In vivo Kwantificering van G-eiwit gekoppelde receptor interacties met behulp van spectraal Opgelost Twee-foton microscopie

Het algemene doel van het volgende experiment is om stoia metrische en structurele informatie over eiwitten te bepalen. Alle ligamentcomplexen die levende biologische cellen tot expressie brengen, gistcellen worden genetisch gemodificeerd om de eiwitten van belang te tonen die zijn gekoppeld aan een donor of een aanvaarder van een fluorescerende sonde. Donor sondes kunnen direct worden opgewonden door een laser.

Terwijl acceptoren alleen kunnen worden opgewonden door een energieoverdracht van een nabijgelegen opgewekte donor, worden de cellen blootgesteld aan licht van een gepulste nabij-infrarode laser. De fluorescente inseminatie van de sondes wordt gescheiden in zijn spectrale componenten door een transmissierooster en wordt geprojecteerd op het oppervlak van een CCD-array met elektronen vermenigvuldiging. Daarom worden volledige fluorescentiespectra van individuele, alle ligamenten verkregen voor elke positie in het monster.

Het spectrale profiel van de gedetecteerde fluorescentie hangt af van de specifieke interactie van de eiwitten van belang. De gegevens worden geanalyseerd om voor elke beeldpixel van een scancel de afzonderlijke emissie van de donor- en aanvaarder sondes te bepalen. De efficiëntie van energieoverdracht wordt bepaald bij elke beeldpixel, en vervolgens worden pixels gebogen volgens hun fret-efficiëntie en histogram.

De histograminterpretatie maakt de in vivo bepaling van eiwitten, complexgrootte en configuratie mogelijk. Hallo, mijn naam is Michael Stoneman van de Riku Research Group aan de Universiteit van Wisconsin Milwaukee. Mijn naam is Singh.

Ik kom uit Rikus Lab in Wisconsin, Milwaukee. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de volledige emissieprofielen van honderden alle ligamentcomplexen binnen een cel worden verkregen met één volledige scan van de cel. Meestal vereisen de meeste fluorescentiemicroscopiemethoden dat de cel van belang meerdere keren wordt gescand om voldoende spectrale informatie te verzamelen om de fret-efficiëntie in verschillende gebieden van belang binnen de cel te bepalen.

Diffusiebiochemische reacties kunnen echter de moleculaire samenstelling van deze gebieden van belang veranderen en daardoor de in de beeldscan verkregen informatie beperken. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden in de studie van eiwitten, eiwitinteractie in levende cellen, zoals wat is de grootte van oligomeren schade? In welk stadium van de eiwitlevenscyclus boeren de oligomeren, en wat is de rol van oligomeer van dit eiwit in de cellulaire functie?

De spectroscopisch opgeloste twee fotomicroscoop verzamelt spectrale informatie over de olima-complexen in de beeldcel door de focus van de excitatiebundel te scannen over het monster van belang op een aantal locaties. Er wordt een paar orthogonale scanspiegels gebruikt om de focus van de laserbundel over het monster te vertalen in twee verschillende richtingen. De beweging van de scanspiegels wordt computergestuurd en gesynchroniseerd met de extractie van fluorescentie-intensiteitsgegevens van de CCD-camera uit de lijnscannen. Fluorescentie-intensiteitsruimtelijke kaarten die overeenkomen met een bepaalde golflengte van licht, kunnen worden gereconstrueerd.

Om nauwkeurige röntgenfluorescentie-intensiteitsruimtelijke kaarten te reconstrueren en de werkelijke golflengte te berekenen die overeenkomt met elk van deze kaarten, moet het lijnscanprotocol worden gekalibreerd met behulp van fluoresceïne-oplossing. Om de kalibratieprocedure te starten, verzendt u naar het excitatiespectrum bij een golflengte van 800 nanometer, dat twee keer de maximale excitatiegolflengte is van de donor-tag GFP twee twee naar het excitatiespectrum, vertaalt het prisma dat zich in de laserholte bevindt om de groepssnelheidsdispersie te wijzigen met behulp van het computerprogramma waarmee de camera is verbonden. Stuur een opdracht naar de CCD-chip om de temperatuur van de CCD-chip te verlagen tot zijn laagste haalbare temperatuur.

Om donkere ruis te verminderen. Pipetteer 10 microliters fluoresceïne-oplossing op een microscoopslide met een dekglas, zodat een dunne laag van het monster uniform is verspreid in het gebied tussen het dekglas en de microscoopslide, plaats een kleine druppel imersieolie op het oppervlak van het dekglas. Bevestig nu de microscoop, glijd naar de XY, Z vertaalfase en vertaal de glijbaan en fase in de optische asrichting Door de lineaire actuator handmatig aan te passen, vertaalt u de glijbaan totdat het microscoopobjectief in contact komt met de druppel imersieolie, schakelt u de camera naar een videomodus van dataverwerving zodat het toegelaten licht dat op de CCD-array slaat, in realtime op het computerscherm wordt weergegeven.

Schakel alle omgevingslichten in de kamer uit om de op het CCD-array gedetecteerde achtergrondruis te verminderen. Pas langzaam de micrometer aan die de vertaalfase in de optische asrichting regelt om het monster in de focale vlek van de laserbundel te brengen. Wanneer het fluoresceïnemonster in focus staat, zal de emissie verschijnen als een scherpe lijn op de CCD-array.

Download de uitlezing van de pixelintensiteiten van de CCD-array naar de computer. Meet de pixelintensiteit als functie van positie op de CCD-array door de gedownloade matrix van intensiteitswaarden in Image J te openen en een lijn te trekken door het fluorescente gebied. Gebruik de Image Day-opdracht.

Analyseer plotprofiel om een plot te maken die het emissiespectrum van het fluoresceïnemonster illustreert. Pas de incrementele parameter van de spiegel aan, die de beweging van de laser regelt. Focus in de Y-richting, zodat aangrenzende Y-posities binnen het monster resulteren in de beweging van de piek van de fluorescentiespectra met exact één pixel langs de spectrale dimensie op de CCD-array.

Om dit te bewaken, downloadt u de fluoresceïne-spectra-intensiteit voor twee verschillende Y-posities in het monster. Open vervolgens de intensiteitsbeelden met Image J en vind de piekpixelpositie voor elk van de fluorescente spectra. Gebruik de Image J-cursor, laat de sluiter van de CCD open staan, scant u met de laser focus over het monster in de X-richting.

Het licht dat door elke voxel langs de scanlijn wordt uitgezonden, moet op het CCD-array vallen aan het einde van elke lijnscan. Sla de gegevens op van de CCD-array die zijn verkregen voor deze lijnscan en vervolgens wissen de pixels van de CCD-array. Verplaats de positie van de laser. Focus in de Y-richting met de hoeveelheid die eerder is bepaald.

Scan vervolgens de laserstraal in de X-richting over het monster. Laat opnieuw de sluiter van de CCD open staan,