Patch Clamp en perfusie technieken voor het bestuderen van Ion Channels Uitgedrukt in Xenopus Eicellen
10 januari 2011
Ionische stroom van BK kanalen wordt geregistreerd met behulp van patch-clamp technieken. BK kanalen worden uitgedrukt in Xenopus oöcyten Door het injecteren van boodschapper-RNA. De intracellulaire oplossing tijdens de patch clamp opnames wordt bestuurd door een perfusie-systeem.
Het algemene doel van deze procedure is om BK-kanaalactivering onder gecontroleerde spanning op te nemen, terwijl ook de intracellulaire oplossing wordt gecontroleerd. Dit wordt bereikt door eerst BK-kanalen in Xenopus-cyten tot expressie te brengen door ze te injecteren met BK-kanaal mRNA. De tweede stap van de procedure is om het perfusiesysteem voor te bereiden.
De derde stap van de procedure is om een giga-seal te vormen tussen de oöcytmembraan en de patch-pipet. De laatste stap van de procedure is om het membraanpatch te verwijderen. Uiteindelijk tonen de resultaten die zijn verkregen door patch-clamptechnologie gekoppeld aan een profusiesysteem aan dat BK-kanalen worden geactiveerd door veranderingen in spanning en calciumconcentratie.
Hallo, ik ben Jin Cho Young van Dr. Jamie Zus lab in Washington University. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van de neurowetenschappen te beantwoorden, inclusief vragen over de moleculaire mechanismen voor ionkanaalactivering. Dus laten we beginnen.
De eerste stap in de procedure begint een paar dagen voor het patch clampen en maakt gebruik van BK-kanaal mRNA dat in vitro is getranscribeerd. Na het oogsten van de Xenopus Lavu Cytes stage vijf tot zes, injecteer 0,05 tot 50 nanogram BK-kanaal mRNA in een cyte. Gebruik een nano inject two auto nanoliter injector.
Herhaal de injectie op een dozijn oöcyten voor elk mRNA na de injectie. Spoel de oöcyten twee keer met ND 96-oplossing. Plaats vervolgens de oöcyten in een kweekplaat en incubeer ze gedurende twee of meer dagen bij 18 graden Celsius om de oöcyten de tijd te geven om het BK-kanaal tot expressie te brengen.
Na twee tot vijf dagen incubatie zouden de oöcyten BK-kanalen moeten tot expressie brengen en zijn dus al klaar voor patch clampen. Voordat u de oöcyten behandelt, zet u alles wat u nodig heeft voor patch clampen op, beginnend met het perfusiesysteem. Het systeem dat hier wordt getoond, is de geautomatiseerde kleplink.
16 profusiesysteem onder druk staand stikstof duwt profusie-oplossingen uit de oplossingsreservoirs door de profusiebuizen en in de profusiepennetje en punt. De stroom van elke stroom profusie-oplossing wordt geregeld door één reservoirklep en één elektronische klep. In dit protocol is één van de reservoirs niet onder druk gezet en functioneert als afvalinzameelaar, evenals als drukontlastingsmechanisme.
Perfusie-oplossingen met verschillende concentraties calcium of magnesium kunnen vóór de experimenten worden bereid. Voeg de perfusie-oplossingen toe aan de reservoirs en label elk om de concentratie van calcium of magnesium aan te geven. Om het profusiesysteem op te zetten, verbindt u eerst de buizen met de profusiepennetje.
Schakel vervolgens de elektronische klepcontroller in en open de elektronische kleppen om ervoor te zorgen dat de buizen en de profusiepennetje vrij zijn van verstoppingen en luchtbellen. Duw gedeïoniseerd water door elke buis met behulp van een spuit gevuld met gedeïoniseerd water. Op dit punt verbindt u de buizen met de oplossingsreservoirs en opent u de klep van de gascilinder om druk op stikstof toe te passen.
Open een reservoirklep om de buis te vullen met een van de reservoiroplossingen. Indien nodig, klikt u op de reservoirklep om bellen in de oplossing te verwijderen. Sluit de reservoirklep nadat de buis is gevuld met oplossing, vul de perfusiepunt met water en schroef deze op de perfusiepen.
