Name: Het testen van β-amyloïde toxiciteit met behulp van een transgene C. elegans Model (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 59 s
Description: Leer een in vivo toxiciteitsassay voor β-amyloïde met behulp van transgene Caenorhabditis elegans. Deze methode maakt snelle, kosteneffectieve screening van genetische en farmacologische modificaties mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag de huidige en voormalige leden van de Link lab die heeft geholpen bij de ontwikkeling van de protocollen hier beschreven, met name Gin Fonte, die ontwikkelde de oorspronkelijke procedure bedanken. Dit werk werd ondersteund door awards van de NIH (AG12423) en de Alzheimer&#39;s Association (Zenith Award) om CDL

1) voorbereiden Nematode Groei Media platen voor verlamming test. Verlamming testen worden uitgevoerd op de standaard Nematode Growth Media (NGM) platen routinematig gebruikt voor C. elegans voortplanting en genetica (Stiernagle, 2006). <ol><li> Autoclaaf de NGM oplossing die NaCl, Agar en Peptone in een erlenmeyer en voeg de juiste hoeveelheid steriel CaCl 2, Uracil, Cholesterol, 1M MgSO 4 en 1M KPO 4. Aliquot 10 ml vloeistof NGM in elke 60 mm x 15 mm Petri Dish. Laat NGM een nacht stollen op kamertemperatuur. </li><li> Als het testen voor de effecten van verbindingen / extracten, aliquot het extract op elk bord en gebruik een strooier gelijkmatig te verdelen het extract over het oppervlak van de plaat. Laat extract een nacht drogen bij kamertemperatuur. Groter dan 1 ml zal meer tijd nodig om te drogen. </li><li> Spot elk bord met 250 ul van E. coli-stam OP5O gekweekt in LB Media 's nachts voor een optische dichtheid van 0.4-0.6. Laat bacteriën een nacht drogen bij kamertemperatuur. </li></ol> Relevante variabelen De leeftijd van de platen heeft een significante invloed op de verlamming assay, zoals oudere platen hebben de neiging uit te drogen. Gebruik platen gegoten binnen een week van verlamming test. Voor optimale resultaten, giet platen 3-4 dagen voor het begin van synchrone worm bevolking [zie (2) hieronder]. Voor een experiment, gebruik dan alleen platen gegoten uit dezelfde partij. Het veranderen van de grootte van het gazon (dat wil zeggen gespot vs verspreid) en / of de aard van de bacterie zal ook veranderen het gedrag van de wormen. Verlamming testen kunnen worden uitgevoerd met behulp van alternatieve E. coli-stammen als een bron van voedsel (bijvoorbeeld de HT115 gebruikte stam in het voeden van RNAi experimenten), maar dit kan veranderen de kinetiek van verlamming, waardoor het nodig passende interne controles. 2) Voorbereiding van Age-synchroon Worm Populaties Strain CL4176 (SMG-1 (cc546 ts) I; dvIs27 [myo-3 / Aß minigen + rol-6 (su1006) marker-gen] X wordt het meest gebruikt voor het testen van Aß-geïnduceerde verlamming deze soort en andere transgene modellen zijn beschikbaar. academische onderzoekers voor een nominale vergoeding uit het Caenorhabditis Genetics Center (http://www.cbs.umn.edu/CGC/). <ol><li> Aan de leeftijd synchronie van de test bevolking verdient het de voorkeur om te beginnen met een gesynchroniseerde ouderlijk generatie te maximaliseren. Een week voor de inleiding van de verlamming test van de test bevolking, gebruik dan een platina worm picker tot 20-30 zwangere volwassenen overdracht naar een aantal 10 cm NGM borden verspreid met OP50 voor een 2 uur durende ei te leggen bij 16 ° C (de permissieve temperatuur voor CL4176 ). Verwijder de zwangere volwassenen en laat het nageslacht te groeien gedurende 7 dagen, tegen die tijd zullen zij 'tweede dag' zwangere volwassenen. </li><li> (Dag 1) De tweede dag zwangere volwassenen gebruikt om de leeftijd-synchrone testen bevolking voor te bereiden. Voor elke experimentele conditie van het object is het genereren van drievoud platen met 50 tot 75 jaar-synchroon wormen. Met behulp van een platina-worm Picker, overdracht 10-12 van de dag 2 zwangere volwassenen op 60 mm (10 ml volume) NGM platen gespot met OP50. Laat de wormen om eieren te leggen bij 16 ° C gedurende 2 uur, kies dan uit de volwassenen en laat de eieren uit te komen en te groeien bij 16 ° C. Op dit punt is het het beste om iemand die niet in het scoren van de platen om ze code, zodat de teller zal blind zijn voor experimentele omstandigheden. </li></ol> Relevante variabelen Het stadium van de embryonale ontwikkeling bij het eieren gelegd (~ de 26-cellig stadium voor het wildtype wormen onder optimale condities) is een functie van de volwassen leeftijd en voeding. Als de zwangere volwassenen worden gebruikt voor de voorbereiding van de test bevolking ouder zijn of uitgehongerd, zal later stadium eieren worden gelegd, waardoor de leeftijd synchronie van de bevolking en de reproduceerbaarheid van verlamming kinetiek. Het is essentieel dan de mono-Axenische (dat wil zeggen, alleen OP50 bacteriën) culturen worden gebruikt (microbiële verontreinigingen kan ernstige gevolgen hebben voor deze test), en de reproduceerbaarheid is het hoogst als het drievoud platen hebben vergelijkbare aantallen wormen. 