Patch Clamp en perfusie technieken voor het bestuderen van Ion Channels Uitgedrukt in Xenopus Eicellen

Het algemene doel van deze procedure is om de activering van BK-kanalen vast te leggen onder een gecontroleerde spanning, terwijl tegelijkertijd de intracellulaire oplossing wordt beheerst. Dit wordt bereikt door eerst BK-kanalen tot expressie te brengen in Xenopus-ocyten door deze te injecteren met BK-kanaal mRNA. De tweede stap van de procedure is het voorbereiden van het perfusiesysteem.

De derde stap van de procedure is het vormen van een giga-seal tussen het oocytenmembraan en de patchpipet. De laatste stap van de procedure is het uitsnijden van het membraanpatch. Uiteindelijk tonen resultaten verkregen via patchclamp-technologie gekoppeld aan een perfusiesysteem aan dat BK-kanalen worden geactiveerd door veranderingen in voltage en calciumconcentratie.

Hoi, ik ben Jin Cho Young van het laboratorium van Dr. Jamie Zus aan de Washington University. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de neurowetenschappen, waaronder vragen over het moleculaire mechanisme voor de activatie van ionkanalen. Laten we beginnen.

De eerste stap in de procedure begint enkele dagen voor de patch clamping en maakt gebruik van BK-kanaal mRNA dat in vitro is getranscribeerd. Injecteer na het oogsten van Xenopus Lavu Cytes stadium vijf tot zes 0,05 tot 50 nanogram BK-kanaal mRNA in een cyte. Gebruik hiervoor een nano inject two auto nanoliter injector.

Herhaal de injectie bij een dozijn oocyten voor elk mRNA na de injectie. Spoel de oocyten twee keer met ND 96-oplossing. Plaats de oocyten vervolgens in een kweekplaat en incubeer ze bij 18 °C gedurende twee of meer dagen om de oocyten de tijd te geven het BK-kanaal tot expressie te brengen.

Na twee tot vijf dagen incubatie zouden de oocyten BK-kanalen moeten tot expressie brengen en zijn ze klaar voor patchklemmen. Voordat u de oocyten hanteert, stelt u alles klaar wat u verder nodig heeft voor het patchklemmen, beginnend met het perfusiesysteem. Het hier getoonde systeem is de automate valve link.

Gedrukte stikstof van het 16 profusion-systeem duwt de profusion-oplossingen uit de oplossingreservoirs via de profusion-slangen naar de profusion-pen en -tip. De stroom van elke stroom profusion-oplossing wordt geregeld door één reservoirklep en één elektronische klep. In dit protocol wordt een van de reservoirs niet onder druk gezet en fungeert dit als afvalopvanger, evenals als drukontlastingsmechanisme.

Perfusie-oplossingen met verschillende concentraties calcium of magnesium kunnen voorafgaand aan de experimenten worden bereid. Voeg de perfusie-oplossingen toe aan de reservoirs en label elk reservoir om de concentratie calcium of magnesium aan te geven. Om het perfusiesysteem op te stellen, sluit u eerst de slangetjes aan op het perfusiepotlood.

Zet vervolgens de elektronische klepcontroller aan en open de elektronische kleppen om er zeker van te zijn dat de slangetjes en het profusiepenseel vrij zijn van verstoppingen en luchtbellen. Duw met een spuit gevuld met gedeïoniseerd water gedeïoniseerd water door elk slangetje. Sluit op dit punt de slangetjes aan op de oplossingsreservoirs en open de klep van de gascilinder om stikstof onder druk toe te dienen.

Open één reservoirklep om de slang te vullen met een van de reservoiroplossingen. Klik indien nodig op de reservoirklep om luchtbellen uit de oplossing te verwijderen. Sluit de reservoirklep nadat de slang is gevuld met de oplossing, vul de perfusietip met water en schroef deze op het perfusiepotlood.

Zorg ervoor dat er geen luchtbellen ingesloten raken. Bevestig bij het aansluiten van de tip de perfusiepen aan de badtafel met boetseerklei en controleer of de perfusietip zich in de badruimte bevindt. Het perfusiesysteem is nu geïnstalleerd.

Voeg op dit punt gedeïoniseerd water toe aan het bad. Zorg ervoor dat de perfusietip ondergedompeld is in het water. Controleer of elke perfusieoplossing correct uit de perfusietip komt.

Sluit de elektronische klep die is verbonden met de slang van de afvalopvang en open de klep voor een van de perfusie-oplossingen. Observeer onder de microscoop de straal perfusievloeistof die uit de perfusietip komt. Sluit de klep voor die perfusie-oplossing en open de klep voor de afvalopvang.

De perfusiestroom zou bijna moeten verdwijnen. Herhaal dezelfde test voor elk van de perfusieoplossingen. Wanneer u heeft geverifieerd dat alle perfusieoplossingen correct stromen, vervangt u het gedeioniseerde water in het bad door de gewenste badoplossing.

Nu is het tijd om de opnameapparatuur klaar te zetten. De zilveren registratie-elektrode moet vóór elke patchclamp-sessie opnieuw worden gecoat met zilverchloride. Verwijder eerst de elektrodedraad uit de pipethouder en dompel het onderste deel van de elektrodedraad gedurende ten minste 15 minuten onder in een flesje met verse bleek.

Hiermee wordt een laag zilverchloride op de draad afgezet. Spoel de elektrodedraad met gedeïoniseerd water en dep deze droog. Plaats vervolgens de zilver-zilverchloride-elektrode terug in de pipethouder.

