie van het transgen in de succesvol getransfecteerde cellen zal ongeveer 10 uur na de elektroporatie verschijnen en gedurende enkele weken stabiel blijven.Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten. Tot ziens.

gene-delivery-to-postnatal-rat-brain-non-ventricular-plasmid

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In Utero Intraventriculaire injectie en elektroporatie van de E16 Rat embryo&#39;s

In utero elektroporatie is een waardevolle methode voor het transfecteren neuronale stamcellen in vivo. Afhankelijk van de plaatsing van de elektroden en de ontwikkeling meetpunt van elektroporatie, kunnen bepaalde subsets van corticale cellen worden gericht. Gerichte cellen kunnen vervolgens worden geanalyseerd in vivo of in vitro voor de effecten van genetische manipulatie.

In utero Elektroporatie gevolgd door primaire neuronale Cultuur voor het bestuderen van Gene Functie in subset van de corticale neuronen

In utero elektroporatie zorgt voor een snelle genafgifte in een ruimtelijk-temporeel en gecontroleerde wijze in de zich ontwikkelende centrale zenuwstelsel (CZS). Hier beschrijven we een groot aanpassingsvermogen in utero electroporatie protocol dat gebruikt kan worden om expressie constructen te leveren in meerdere embryonale CNS domeinen, waaronder de telencephalon, diencephalon en netvlies.

Efficiënte gen delivery in meerdere CNS Gebieden Het gebruik van In Utero Elektroporatie

Source: Denaxa, M., el al., Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the procedure for injecting a plasmid vector carrying the gene of interest into interneuron progenitors in an embryonic brain slice, followed by electroporation for plasmid entry and gene expression. These modified progenitors can later be used for treating brain disorders.

Agarose-Embedded Electroporation-Assisted Gene Transfer in Mouse Cortical Interneuron Progenitors

Genen kunnen worden gemanipuleerd tijdens de ontwikkeling van de cortex of de hippocampus van de rat via in utero elektroporatie (IUE) op E16, om snelle en doelgerichte wijzigingen in neuronale connectiviteit mogelijk te maken voor latere studies van gedrag of neuropathologie bij volwassen dieren. Postnatale in vivo beeldvorming voor controle IUE succes uitgevoerd door bioluminescentie activerende co-getransfecteerd luciferase.

Generatie Topisch transgene Rats door<em&gt; In de baarmoeder</em&gt; Elektroporatie en<em&gt; In vivo</em&gt; Bioluminescence Screening

We tonen een minimaal invasieve techniek genoemd neonatale subventriculaire zone elektroporatie. De techniek bestaat uit het injecteren plasmide DNA in de laterale ventrikels van neonatale pups en toepassen elektrische stroom te leveren en genetisch manipuleren neurale...

Neonatale subventriculaire zone Elektroporatie

De pial oppervlak is een uniek voorlopercellen zone in het CZS, die krijgt steeds meer aandacht. Hierin hebben we gedetailleerd een methode voor snelle genetische manipulatie van deze voorlopercellen zone met een aangepaste elektroporatiewerkwijze. Deze procedure kan worden gebruikt voor cellulaire en moleculaire analyses van cellijnen en signaalwegen betrokken bij celdifferentiatie en het lot en de eigenschappen van dochtercellen helderen.

Neonatale Pial Surface Elektroporatie

Hier demonstreren we een techniek voor wijdverspreide neuronale transductie door intraventriculaire injectie van adeno-geassocieerd virus in de neonatale muisbrein. Deze methode biedt een snelle en eenvoudige manier om levenslange expressie van vireel aangeboden transgenen te bereiken.

Intracerebroventriculaire Viral Injectie van de Neonatale Mouse Brain voor persistent en wijdverbreide Neuronale Transduction

Beschrijven we een nieuwe methode voor de levering van DNA plasmide in de cellen van de urothelial van muis blaas in vivo via de urinebuis catheterisatie en electroporation. Het biedt een snelle en gemakkelijke manier voor het genereren van autochtone Muismodellen van ziekten van de blaas.

Nieuwe methode van plasmide DNA levering aan muis blaas Urothelium door Electroporation

Hier is een elektroporation methode voor plasmide DNA levering en ependymoglial cellabeling in de volwassen zebravis telencephalon. Dit protocol is een snelle en efficiënte methode om individuele ependymoglial cellen te visualiseren en te traceren en opent nieuwe mogelijkheden om elektroporation toe te passen op een breed scala aan genetische manipulaties.

Elektroporation methode voor in vivo levering van plasmide DNA in de volwassen zebravis Telencephalon

Het huidige protocol schetst stapsgewijze instructies voor het uitvoeren van intrathecale injecties bij neonatale muizen voor genbewerking en medicijnafgifte.

Intrathecale injectie van pasgeboren muis voor genoombewerking en medicijnafgifte

Leer een niet-virale methode voor genlevering aan het postnatale rattenbrein via plasmide-injectie en elektroporatie. Deze techniek biedt een efficiënt alternatief voor virale vectoren.

Gene Levering aan Postnatale Rat Brain door niet-ventriculaire Plasmide-injectie en elektroporatie

Meer video's verkennen