Name: In vivo Kwantificering van G-eiwit gekoppelde receptor interacties met behulp van spectraal Opgelost Twee-foton microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-19T17:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 26 s
Description: Leer hoe je FRET-efficiëntiekaarten genereert met spectraal opgeloste twee-foton microscopie in levende gistcellen. Deze methode onthult stoichiometrische informatie over eiwitcomplexen en receptorinteracties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de UW-Milwaukee Research Groei-initiatief, de Wisconsin Instituut voor Biomedische Technologie en Gezondheid, en de Bradley Foundation.

<ol><li>Raicu, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRaicu%2C+V+%22Nanoscopy+and+Multidimensional+Optical+Fluorescence+Microscopy%22">Nanoscopy and Multidimensional Optical Fluorescence Microscopy</a>. Diaspro, A. , CRC Press. Boca Raton. (2010).</li>
<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakowicz%2C+JR+%22Principles+of+Fluorescence+Spectroscopy%22">Principles of Fluorescence Spectroscopy</a>. , Springer. New York. (2006).</li>
<li>Raicu, V., Popescu, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRaicu%2C+V+%22Integrated+Molecular+and+Cellular+Biophysics%22">Integrated Molecular and Cellular Biophysics</a>. , Springer. London. (2008).</li>
<li>Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+renaissance+of+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">The renaissance of fluorescence resonance energy transfer.</a> Nat Struct Biol. 7, 730-734 (2000).</li>
<li>Raicu, V., Jansma, D. B., Miller, R. J., Friesen, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+interaction+quantified+in+vivo+by+spectrally+resolved+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Protein interaction quantified in vivo by spectrally resolved fluorescence resonance energy transfer.</a> Biochem J. 385, 265-277 (2005).</li>
<li>Maurel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-surface+protein-protein+interaction+analysis+with+time-resolved+FRET+and+snap-tag+technologies%3A+application+to+GPCR+oligomerization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell-surface protein-protein interaction analysis with time-resolved FRET and snap-tag technologies: application to GPCR oligomerization.</a> Nat Methods. 5, 561-567 (2008).</li>
<li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+AP-1+NF-kappaB+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Visualization of AP-1 NF-kappaB ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105, 151-156 (2008).</li>
<li>Demarco, I. A., Periasamy, A., Booker, C. F., Day, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+dynamic+protein+interactions+with+photoquenching+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Monitoring dynamic protein interactions with photoquenching FRET.</a> Nat Methods. 3, 519-524 (2006).</li>
<li>Wallrabe, H., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+protein+molecules+using+FRET+and+FLIM+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy.</a> Curr Opin Biotechnol. 16, 19-27 (2005).</li>
<li>Wlodarczyk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+FRET+signals+in+the+presence+of+free+donors+and+acceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Analysis of FRET signals in the presence of free donors and acceptors.</a> Biophys J. 94, 986-1000 (2008).</li>
<li>Förster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimentelle+und+theoretische+Untersuchung+des+zwischenmolekularen+bergangs+von+Elektronenanregungsenergie.+Z.+Naturforsch%5BTitle%5D)+AND+%22A%3A+Astrophys+Phys+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">Experimentelle und theoretische Untersuchung des zwischenmolekularen bergangs von Elektronenanregungsenergie. Z. Naturforsch.</a> A: Astrophys Phys Phys Chem. 4, 321-321 (1949).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2, 905-909 (2005).</li>
<li>Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312, 217-2124 (2006).</li>
<li>Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+imaging+and+linear+un-mixing+enables+improved+FRET+efficiency+with+a+novel+GFP2-YFP+FRET+pair%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair.</a> FEBS Lett. 531, 245-249 (2002).</li>
<li>Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nat Biotechnol. 20, 87-90 (2002).</li>
<li>Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+cyan+fluorescent+protein+variant+useful+for+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET.</a> Nat Biotechnol. 22, 445-449 (2004).</li>
<li>Raicu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+of+Resonance+Energy+Transfer+in+Homo-Oloigomeric+Complexes+of+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Phys%22%5BJournal%5D)">Efficiency of Resonance Energy Transfer in Homo-Oloigomeric Complexes of Proteins.</a> J Biol Phys. 33, 109-127 (2007).</li>
<li>Raicu, V., Fung, R., Melnichuk, M., Chaturvedi, A. Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences VII, 2007 Jan 1, San Jose, CA, USA , , (2007).</li>
<li>Raicu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+supramolecular+structure+and+spatial+distribution+of+protein+complexes+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Photonics%22%5BJournal%5D)">Determination of supramolecular structure and spatial distribution of protein complexes in living cells.</a> Nat Photonics. 3, 107-113 (2009).</li>
<li>Rath, S., Sullivan, A. P., Stoneman, M. R., Raicu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microspectroscopic+method+for+determination+of+size+and+distribution+of+protein+complexes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+of+SPIE%22%5BJournal%5D)">Microspectroscopic method for determination of size and distribution of protein complexes in vivo.</a> Proc of SPIE. 7378, 737829-737829 (2009).</li>
<li>Kurjan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromone+response+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Pheromone response in yeast.</a> Annu Rev Biochem. 61, 1097-1129 (1992).</li>
<li>Overton, M. C., Chinault, S. L., Blumer, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+of+G-protein-coupled+receptors%3A+lessons+from+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Oligomerization of G-protein-coupled receptors: lessons from the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Eukaryot Cell. 4, 1963-1970 (2005).</li>
</ol>