3) Transgene Inductie en verlamming Assay <ol><li> (Dag 3) Upshift platen tot 25 ° C 48 uur na het einde van de synchrone ei te leggen, wormen moet worden bij het derde larvale stadium (L3). De platen moeten worden geregeld, zonder stapelen in een 25 ° C incubator om alle platen tot 25 ° C te bereiken op hetzelfde moment. </li><li> (Dag 4) Begin met het scoren van de verlamming van de wormen (stam CL4176) bij 18-20 uur na de start van opschakelen. Op dit moment moeten alle wormen in de bevolking hebben bereikt de vierde larvale (L4) stadium. Blijven scoren in twee uur stappen totdat alle wormen op elk van de platen zijn verlamd. Om onbekende redenen, verlamming is nog niet eens over de lichaamslengte: het hoofd regio is het laatste deel van de worm te stoppen bewegen. Zo, wORMS die onlangs zijn begonnen met verlamming niet kunnen vertalen over de plaat, maar kan bewegen hun hoofd, waardoor bacteriën opruimen rond hun voorste en het verlaten van een "halo" van verwijderd bacteriën. Deze wormen zullen altijd worden volledig verlamd, en dus wormen met halo's worden gecategoriseerd als verlamd. Sommige wormen hebben geen halo's, maar zal ook niet zien spontane beweging, deze zijn getest door porren met de worm picker. Als er een aangespoord worm kan een full body golfvoortplanting niet ondergaan op porren, wordt het ook gescoord als verlamd. Voor een efficiënte scoren, is het het gemakkelijkst om de verlamde wormen verplaatsen naar een onbevlekt sector van de plaat, zodat ze niet onbedoeld worden rescored de komende periode scoren. (Dit maakt het ook mis-gecategoriseerd wormen aan te tonen beweging, waardoor een scoring correctie). </li><li> Voor het genereren van een verlamming curve, op elk tijdstip van de fractie van de wormen op elke plaat die nog niet zijn verlamd wordt omgezet in een percentage, en de gemiddelde "unparalyzed" percentage is uitgezet tegen de tijd van opschakelen initiatie. (De reden voor het plotten van op deze manier is dat de resulterende curve is formeel analoog aan een survival curve, en dus kan worden geanalyseerd met behulp van standaard niet-parametrische survival statistieken.) </li></ol> Relevante variabelen Het opschakelen van transgene myo-3/Aβ wormen moet gebeuren voordat ze in het midden van de L4 stadium voor verlamming te worden gestart, omdat de myo-3 promotor is op ontwikkelingsgebied geregeld, en heeft aanzienlijk verminderd uitdrukking in de late L4 of volwassen wormen. Op dezelfde manier wordt de expressie van deze transgene geblokkeerd als wormen worden uitgehongerd, dus het is essentieel dat de wormen zijn goed doorvoed gedurende het experiment. We hebben nog nooit waargenomen een verlamde worm te herstellen onder alle omstandigheden, en na 12 tot 16 uur van opschakelen, alle CL4176 wormen zullen verlammen, zelfs als ze schakelde terug tot 16 ° C. In stam CL4176, om voldoende opregulatie van transgenexpressie leiden tot verlamming kan optreden bij lagere temperaturen (dat wil zeggen, 20-25 ° C), hoewel de timing van verlamming zal worden gewijzigd. De verlamming is afhankelijk van de specifieke gebruikte transgene stam (we hebben gebouwd myo-3/Aβ stammen met zowel sneller als langzamer dan de CL4176), dus met alternatieve stammen de scorende venster moet mogelijk worden aangepast. 4) representatieve resultaten Weergegeven in figuur 1 is een plot van een verlamming curve voor CL4176, zowel onbehandeld en blootgesteld aan 6,27 mM cafeïne (uiteindelijke concentratie in NGM plaat). Deze behandeling resulteert in een statistisch zeer significante vertraging in de verlamming van ongeveer 4 uur, die we als een indicatie van de onderdrukking van Aß toxiciteit interpreteren in dit model. Weergegeven in figuur 2 is een onafhankelijk experiment testen van de effecten van cafestol, een andere verbinding die in koffie. Dit perceel is typisch voor behandelingen die niet invloed Aß toxiciteit. Merk op dat in beide experimenten ongeveer de helft van de onbehandelde CL4176 populaties verlamd na 24 uur, en de verlamming is compleet met 28 uur. Deze termijnen zijn typisch voor de verlamming van controle CL4176 populaties. Significante afwijkingen van deze timing zijn indicatief van veranderde omgevingscondities of spontane verwijdering van transgene exemplaren. (CL4176 bevat een chromosomaal geïntegreerd transgene array met meerdere exemplaren van de myo-3/Aβ transgen. Hoewel deze transgene array is normaal gesproken behoorlijk stabiel, elke verspreiding van de stam bij temperaturen&gt; 16 ° C zal kiezen voor zeldzame wormen die hebben ondergaan een spontane verwijdering van transgenen, wat resulteert in varianten die een geringere Aß expressie en langzamer verlamming resultaten.) <img src="/files/ftp_upload/2252/2252fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Verlamming curve voor stam CL4176 wormen onbehandeld of worden blootgesteld aan 6,27 mM cafeïne (Sigma). De aangegeven tijden zijn vanaf de start van de temperatuur opschakelen. Foutbalken = SEM <img src="/files/ftp_upload/2252/2252fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Verlamming curve voor CL4176 wormen worden blootgesteld aan 0,48 mM cafestol (Sigma). Foutbalken = SEM