Zet nu uw computer aan. Sluit de hardware-sleutel aan op de printerpoort van uw computer. De hardware-sleutel moet zijn aangesloten om de software voor gegevensverwerving, HEA pulse, te kunnen gebruiken.

Zet de versterker aan en start de software voor gegevensverwerving. HEA-puls. Laad het protocolbestand en pas de configuratie-instellingen aan, zoals de stimulusschaal.

Het doel van het aanpassen van de configuratie-instellingen is om te garanderen dat het testpotentiaal exact gelijk is aan het commandeerpotentiaal. Nu zijn we klaar om de oocyten voor te bereiden. Haal de oocyten uit de incubator.

Dompel de oocyten gedurende vijf tot 10 minuten onder in de stripping-oplossing. De stripping-oplossing laat het vitelline membraan los van het plasmamembraan, waardoor het mogelijk wordt om het vitelline membraan te verwijderen. Stripp na vijf tot 10 minuten voorzichtig het vitelline membraan van de oocyten.

Gebruik twee pincetten. Een divi OC-locatie is uiterst fragiel en mag daarom zo min mogelijk worden verplaatst. Zorg ervoor dat de Devi-oöcyt niet wordt blootgesteld aan lucht of bellen en gebruik een glaspipet gevuld met voldoende oplossing om de oöcyt naar het bad over te brengen.

De kanalen op het oocytmembraan zijn nu blootgesteld en gereed voor de patchpipet. Trek een patchpipet door een glazen capillaire buis in de micropipettentrekker te plaatsen. Observeer de pipetten onder een microscoop om de vorm van de tip en de diameter van de opening te bepalen.

De openingsdiameter moet twee tot vier micrometer zijn om de capacitieve stroom tijdens de opname te verminderen; om een gladde punt te verkrijgen, wordt de punt met was gecoat en vervolgens verhit. Polijst de punt onder een microscoop. Vul de pipetpunt door de punt van de pipet in de pipetoplossing te plaatsen en de zuiger naar achteren te trekken.

Hiermee wordt de punt van de pipet bevochtigd. Vul de pipet vervolgens voor een derde met pipetoplossing met behulp van een spuit. Plaats de pipet daarna in de pipethouder met de zilver-zilverchloride-elektrode erin.

Zorg ervoor dat de draadelektrode in contact staat met de pipetvloeistof. De volgende stap is het uitsnijden van een inside-out patch uit de geprepareerde oocyten. Zoek eerst de heldere rand van de oocyt op onder de microscoop.

Beweeg met de manipulator de patchpipet dicht bij de oocyten en zorg dat deze ondergedompeld is. Meet in de badoplossing de serieweerstand van de pipet. De ideale serieweerstand van de patchpipet ligt tussen 1 en 1,5 mΩ wanneer deze is gevuld met pipetoplossing en is ondergedompeld in de badoplossing.

Duw de pipet nu langzaam tegen de oocyte aan totdat de weerstand ongeveer verdubbelt. Creëer een giga-ohm seal door voorzichtig met de mond te zuigen via een zuigbuis die is verbonden met de pipethouder. Nadat is bevestigd dat er een giga seal is gevormd, wordt de patch gestabiliseerd door deze gedurende enkele minuten op minus 30 millivolt te houden.

Om een inside-out patch te verkrijgen, exciseert u de patch door de pipet snel verder in de OO-site te duwen en deze vervolgens voorzichtig terug te trekken. De inside-out patch is nu klaar voor patchclamping. Verplaats de pipet met de inside-out patch tot ongeveer 100 microns afstand van de opening van de perfusietip.

Sluit de elektronische klep voor afvalverzameling en open de reservoirklep voor de gewenste perfusie-oplossing. Begin met het registreren van de stromen over de patch. Wijzig de spanning en de perfusie-oplossingen naar wens.

Wanneer u klaar bent met opnemen, reinigt u de perfusieslangen en de tip door gedeïoniseerd water door te spoelen om verstoppingen te voorkomen. De hier verkregen patchclamp-opnamen laten zien dat de wild-type BK-kanalen op een oocytenmembraanpatch reageren op zowel voltage als calcium. Deze figuur toont een patch-opname met nominaal nul calcium in de perfusie-oplossing.

De blokgolven boven de stroomsporen geven de spanning aan die op de patch is aangelegd. Er werden vier spanningen aangelegd, variërend van 50 millivolt tot 200 millivolt in stappen van 50 millivolt. De maximale stroom, ongeveer twee nano ampère, werd bereikt bij de maximale spanning van 200 millivolt.

Deze toename in stroomamplitude bij een stijgend voltage gaf aan dat de openingswaarschijnlijkheid van BK-kanalen toenam met het voltage. Deze figuur toont de respons van de inside-out patch op verschillende voltages. Er werden voltagesprongen toegepast terwijl er één micromol calcium in de perfusie-oplossing aanwezig was.

Zoals in de voorgaande figuur, bij de respons op de spanningsstap van 200 millivolt, nam de bovenste respons toe tot ongeveer drie nano amps wanneer er calcium aanwezig was in de Perfu eight, vergeleken met twee nano amps zonder calcium. Dit geeft aan dat de openingswaarschijnlijkheid van de BK-kanalen toenam in de aanwezigheid van calcium. Samenvattend toonde deze patchclamp-procedure aan dat de BK-kanalen spannings- en calciumafhankelijk waren.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de activatie van het ijzerkanaal kunt registreren met behulp van de patchclamptechniek in combinatie met een pro-fueling systeem. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.