In deze presentatie, we geïllustreerd hoe de grootte en de structurele informatie over een eiwit oligomeer complex in vivo te bepalen. Terwijl gepresenteerde gegevens werden verkregen uit een specifiek membraan receptor (dwz Ste2p) uitgedrukt in gistcellen, de methode is allesomvattend in dat het kan worden toegepast op elk soort eiwit, uitgedrukt in elk type cel, de enige bepaling is dat de eiwitten zijn voorzien van tag met de juiste fluorescerende markers. Toekomstige wijzigingen van dit protocol zal omvatte...

<table><tbody><tr><td>Pepton</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1420</td><td></td></tr><tr><td>Gistextract</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422</td><td></td></tr><tr><td>Polyethyleenglycol 4000</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-605</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Nitrogen Base zonder (NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; en aminozuren</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0335-15-9</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Synthetic Drop-out Medium supplementen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2001</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>S70210</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumsulfaat</td><td>Fisher Scientific</td><td>A702-500</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Acros Organics</td><td>424090010</td><td></td></tr><tr><td>Leucine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP385</td><td></td></tr><tr><td>Histidine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP382</td><td></td></tr><tr><td>Plan Achromat Infinity Corrected 100x olie-immersie objectief NA=1.43</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectraal opgeloste tweefotonmicroscoop</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo kwantificering van g-eiwit gekoppelde receptor interacties met behulp van spectraal opgelost twee-foton microscopie

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

De studie van eiwit interacties in levende cellen is een belangrijk gebied van onderzoek, omdat de informatie verzameld zowel voordelen industriële toepassingen alsmede verhogingen elementaire fundamentele biologische kennis. Förster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer (FRET) tussen een donor molecuul in een elektronisch aangeslagen toestand en een nabijgelegen acceptor molecuul is vaak gebruikt voor studies van eiwit-eiwit interacties in levende cellen. De eiwitten van belang zijn gelabeld met twee verschillende types van fluorescerende probes en uitgedrukt in biologische cellen. De fluorescerende probes worden dan enthousiast, meestal met behulp van laserlicht, en de spectrale eigenschappen van de fluorescentie-emissie afkomstig van de fluorescerende probes is verzameld en geanalyseerd. Informatie over de mate van het eiwit interacties is ingebed in de spectrale emissie-gegevens. Typisch, moet de cel worden gescand een aantal keren in om voldoende spectrale informatie verzamelen om nauwkeurig kwantificeren van de omvang van het eiwit interacties voor elke regio van belang binnen de cel. Echter, de moleculaire samenstelling van deze regio&#39;s te veranderen in de loop van de acquisitie-proces, het beperken van de ruimtelijke bepaling van de kwantitatieve waarden van de schijnbare FRET efficiëntie tot een gemiddelde over heel cellen. Door middel van een spectraal opgelost twee-foton microscoop, zijn wij in staat om een ​​volledige set van spectraal opgelost beelden te verkrijgen na slechts een volledig excitatie scan van de steekproef van belang. Uit dit pixelniveau spectrale data, een kaart van FRET efficiëntie in de cel wordt berekend. Door het toepassen van een eenvoudige theorie van FRET in oligomere complexen aan de experimenteel verkregen verdeling van de FRET efficiëntie in de cel, een enkele spectraal opgelost scan onthult stoichiometrische en structurele informatie over het oligomeer complex onder te bestuderen. Hier beschrijven we de procedure voor de voorbereiding van biologische cellen (de gist Saccharomyces cerevisiae) uiten van membraan receptoren (steriele twee α-factor receptoren) gelabeld met twee verschillende types van fluorescerende probes. Daarnaast illustreren we kritische factoren die betrokken zijn bij het verzamelen van gegevens met behulp van fluorescentie de spectraal opgelost twee-foton microscopie imaging systeem. Het gebruik van dit protocol kan worden uitgebreid tot elk soort eiwit dat kan worden uitgedrukt in een levende cel met een fluorescente marker in bijlage aan het bestuderen.