<ol><li>Arya, U., Dwivedi, H., Subramaniam, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reserpine+ameliorates+Abeta+toxicity+in+the+Alzheimer%27s+disease+model+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Reserpine ameliorates Abeta toxicity in the Alzheimer's disease model in Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 44, 462-466 (2009).</li>
<li>Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+activities+protect+against+age-onset+proteotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity.</a> Science. 313, 1604-1610 (2006).</li>
<li>Dosanjh, L. E., Brown, M. K., Rao, G., Link, C. D., Luo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+phenotyping+of+a+transgenic+C.+elegans+expressing+neuronal+amyloid-beta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Behavioral phenotyping of a transgenic C. elegans expressing neuronal amyloid-beta.</a> J Alzheimers Dis. , (2009).</li>
<li>Drake, J., Link, C. D., Butterfield, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+precedes+fibrillar+deposition+of+Alzheimer%27s+disease+amyloid+beta-peptide+%281-42%29+in+a+transgenic+Caenorhabditis+elegans+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress precedes fibrillar deposition of Alzheimer's disease amyloid beta-peptide (1-42) in a transgenic Caenorhabditis elegans model.</a> Neurobiol Aging. 24, 415-4120 (2003).</li>
<li>Fay, D. S., Fluet, A., Johnson, C. J., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+aggregation+of+beta-amyloid+peptide+variants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">In vivo aggregation of beta-amyloid peptide variants.</a> J Neurochem. 71, 1616-1625 (1998).</li>
<li>Florez-McClure, M. L., Hohsfield, L. A., Fonte, G., Bealor, M. T., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+insulin-receptor+signaling+promotes+the+autophagic+degradation+of+beta-amyloid+peptide+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Decreased insulin-receptor signaling promotes the autophagic degradation of beta-amyloid peptide in C. elegans.</a> Autophagy. 3, 569-580 (2007).</li>
<li>Fonte, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+in+vivo+beta-amyloid+peptide+toxicity+by+overexpression+of+the+HSP-16.2+small+chaperone+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Suppression of in vivo beta-amyloid peptide toxicity by overexpression of the HSP-16.2 small chaperone protein.</a> J Biol Chem. 283, 784-7891 (2008).</li>
<li>Hassan, W. M., Merin, D. A., Fonte, V., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AIP-1+ameliorates+beta-amyloid+peptide+toxicity+in+a+Caenorhabditis+elegans+Alzheimer%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">AIP-1 ameliorates beta-amyloid peptide toxicity in a Caenorhabditis elegans Alzheimer's disease model.</a> Hum Mol Genet. 18, 2739-2747 (2009).</li>
<li>Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+human+beta-amyloid+peptide+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 9368-9372 (1995).</li>
<li>Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+analysis+in+a+transgenic+Caenorhabditis+elegans+Alzheimer%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Gene expression analysis in a transgenic Caenorhabditis elegans Alzheimer's disease model.</a> Neurobiol Aging. 24, 397-413 (2003).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-beta-induced+pathological+behaviors+are+suppressed+by+Ginkgo+biloba+extract+EGb+761+and+ginkgolides+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Amyloid-beta-induced pathological behaviors are suppressed by Ginkgo biloba extract EGb 761 and ginkgolides in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> J Neurosci. 26, 13102-13113 (2006).</li>
</ol>

Het protocol hebben we beschreven kan effectief worden gebruikt voor het testen van de effecten van de verbindingen op Aß toxiciteit. Gepubliceerd voorbeelden zijn de effecten van Ginkgo biloba-extract bestanddelen (Wu et al.. 2006) en reserpine (Arya et al.. 2009). Verbindingen die zijn beschermend tegen Aß toxiciteit bij andere systemen hebben ook aangetoond dat beschermende in dit model (bijv. memantine, onze niet-gepubliceerde resultaten). Een belangrijke reden voor de oprichting van dit model is dat de goed ontwikkelde genetische en moleculaire technieken beschikbaar zijn in C. elegans kan worden gebruikt om mechanismen van Aß toxiciteit te onderzoeken. Zo kunnen de effecten specifieke mutaties op de Aß toxiciteit worden getest (bv. een vermindering van de insuline-achtige signalering door de invoering van een daf-2 verlies-van-functie mutatie, Florez-McClure et al. 2007)., En dit model kan ook worden gebruikt om de effecten van de over-expressie transgenen (Fonte et al.. 2008) te onderzoeken. We hebben onlangs uitvoerig gebruik gemaakt van dit model om de effecten op toxiciteit van enkel aminozuur substituties in Aß (niet gepubliceerde data) te onderzoeken. De transgene model hier beschreven analyses het effect van acute Aß expressie op spiercel functie. Op het moment van verlamming spiercellen en hun sarcomeer zijn intact, de verlamming fenotype is niet het gevolg van spier celdood. Echter, na verlamming (~ 48 uur na de eerste opschakelen) is er een afbraak van spieren integriteit en de uiteindelijke dood van de wormen. We hebben niet onderzocht die stroomafwaarts effect van Aß meningsuiting of gebruikten het als een toxiciteit marker. De induceerbare Aß uitdrukking hier beschreven model is niet geschikt voor het onderzoeken van behandelingen die β-amyloïde formatie per se moduleren. Hoewel de transgene wormen met constitutieve Aß uitdrukking vorm gemakkelijk detecteerbaar amyloïd afzettingen (Fay et al., 1998;.. Link et al. 2001), transgene wormen met induceerbare Aß uitdrukking hebben zelden amyloid deposito&#39;s en de verlamming fenotype verschijnt onafhankelijk van amyloid depositie (Drake et al.. 2003). Onze resultaten komen overeen met de opvatting dat acute toxiciteit van Aß geïnduceerde expressie het gevolg van de accumulatie van oplosbare Aß oligomere, niet amyloïde afzetting.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagentia </td><td> Quantity/2L </td><td> Bedrijf / Catalogus # </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 6g </td><td> Sigma-Aldrich / S9888 </td><td></td></tr><tr><td> Agar-agar </td><td> 40g </td><td> Sigma-Aldrich / A7002 </td><td></td></tr><tr><td> Pepton </td><td> 5g </td><td> Sigma-Aldrich / P0556 </td><td></td></tr><tr><td> DDH 2 O </td><td> 2L </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1M CaCl 2 </td><td> 2 ml </td><td></td><td> 147.02mg/mL in DDH 2 O </td></tr><tr><td> Uracil </td><td> 2 ml </td><td></td><td> 2mg/mL in DDH 2 O </td></tr><tr><td> Cholesterol </td><td> 2 ml </td><td></td><td> 5mg/ml in ethanol (niet autoclaaf) </td></tr><tr><td> 1M MgSO 4 </td><td> 2 ml </td><td></td><td> 246.5mg/mL in DDH 2 O </td></tr><tr><td> 1M KPO 4 </td><td> 50ml </td><td></td><td> 98mg KH 2 PO 4. ML, 48mg K2HPO4/mL in DDH 2 O, pH </td></tr><tr><td> Erlenmeyer </td><td></td><td> VWR </td><td></td></tr></tbody></table>

het testen van β-amyloïde toxiciteit met behulp van een transgene c. elegans model

Assaying &beta;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

Accumulatie van het β-amyloïd peptide (Aß) wordt algemeen aangenomen dat centraal staan ​​in de inductie van de ziekte van Alzheimer, maar de relevante mechanisme (s) van de toxiciteit zijn nog onduidelijk. Aß is ook intramusculair gestort in Inclusion Body Myositis, een ernstige menselijke myopathie. De intens bestudeerde nematode worm Caenorhabditis elegans kan transgenically worden gemanipuleerd om de menselijke Aß uit te drukken. Afhankelijk van het weefsel of het tijdstip van Aß expressie, kunnen transgene wormen hebben gemakkelijk meetbaar fenotypen die dienen als een read-out van Aß toxiciteit. Bijvoorbeeld, transgene wormen met pan-Aß neuronale expressie gebreken vertonen is associatief leren (Dosanjh et al., 2009.), Terwijl transgene wormen met constitutieve spier-specifieke expressie vertonen een progressieve, leeftijd-afhankelijke verlamming fenotype (Link, 1995; Cohen et al. . 2006). Een bijzonder nuttige C. elegans model maakt gebruik van een temperatuurgevoelige mutatie in het mRNA surveillance systeem engineer temperatuur-induceerbare spieren de expressie van een transgen Aß, wat resulteert in een reproduceerbare verlamming fenotype af van de temperatuur opschakelen (Link et al.. 2003). Behandelingen die tegen Aß toxiciteit in dit model [bijv., expressie van een beschermende transgen (Hassan et al.. 2009) of blootstelling aan Ginkgo biloba extracten (Wu et al.. 2006)] reproduceerbaar de snelheid van verlamming veroorzaakt door de temperatuur opschakelen van deze transgene veranderen wormen. Hier beschrijven we ons protocol voor het meten van de snelheid van verlamming in deze transgene C. elegans model, met bijzondere aandacht voor experimentele variabelen die deze meting kunnen beïnvloeden.