Door het gebruik van een spectraal opgelost twee-foton microscopie imaging-systeem, zijn pixel-niveau kaarten van Förster Resonance Energy Transfer (FRET) efficiëntie verkregen voor cellen die membraanreceptoren verondersteld dat homo-oligomere complexen vormen. Van de efficiëntie kaarten FRET, we zijn in staat om stoichiometrisch informatie over het oligomeer complex schatting in studie.

In vivo Kwantificering van G-eiwit gekoppelde receptor interacties met behulp van spectraal Opgelost Twee-foton microscopie

De studie van eiwitinteracties in levende cellen is een belangrijk onderzoeksgebied, omdat de verzamelde informatie zowel ten goede komt aan de industrie ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het bepalen van stoichiometrische en structurele informatie over proteïnen. Alle ligamentcomplexen die levende biologische cellen tot expressie brengen, gistcellen, zijn genetisch gemodificeerd om de proteïnen van belang tot expressie te brengen, gehecht aan een donor- of een acceptor-fluorescente probe. Donorprobes kunnen direct door een laser worden geëxciteerd.Terwijl acceptoren alleen kunnen worden geëxciteerd door een energieoverdracht van een nabijgelegen geëxciteerde donor, worden de cellen blootgesteld aan licht van een gepulseerde nabij-infraroodlaser. De fluorescentie die uit de probes komt, wordt door een transmissierooster gescheiden in spectrale componenten en geprojecteerd op het oppervlak van een elektronen-vermenigvuldigende CCD-array. Hierdoor worden volledige fluorescentiespectra van individuele ligamenten verkregen voor elke positie in het monster.Het spectrale profiel van de gedetecteerde fluorescentie is afhankelijk van de specifieke interactie van de eiwitten van belang. De gegevens worden geanalyseerd om voor elke beeldpixel van een scan-cel de afzonderlijke emissies van de donor- en acceptor-probes te bepalen. De efficiëntie van de energieoverdracht wordt voor elke beeldpixel bepaald, waarna de pixels worden gegroepeerd op basis van hun FRET-efficiëntie en histogram.De interpretatie van het histogram maakt de in vivo bepaling van de grootte en configuratie van eiwitten en complexen mogelijk. Hallo, mijn naam is Michael Stoneman van de Riku Research Group aan de Universiteit van Wisconsin Milwaukee. Mijn naam is Singh.Ik kom van het Rikus Lab in Milwaukee, Wisconsin. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de volledige emissieprofielen van honderden ligamentcomplexen binnen een cel worden verkregen met één volledige scan van de cel. Meestal vereisen de meeste fluorescentiemicroscopiemethoden dat de betreffende cel meerdere keren wordt gescand om voldoende spectrale informatie te verzamelen om de FRET-efficiëntie in verschillende regio's van belang binnen de cel te bepalen.Diffusie-biochemische reacties kunnen echter de moleculaire samenstelling van deze regio's van belang veranderen en daarmee de informatie die uit de scan van het beeld wordt verkregen, beperken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen bij de studie van eiwitten en eiwitinteracties in levende cellen, zoals: wat is de grootte van de schadelijke oligomeren? In welke fase van de levenscyclus van het eiwit worden de oligomeren gevormd, en wat is de rol van oligomeren van dit eiwit in de cellulaire functie?De spectraal opgeloste twee-fotonenmicroscoop verzamelt spectrale informatie over de oligomeercomplexen in de beeldcel door de focus van de excitatiestralen op een reeks locaties over het betreffende monster te scannen. Een paar orthogonale scanspiegels wordt gebruikt om de focus van de laserstraal in twee verschillende richtingen over het monster te verplaatsen. De beweging van de scanspiegels wordt computergestuurd en gesynchroniseerd met de extractie van fluorescentie-intensiteitsgegevens van de CCD-camera; uit de lijnscans kunnen ruimtelijke kaarten van de fluorescentie-intensiteit worden gereconstrueerd die overeenkomen met een specifieke golflengte van het licht.Om ruimtelijke x-ray fluorescentie-intensiteitskaarten nauwkeurig te reconstrueren en de werkelijke golflengte te berekenen die correspondeert met elk van deze kaarten, moet het line-scanning protocol worden gekalibreerd met behulp van een fluoresceïne-oplossing. Om de kalibratieprocedure te starten, moet het excitatispectrum worden ingesteld op een golflengte van 800 nanometer, wat twee keer de maximale excitatiegolflengte is van de donor-tag GFP 22. Om het excitatispectrum in te stellen, dient het prisma in de