De intens bestudeerde nematode worm<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Kan transgenically worden gemanipuleerd om het menselijk β-amyloïd peptide (Aß) uit te drukken. Geïnduceerde expressie van Aß in<em&gt; C. elegans</em&gt; Spier leidt tot een snelle, reproduceerbare verlamming fenotype die gebruikt kan worden om behandelingen die Aß toxiciteit moduleren volgen.

Het testen van β-amyloïde toxiciteit met behulp van een transgene C. elegans Model

De accumulatie van het $\beta$-amyloïde peptide (A$\beta$) wordt over het algemeen beschouwd als centraal bij de inductie van de ziekte van Alzheimer, maar de relevante ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de toxiciteit van het bèta-amyloïde peptide te analyseren in een in vivo modelsysteem. De reproduceerbaarheid en relatieve eenvoud van deze assay maken het mogelijk om snel geneesmiddelen, omgevingsfactoren of genetische modificaties te testen op de toxiciteit van bèta-amyloïde. Een sleutelfactor bij de ontwikkeling van deze assay is de generatie van transgene cl egan's wormen met spierspecifieke, temperatuur-induceerbare expressie van het bèta-amyloïde peptide.Deze temperatuursensitieve expressie is ontwikkeld door een transgen te construeren dat een abnormaal lange 3'-onvertaalde regio bevat, waardoor het transgen-mRNA een doelwit wordt van de mRNA-surveillance. De expressie van dit transgen is daarom gering in wild-type wormen met een functioneel mRNA-surveillance-systeem vanwege de degradatie van het transgen-mRNA. Indien dit transgen wordt geïntroduceerd in een genetische achtergrond die een mutatie bevat in een essentieel onderdeel van het mRNA-surveillance-systeem, zal de expressie van het transgen significant hoger zijn. Indien de genetische achtergrond een temperatuursensitieve mutatie in het mRNA-surveillance-systeem bevat, zal vermeerdering van deze transgene stam bij de niet-permissieve temperatuur de degradatie van het transgen-mRNA blokkeren en resulteren in een hoge expressie van het transgen. Transgene wormen die dit systeem gebruiken om de expressie van het bèta-amyloïde peptide in de spieren van de lichaamswand te reguleren, vertonen bij een temperatuurovergang van 16 °C naar 25 °C een hoge accumulatie van het bèta-amyloïde peptide, dysfunctie van spiercellen en verlamming van de wormen; de tijd hiervan wordt gemeten.Het duurt een tijd voordat een populatie van deze transgene wormen verlamd raakt na een temperatuurstijging. Deze methode is een gevoelige assay voor bèta-amyloïde toxiciteit. Dit wordt bereikt door verse nematode-groeimediaplaten te maken voor de verlammingsassay, wat helpt om omgevingsvariabelen die de verlammingspercentages kunnen beïnvloeden te minimaliseren.Als tweede stap worden leeftijdgesynchroniseerde populaties van transgene wormen geïnitieerd; dit minimaliseert de effecten van het ontwikkelingsstadium op de expressie van het transgen. Vervolgens worden gesynchroniseerde wormen in het derde larvale stadium overgezet van 16 °C naar 25 °C, wat de stabiliteit van het transgene mRNA verhoogt en leidt tot de accumulatie van het bèta-amyloïdpeptide. Door de tijd van de temperatuurverhoging tot aan verlamming voor elke worm te meten, wordt de snelheid van spierdisfunctie vastgelegd, waardoor de toxische effecten van de accumulatie van het bèta-amyloïdpeptide worden bepaald. De resultaten tonen het effect van specifieke behandelingen op de toxiciteit van endogeen tot expressie gebracht beta-amyloïdpeptide.Het belangrijkste voordeel van onze techniek, in tegenstelling tot het gebruik van transgene muismodellen om de drugactiviteit te analyseren, is dat we onze methode veel sneller en veel goedkoper kunnen uitvoeren. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel. Het scoren van L4-wormen in een verlammingsassay is zeer moeilijk aan te leren.Wanneer u een verlamde L4-worm scoort, moet u letten op de geïsoleerde halo-beweging van de kopregio van de worm. Zodra deze regio beweegt terwijl het gehele lichaam van de worm verlamd is, scoren we die worm als verlamd. Paralyse-assays worden uitgevoerd op platen met standaard nematode growth media of NGM, die routinematig worden gebruikt voor de propagatie en genetica van C. elegans.Om de platen voor te bereiden, autoclaveert u de NGM-oplossing die natriumchloride, agar en peptide bevat in een erlenmeyer, en voegt u vervolgens de juiste hoeveelheden van de volgende steriele oplossingen toe die in het bijbehorende geschreven protocol te vinden zijn. Verdeel 10 milliliters vloeibaar NGM over elke Petri