laserholte te worden verschoven om de groepsnelheidsdispersie aan te passen via het computerprogramma waarmee de camera is gekoppeld. Stuur een commando naar de CCD-chip om de temperatuur van de CCD-chip te verlagen tot de laagst haalbare temperatuur.Om de donkerruis te verminderen, pipetteer 10 µL fluoresceïne-oplossing op een objectglas en dek dit af met een dekglas, zodat een dunne laag van het monster gelijkmatig wordt verdeeld in de ruimte tussen het dekglas en het objectglas. Plaats vervolgens een kleine druppel immersie-olie op het oppervlak van het dekglas. Bevestig nu het objectglas aan de XY, Z-translatieondersteuning en verschuif het objectglas en de ondersteuning in de richting van de optische as. Verplaats het objectglas door de lineaire actuator handmatig bij te stellen totdat het objectief van de microscoop in contact komt met de druppel immersie-olie. Zet de camera in de videomodus voor gegevensverwerving, zodat het binnenvallende licht dat op de CCD-array valt in realtime op het computerscherm wordt weergegeven.Schakel alle omgevingsverlichting in de kamer uit om de achtergrondruis die door het CCD-array wordt gedetecteerd te verminderen. Pas langzaam de micrometer aan die de translatietabel in de richting van de optische as regelt, om het monster in het brandpunt van de laserstraal te brengen. Wanneer het fluoresceïne-monster scherp is gesteld, zal de emissie als een scherpe lijn op het CCD-array verschijnen.Download de uitlezing van de pixelintensiteiten van de CCD-array naar de computer. Meet de pixelintensiteit als functie van de positie op de CCD-array door de gedownloade matrix van intensiteitswaarden te openen in ImageJ en een lijn door het fluorescerende gebied te trekken. Gebruik het commando 'image day'.Analyseer het plotprofiel om een grafiek te maken die het emissiespectrum van het fluoresceïnemonster illustreert. Pas de incrementele parameter van de spiegel aan, waarmee de beweging van de laser wordt aangestuurd. Focus in de Y-richting, zodanig dat aangrenzende y-posities binnen het monster leiden tot een verschuiving van de piek van de fluorescentiespectra met precies één pixel langs de spectrale dimensie op de CCD-array.Om dit te monitoren, downloadt u de fluorescentiespectra-intensiteit voor twee verschillende Y-posities in het monster. Open vervolgens de intensiteitsafbeeldingen met ImageJ en bepaal de positie van de piekpixel voor elk van de fluorescentiespectra. Scan met de ImageJ-cursor, terwijl de sluiter van de CCD open blijft, de laserfocus over het monster in de X-richting.Het licht dat door elke voxel langs de scanlijn wordt uitgezonden, moet op de CCD-array aan het einde van elke lijnenscan vallen; sla de gegevens van de CCD-array die voor deze lijnenscan zijn verkregen op en wis vervolgens de pixels van de CCD-array. Verplaats de positie van de laser. Focus in de Y-richting met de eerder bepaalde hoeveelheid.Scan vervolgens de laserstraal in de X-richting over het monster. Sla de gegevens opnieuw op terwijl het sluiter van de CCD open blijft. Herhaal deze procedure voor het scannen van lijnen totdat een fysiek gebied dat ongeveer 50% groter is dan de afmetingen van een enkele biologische cel door laserlicht is verlicht.De relatie tussen het rijnummer van een specifiek line-scanbeeld en de golflengte moet worden gebruikt om de beelden te reconstrueren, zodat meerdere fluorescentie-intensiteitskaarten van het gezicht bij verschillende golflengten kunnen worden verkregen. Om het fluorescentie-emissiebeeld voor een specifieke golflengte te verkrijgen, moet het rijnummer op het beeld van de eerste line-scan worden gevonden dat overeenkomt met deze golflengte. De aangrenzende rij van het daaropvolgende line-scanbeeld komt vervolgens overeen met de volgende rij van het fluorescentie-emissiebeeld.Stapel voor die specifieke golflengte alle beeldrijen die bij deze golflengte horen om de XY-fluorescentie-intensiteitskaarten van het monster bij die golflengte te verkrijgen. Herhaal deze procedure voor alle overige verkrijgbare golflengten om gegevens van uw monsters te verzamelen. Haal eerst de platen met getransformeerde gistkolonies uit de incubator.Er zouden ten minste drie typen getransformeerde cellen moeten zijn. Cellen die de eiwitten van belang tot expressie brengen, gelabeld met beide typen fluorescente probes. Cellen die alleen eiwitten tot expressie brengen die gelabeld zijn met de donor-fluorescente probes en cellen die alleen eiwitten tot expressie brengen die gelabeld zijn met de acceptor-fluorescente probes.Voeg 100 µL 100 mM kaliumchloride toe aan een microcentrifugebuisje. Schraap vervolgens met de tip van een micropipet drie tot vijf gistkolonies van de plaat met cellen die eiwitten tot expressie brengen die getagd zijn met zowel donor- als acceptor-fluorescente probes en inoculeer deze in het 100 mM kaliumchloride. Neem van deze cellen 10 µL van de celsuspensie en breng dit aan op een nieuw microscoopglasplaatje.Dek de druppel af met een dekglasplaatje en plaats een druppel olie op het oppervlak van het dekglasplaatje. Sluit vervolgens handmatig de sluiter in het pad van de laserstraal om te voorkomen dat het laserlicht het microscoopobjectief bereikt. Bevestig het microscoopOBJECTglas aan de XY, Z-translatietafel en verschuif de objecttafel in de richting van de optische as totdat het microscoopobjectief in contact komt met de druppel immersie-olie.Zet nu de breedveldverlichting aan en ga naar de camera. Selecteer de videomodus voor gegevensverzameling. Het breedveldbeeld van het monster zal sterk vervaagd zijn vanwege de aanwezigheid van het transmissierooster in het emissiepad.Plaats daarom een banddoorlaatfilter met een kleine volledige breedte op halve hoogte in het optische pad vóór het transmissierooster. Verplaats de translatietafel langzaam in de richting van de optische as terwijl u het beeld van de cellen op het camerascherm bekijkt, totdat de cellen scherp zijn gesteld. Verplaats de tafel in de X- of Y-richting om een enkele cel in de brandpuntsafstand van de laserstraal te brengen.Schakel de widefield-lichtbron uit en verwijder het banddoorlaatfilter uit het emissiepad. Ontblokkeer de laserstraal kortstondig terwijl u gelijktijdig het signaal bekijkt dat door de CCD-array wordt ontvangen. Als er een fluorescentiesignaal op de CCD-array wordt gedetecteerd gedurende de tijd dat de laserstraal op de cel valt, voer dan een volledige scan uit voor de acquisitie van fluorescentiegegevens van deze cel.Het is essentieel om dezelfde scanparameters te gebruiken, specifiek het aantal lijnen en de y-increment zoals bepaald in de eerder gedemonstreerde kalibratieprocedure. Herhaal het proces voor cel-locatie en fluorescentiedata-acquisitie voor een groot aantal cellen die eiwitten tot expressie brengen die aan zowel donor- als acceptortags zijn gekoppeld. Nadat er voldoende fluorescentiebeelden zijn verzameld van cellen die eiwitten tot expressie brengen die met beide receptoren zijn gelabeld, dient het gehele proces te worden herhaald voor zowel cellen die alleen eiwitten tot expressie brengen die zijn gelabeld met donorfluorescente probes als cellen die alleen eiwitten tot expressie brengen die zijn gelabeld met acceptorfluorescente probes.Reconstrueer ten slotte alle scans om spectraal opgeloste XY-fluorescentie-intensiteitskaarten voor elke dataset te verkrijgen met behulp van de eerder beschreven procedure. In deze drie figuren zijn de resulterende ruimtelijke kaarten weergegeven, berekend uit spectraal opgeloste tweefotonmicroscopie-metingen uitgevoerd op een gistcel die de steriele alfa-factorreceptor tot expressie brengt. Tweedimensionale kaarten van donor- en acceptorsignalen werden verkregen door de spectrale emissieprofielen te analyseren die op elke locatie van de cel waren gemeten.Aan de fluorescentie-intensiteiten worden valse kleuren toegekend op basis van hun waarden, en de schaal wordt als inzet getoond. Vervolgens is een tweedimensionale kaart van de schijnbare FRET-efficiënties berekend met behulp van de KDA- en KAD-beelden, gebruikmakend van de waarden die zijn geëxtraheerd uit de zojuist getoonde kaart van de schijnbare FRET-efficiënties van de cel, waarna een histogram is opgesteld. De gemeten EAPP-waarden van de cel worden weergegeven door cirkels.De rode ononderbroken lijn vertegenwoordigt de beste fit van de gemeten gegevens met behulp van de som van de individuele calciumfuncties, weergegeven door ononderbroken groene lijnen. Analyse van het histogram, zoals beschreven in de protocoltekst, bevestigt dat het steriele two alpha factor receptor all ligament complex in vivo de vorm aanneemt van een RBA-vormig tetrameer. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in 12 uur worden uitgevoerd indien correct uitgevoerd.Tijdens het uitvoeren van dit experiment is het belangrijk om het vermogen van de excitatiebron laag te houden. Het is essentieel om meervoudige excitatie van de donor door een enkele puls te vermijden.