schaal van 60 millimeter bij 15 millimeter. Laat het NGM gedurende de nacht stollen bij kamertemperatuur.Bij het testen van de effecten van verbindingen of extracten, verdeelt u het extract in aliquoten over elke plaat en gebruikt u een spreider om het gelijkmatig over het oppervlak van de plaat te verspreiden. Laat de platen een nacht drogen bij kamertemperatuur. Volumes van meer dan één milliliter hebben meer tijd nodig om te drogen.Spot vervolgens elke plaat met 250 µL E. coli stam OP 50, die gedurende de nacht in LB-medium is gekweekt tot een optische dichtheid van 0,4 tot 0,6, en laat de bacteriën gedurende de nacht bij kamertemperatuur drogen. De ouderdom van de plaat heeft een significant effect op de verlammingsgraad, waarbij oudere platen de neiging hebben uit te drogen. Platen moeten binnen één week voor de verlammingsassay worden gegoten.Idealiter gebruikt u platen die drie tot vier dagen voor de synchrone ei-afzetting zijn gegoten; de platen die in een experiment worden gebruikt, moeten allemaal uit dezelfde batch komen. Het wijzigen van de grootte van het gazon en/of de bacteriën zal ook het gedrag van de wormen beïnvloeden. Paralyse-assays kunnen worden uitgevoerd met alternatieve E. coli-stammen. Zo wordt HT115 gebruikt in RNAi-experimenten. Dit kan echter de kinetiek van de paralyse-assay veranderen.Daarom moeten er geschikte interne controles voor de stam worden gebruikt. Stam CL 476 wordt het meest gebruikt voor het analyseren van bèta-geïnduceerde verlamming. Deze stam en andere transgene modellen zijn beschikbaar voor academische onderzoekers tegen een nominale vergoeding via het Saint Ahadi Genetic Center.Om de leeftijdssynchronisatie van de testpopulatie te maximaliseren, verdient het de voorkeur om te beginnen met een gesynchroniseerde oudergeneratie. Gebruik een week voor aanvang van de verlammingsanalyse van de testpopulatie een platinen wormpicker om 20 tot 30 volwassen wormmen over te brengen naar meerdere NGM-platen van 10 centimeter.Uitplaten met OP 50 voor een eiafzetperiode van twee uur bij 16 graden Celsius, wat de permissieve temperatuur is voor CL 4 1 76. Verwijder de GR-volwassenen en laat de nakomelingen zeven dagen groeien, zodat ze op dat moment volwassen tweede-daags grave zijn. Tweede-daags gravity.Volwassenen worden gebruikt om leeftijdssynchrone testpopulaties voor elke experimentele conditie voor te bereiden. Het doel is om triplaatjes te genereren die 50 tot 75 leeftijdssynchrone wormen bevatten met behulp van een platina wormenpicker. Breng 10 tot 12 volwassen wormen van twee dagen oud over naar 60 millimeter NGM-plaatjes met OP 50. Laat de wormen twee uur lang eieren leggen bij 16 °C, verwijder vervolgens de volwassenen en laat de eieren uitkomen en groeien bij 16 °C.Op dit punt is het raadzaam om iemand die de platen niet gaat scoren deze te laten coderen, zodat de scoring blind is voor de experimentele condities. Het stadium van embryonale ontwikkeling bij het leggen van de eieren, wat voor wild-type wormen onder optimale condities ongeveer het 26-celstadium is, is een functie van de leeftijd van de volwassenen en hun voeding. Als de gebruikte volwassen wormen voor de eierlegger ouder zijn of zijn uitgehongerd, zullen eieren in een later stadium worden gelegd en zal een synchrone populatie niet worden bereikt, wat de kinetiek van de paralyse-assay beïnvloedt.Het is essentieel dat monogene bacteriële culturen zoals e coli, OP 50 worden gebruikt, omdat bacteriële contaminatie van welke aard dan ook deze assay ernstig kan beïnvloeden. De reproduceerbaarheid is het hoogst als uw triplaatjes een vergelijkbaar aantal wormen bevatten. Om het transgen te induceren en de paralyse-assay uit te voeren, worden de plaatjes opgewarmd naar 25 °C.48 uur na het einde van de synchrone eiafszetting zouden de wormen zich in het derde larvale stadium moeten bevinden. Platen moeten zonder stapeling in een incubator van 25 °C worden geplaatst, zodat de platen deze temperatuur kunnen bereiken. Begin tegelijkertijd met het scoren van de verlamming van de wormen 18 tot 20 uur nadat de temperatuurverhoging (upshift) is ingezet.Op dit punt zouden alle wormen in de populatie het vierde larvale stadium moeten hebben bereikt; ga door met het scoren in intervallen van twee uur totdat alle wormen op elk van de platen verlamd zijn. Om onbekende redenen is de verlamming niet gelijkmatig over de lichaamslengte verdeeld. De kopregio is het laatste deel van de worm dat stopt met bewegen.Wormen die onlangs verlamming hebben vertoond, kunnen dus