in-vivo-quantification-g-protein-coupled-receptor-interactions-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol wordt beschreven hoe u foto eiwit-eiwit interacties met behulp van een FRET-gebaseerde nabijheid assay.

Imaging eiwit-eiwit interacties In vivo</em

We beschrijven hier gedetailleerde live cell imaging methoden voor onderzoek van chemotaxis. We presenteren fluorescentie microscopische methoden om spatiotemporele dynamiek van de signalering gebeurtenissen in migrerende cellen te controleren. Meting van signalering gebeurtenissen laat ons toe verder te begrijpen hoe een GPCR-signalering netwerk gradiënt sensing van chemoattractants en controles directionele migratie van eukaryote cellen bereikt.

Imaging G-eiwit gekoppelde receptor (GPCR)-gemedieerde Signaling Gebeurtenissen die controle Chemotaxis van Dictyostelium discoideum</em

Wij ontwikkelden een software platform dat Imaris Neuroscience, ImarisXT en MATLAB om de veranderingen in morfologie van een ongedefinieerde vorm uit driedimensionale confocale fluorescentie van afzonderlijke cellen te meten gebruikt. Deze nieuwe benadering kan worden gebruikt om veranderingen in celvorm na receptor activatie kwantificeren en dus een mogelijke extra hulpmiddel voor drug discovery.

Een analytisch instrument dat cellulaire morfologie Veranderingen van Drie-dimensionale Fluorescentie afbeeldingen kwantificeert

Dit protocol beschrijft hoe totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie te gebruiken om enkele receptoren op het oppervlak van levende cellen te visualiseren en te volgen en daarmee de laterale mobiliteit van receptoren, de grootte van receptorcomplexen te analyseren, evenals om voorbijgaande receptor-receptorinteracties te visualiseren. Dit protocol kan worden uitgebreid tot andere membraaneiwitten.

Hoge-resolutie Spatiotemporal Analyse van Receptor Dynamics door Single-molecule fluorescentie microscopie

Eenvoudige methoden om de selectieve activering van G-eiwitten door G-eiwit-gekoppelde receptoren te detecteren, blijven een grote uitdaging in celsignalering. Hiervoor zijn Fӧrster resonantie-energieoverdracht (FRET) biosensoren ontwikkeld door een GPCR paarsgewijs vast te maken aan G-eiwitpeptiden om conformationele veranderingen te onderzoeken bij gecontroleerde concentraties in levende cellen.