niet over de plaat verplaatsen, maar kunnen hun koppen nog wel bewegen, waardoor de bacteriën rond hun anterieure uiteinde worden verwijderd en er een halo van vrijgemaakte bacteriën ontstaat. Deze wormen zullen onvermijdelijk volledig verlamd raken, waardoor wormen met halo's worden gekarakteriseerd als verlamd. Sommige wormen zullen geen halo's hebben, maar zullen ook geen spontane beweging vertonen.Deze worden getest door ze aan te raken met de wormpincet. Als een aangeraakte worm na stimulatie geen volledige lichaamsgolven kan voortplanten, wordt deze voor een efficiënte scoreopname eveneens als verlamd gescoord. Het is het eenvoudigst om de verlamde wormen naar een ongemerkte sector van de plaat te verplaatsen, zodat ze tijdens de volgende scoreperiode niet onbedoeld opnieuw worden gescoord.Dit stelt ook onjuist gecategoriseerde wormen in staat om beweging te vertonen, waardoor een correctie van de score mogelijk is om een verlammingscurve te genereren. Op elk tijdstip wordt het fractie van de wormen op elke plaat die niet verlamd zijn omgezet in een percentage, en het gemiddelde niet-verlamde percentage wordt uitgezet tegen de tijd vanaf het moment dat de temperatuurovergang (upshift) werd ingezet. De resulterende curve is formeel analoog aan een overlevingscurve en kan daarom worden geanalyseerd met standaard non-parametrische overlevingsstatistiek.De upshift van de transgene myo-3 Aβ-wormen moet vóór het midden van het L4-stadium worden uitgevoerd om de verlamming te initiëren. De myo-3 promoter is ontwikkelingsregulerend. Zodra de wormen het late L4-stadium of de volwassen fase hebben bereikt, is het expressieniveau aanzienlijk afgenomen.De expressie van het transgen wordt geblokkeerd als de wormen uithongeren, dus het is essentieel dat de wormen gedurende het hele experiment goed gevoed worden. We hebben nog nooit waargenomen dat een verlamde worm onder enige omstandigheid herstelde. Na 12 tot 16 uur Upshift zal CL 41 76 verlamd raken, ongeacht of u de temperatuur verlaagt naar 16 graden; bij stam CL 41 76 kan de upregulatie van de transgeenexpressie die verlamming veroorzaakt, ook bij lagere temperaturen optreden.Houd er echter rekening mee dat de timing van de verlammingsgraad zal variëren. De verlammingsgraad is afhankelijk van de specifieke gebruikte transgene stam. We hebben myo drie A beta-stammen ontwikkeld met een verlammingsgraad die sneller en langzamer is dan die van CL 41 76; daarom dient u het beoordelingsvenster voor de verlammingsanalyse dienovereenkomstig aan te passen.Hier wordt een plot van een verlammingscurve voor CL 4 1 76 getoond, zowel onbehandeld als blootgesteld aan 6,27 millimolair cafeïne. Deze behandeling resulteert in een zeer statistisch significante vertraging van de verlamming van ongeveer vier uur, wat wij interpreteren als een aanwijzing voor de onderdrukking van een beta-toxiciteit. In dit model is in dit experiment gekeken naar de effecten van een andere verbinding die in koffie voorkomt.De grafiek is typerend voor behandelingen die geen invloed hebben op beta-toxiciteit. Merk op dat in beide experimenten ongeveer de helft van de onbehandelde CL 4 1 76-populaties na 24 uur verlamd is en de verlamming na 28 uur volledig is. Dit zijn typische tijdvakken voor de verlamming van de controle.Bij CL 4 1 7 6 populaties zijn significante afwijkingen van deze timing indicatief voor gewijzigde omgevingsomstandigheden of spontane deletie van transgene kopieën. Raadpleeg het bijbehorende protocol voor aanvullende informatie over stam CL 4 1 76. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om rekening te houden met de ouderdom van de platen, het stadium van de wormpopulatie en het vermogen om de verlammingsgraad van de wormen te bepalen.Na het bekijken van deze video zou u een goed beeld moeten hebben van hoe u dit sea elgan-systeem kunt gebruiken om de toxiciteit van bèta-amyloïde zorgvuldig te analyseren. U zou in staat moeten zijn om zeer subtiele effecten op deze toxiciteit te detecteren als gevolg van diverse omgevingsfactoren of medicamenteuze behandelingen. De variabelen die we hebben besproken zijn belangrijk om in de gaten te houden, omdat dit u in staat stelt de analyse zeer reproduceerbaar uit te voeren met een consistente verlammingskinetiek.Dit is eigenlijk zeer belangrijk als u de resultaten wilt vergelijken die in uw laboratorium op verschillende tijdstippen door verschillende personen zijn behaald, of wanneer u uw resultaten vergelijkt met die van andere onderzoekers die dit modelsysteem gebruiken.