G Protein-selectieve GPCR Conformaties gemeten met behulp van FRET sensoren in een Live Cell Suspension Fluorometer Assay

Guanosine trifosfaat (GTP) binding is een van de vroegste gebeurtenissen bij G-proteïne-koppelde receptor (GPCR) activatie. Dit protocol beschrijft hoe u specifieke GPCR-ligandinteracties farmacologisch kunt karakteriseren door de binding van het radioactief gemerkte GTP-analoog, [35S] guanosine-5'-O- (3-thio) trifosfaat ([35S] GTPγS) te monitoren in Reactie op een ligand van interesse.

Het meten van G-eiwit-gekoppelde Receptor Signaling via Radio-gelabeld GTP Binding

Een procedure wordt gepresenteerd om te visualiseren van proteïne kinase een activiteiten in hoofd-vaste, gedragen muizen. Een verbeterde A-kinase activiteit Reporter, tAKARα, wordt uitgedrukt in corticale neuronen en toegankelijk gemaakt voorbeeld vorming door middel van een craniaal venster. Two-photon fluorescentie Lifetime Imaging microscopie wordt gebruikt om PKA-activiteiten in vivo te visualiseren tijdens gedwongen motoriek.

Visualisering van proteïne kinase een activiteit in hoofd-vaste muizen die in vivo twee-fotonen fluorescentie levensduur beeld microscopie gebruiken

Morfologische veranderingen optreden in immuun responsieve fibroblast cellen na activering en het bevorderen van veranderingen in cellulaire werving. Gebruik makend van 2-Photon Imaging in combinatie met een genetisch gemanipuleerde fibroblast-specifieke proteïne 1 (FSP1)-CRE; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) muis lijn en groene fluorescently gelabeld lipopolysaccharide-FITC, we kunnen zeer specifieke opname van lipopolysaccharide in dermale fibroblasten en morfologische veranderingen in...

In vivo tweekleurige 2-Fobe beeldvorming van genetisch gelabelde reporter cellen in de huid

Vanwege de inherente lage signaal-ruisverhouding (SNR) van Fӧrster resonantie energieoverdracht (FRET) gebaseerde sensoren, is het meten van cAMP-signalen een uitdaging geweest, vooral in drie ruimtelijke dimensies. Hier beschrijven we een hyperspectrale FRET-beeldvormings- en analysemethodologie die het mogelijk maakt om de cAMP-verdeling in drie ruimtelijke dimensies te meten.

Meting van 3-dimensionale cAMP-distributies in levende cellen met behulp van 4-dimensionale (x, y, z en λ) hyperspectrale FRET-beeldvorming en -analyse

In vivo beeldvorming is een krachtig hulpmiddel voor de studie van biologie in gezondheid en ziekte. Dit protocol beschrijft transpupillaire beeldvorming van het netvlies van de muis met een standaard microscoop met twee fotonen. Het demonstreert ook verschillende in vivoimaging-methoden om fluorescerend meerdere cellulaire cohorten van het netvlies te labelen.

Transpupillaire twee-fotonen in vivo beeldvorming van het netvlies van de muis

Gestimuleerde Raman-verstrooiing (SRS) microscopie maakt labelvrije beeldvorming van biomoleculen mogelijk op basis van hun intrinsieke vibratie van specifieke chemische bindingen. In dit protocol wordt de instrumentele opstelling van een geïntegreerde SRS- en twee-fotonenfluorescentiemicroscoop beschreven om cellulaire structuren in het ruggenmerg van levende muizen te visualiseren.

In vivo Beeldvorming van biologische weefsels met gecombineerde twee-fotonenfluorescentie en gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie

Leer hoe je FRET-efficiëntiekaarten genereert met spectraal opgeloste twee-foton microscopie in levende gistcellen. Deze methode onthult stoichiometrische informatie over eiwitcomplexen en receptorinteracties.

In vivo Kwantificering van G-eiwit gekoppelde receptor interacties met behulp van spectraal Opgelost Twee-foton microscopie

Meer video's verkennen