assaying-amyloid-toxicity-using-a-transgenic-c-elegans-model

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Deze video laat zien hoe C. elegans te gebruiken om dopaminerge neuron neurodegeneratie te beoordelen als een model voor de ziekte van Parkinson. Verder worden genetische screens gebruikt om de factoren die een verbetering van degeneratie of neuroprotectieve identificeren.

Toepassing van een C. elegans Dopamine neuron degeneratie Assay voor de validatie van Potentieel de ziekte van Parkinson Genen

In this video, we describe a method to evaluate the neuroprotective effect of a test compound, astragalan, on neuronal survival in Caenorhabditis elegans from polyQ-mediated neurotoxicity. The assay uses Caenorhabditis elegans expressing the abnormally expanded polyQ repeats fused to GFP in their ASH neurons to measure neuronal survival following test compound treatment.

An Assay to Study Effect of Test Compound against PolyQ-Mediated Neurotoxicity in Worms

Beschrijven we methoden om aspecten van amylopathies in de worm te...

Een<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Model Systeem voor Amylopathy Study

Prion-achtige verspreiding van eiwitaggregaten is recent naar voren gekomen als een factor die bij veel neurodegeneratieve ziekten betrokken is. Het doel van dit protocol is om te beschrijven hoe de rondworm C. elegans als modelsysteem kan worden gebruikt om eiwitverspreiding te volgen en prion-achtige fenomenen te onderzoeken.

Onderzoek naar de verspreiding en de toxiciteit van Prion-achtige eiwitten met behulp van de Metazoan modelorganisme<em&gt; C. elegans</em

Hier beschreven is een gestage, gedrags screening aanpak die kan worden gebruikt om te screenen voor verbindingen die in vivo werkzaamheid vertonen op cognitief en functioneel motorisch gedrag bij transgene muismodellen van β-amyloïdose en tauopathie. Deze methoden zijn geoptimaliseerd om verbindingen te screenen voor activiteit in kort- en werkgeheugen taken.

Evaluatie van spontane alternatie, herkenning van nieuwe objecten en limb clasping in transgene muismodellen van Amyloid-B en Tau Neuropathology

We beschrijven de protocollen voor het gebruik van het brede veld-of-view nematode tracking platform (WF-NTP), waarmee de fenotypische karakterisering van de high-throughput van grote populaties van Caenorhabditis elegans. Deze protocollen kunnen worden gebruikt voor subtiele gedragsveranderingen in gemuteerde stammen of in reactie op farmacologische behandeling in een uiterst schaalbaar mode karakteriseren.

Geautomatiseerde Behavioral analyse van grote C. elegans populaties met behulp van een breed veld-of-view Tracking Platform

Een kwantitatieve methode is ontwikkeld om te identificeren en te voorspellen van de acute toxiciteit van chemische stoffen door het automatisch analyseren de fenotypische profilering van Caenorhabditis elegans. Dit protocol wordt beschreven hoe behandelen van wormen met chemicaliën in een 384-well-plate, vastleggen van video's en kwantificeren van toxicologische verwante fenotypen.

Een High-throughput Assay voor de voorspelling van de chemische toxiciteit door geautomatiseerde fenotypische profilering van Caenorhabditis elegans

Herhaal-geassocieerde niet-ATG-afhankelijke translationele producten zijn opkomende pathogene kenmerken van verschillende herhaalde expansie-gebaseerde ziekten. Het doel van het beschreven protocol is om toxiciteit veroorzaakt door deze peptiden te evalueren met behulp van gedrags-en cellulaire testen in het modelsysteem C. elegans.

Meten RAN Peptide Toxiciteit in C. elegans

Proteostatische achteruitgang is een kenmerk van veroudering en vergemakkelijkt het begin van neurodegeneratieve ziekten. We schetsen een protocol om proteostase kwantificeerbaar te meten in twee verschillende Caenorhabditis elegans-weefsels door heterologe expressie van polyglutamine-herhalingen gefuseerd met een fluorescerende verslaggever. Dit model maakt een snelle in vivo genetische analyse van proteostase mogelijk.

Kwantificering van weefselspecifieke proteostatische achteruitgang van Caenorhabditis elegans

Hier introduceren en beschrijven we op grote schaal toegankelijke methoden met behulp van een aantal veelzijdige nematodemodellen, waaronder hypergeactiveerde ionenkanaalgeïnduceerde necrose en eiwitaggregaat-geïnduceerde neurotoxiciteit, om de cellulaire en moleculaire onderbouwing van leeftijdsgerelateerde neurodegeneratieve ziekten te monitoren en te ontleden.

Modellering van leeftijdsgegende neurodegeneratieve ziekten bij Caenorhabditis elegans

Hier presenteren we een protocol om de neuroprotectieve activiteiten van testverbindingen in Caenorhabditis elegans te beoordelen, inclusief polyglutamineaggregatie, neuronale dood en chemoavoidancegedrag, evenals een voorbeeldige integratie van meerdere fenotypen.

Caenorhabditis elegans als een modelsysteem voor het ontdekken van bioactieve verbindingen tegen polyglutamine-gemedieerde neurotoxiciteit

Leer een in vivo toxiciteitsassay voor β-amyloïde met behulp van transgene Caenorhabditis elegans. Deze methode maakt snelle, kosteneffectieve screening van genetische en farmacologische modificaties mogelijk.

Het testen van β-amyloïde toxiciteit met behulp van een transgene C. elegans Model

Meer video's verkennen