Zorg ervoor dat u geen luchtbellen vasthoudt. Wanneer u de punt aansluit, bevestig de profusiepennetje op de badfase met behulp van modelleerklei, zorg ervoor dat de profusiepunt in de badruimte is. Het profusiesysteem is nu ingesteld.
Op dit punt voegt u gedeïoniseerd water toe aan het bad. Zorg ervoor dat de profusiepunt ondergedompeld is in het water. Test of elke perfusieoplossing correct uit de perfusiepunt komt.
Sluit de elektronische klep die is aangesloten op de buis van de afvalinzameelaar en open de klep voor een van de profusieoplossingen. Observeer onder de microscoop de straal profusie-vloeistof die uit de perfusiepunt komt. Sluit de klep voor die profusieoplossing en open de klep voor de afvalinzameelaar.
De profusie-straal moet bijna verdwijnen. Herhaal dezelfde test voor elk van de perfusieoplossingen. Wanneer u hebt geverifieerd dat alle perfusieoplossingen correct stromen, vervangt u het gedeïoniseerd water in het bad door de gewenste badoplossing.
Nu is het tijd om het opnameapparaat in te stellen. U moet de zilveren opname-elektrode met zilverchloride coaten voor elke patch clamp-sessie. Verwijder eerst de elektrodedraad uit de pijphouder en dompel de punt helft van de elektrodedraad onder in een flesje met vers bleekmiddel gedurende ten minste 15 minuten.
Dit zet een laag zilverchloride op de draad af. Spoel de elektrodedraad met gedeïoniseerd water en droog af. Installeer vervolgens de zilver zilverchloride-elektrode terug in de pijphouder.
Schakel nu uw computer in. Sluit de hardwaresleutel aan op de printerpoort van uw computer. De hardwaresleutel moet zijn aangesloten om de data-acquisitiesoftware te kunnen gebruiken, die HEA pulse is.
Schakel de versterker in en start de data-acquisitiesoftware. HEA pulse. Laad het protocolbestand en pas de configuratie-instellingen aan, zoals de stimulusschaal.
Het doel voor het aanpassen van de configuratie-instellingen is om ervoor te zorgen dat het testpotentieel precies gelijk is aan het commandopotentieel. Nu zijn we klaar om de oöcyten voor te bereiden. Haal de oöcyten uit de incubator.
Dompel de oöcyt onder in stripoplossing gedurende vijf tot 10 minuten. De stripoplossing loskoppelt het veel membraan van het plasmamembraan, waardoor het mogelijk wordt om het veel membraan te strippen. Na vijf tot 10 minuten, verwijder voorzichtig het veel membraan van de oöcyt.
Gebruik twee pincetten. Een divi OC site is uiterst kwetsbaar en moet daarom zo min mogelijk worden verplaatst. Zorg ervoor dat de Devi oöcyt niet wordt blootgesteld aan lucht of bellen. Gebruik een glazen pijpje gevuld met
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft de procedure voor het opnemen van BK-kanaalactivering met behulp van patch clamp-technieken in Xenopus-eicellen. De methode omvat het tot expressie brengen van BK-kanalen door mRNA-injectie en het controleren van de intracellulaire oplossing met een perfusiesysteem.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Elektrofysiologie
- Cellulaire biologie
- Neurowetenschappen
Achtergrond
- BK-kanalen zijn calcium-geactiveerde kaliumkanalen met een grote geleidbaarheid.
- Het begrijpen van hun activering is cruciaal voor inzichten in neuronale signalering.
- Patch clamp-technieken maken nauwkeurige metingen van ionische stromen mogelijk.
- Xenopus-eicellen worden vaak gebruikt voor het tot expressie brengen van ionenkanalen vanwege hun grote omvang.
Doel van het onderzoek
- Om de activering van BK-kanalen onder gecontroleerde voltage-condities op te nemen.
- Om de effecten van voltage en calciumconcentratie op de activiteit van BK-kanalen te onderzoeken.
- Om een perfusiesysteem te gebruiken voor het handhaven van gecontroleerde intracellulaire omstandigheden.
Gebruikte methoden
- Injectie van BK-kanaal mRNA in Xenopus-eicellen.
- Voorbereiding van een perfusiesysteem voor de intracellulaire oplossing.
- Vorming van een giga seal tussen het eicelmembraan en de patch pipet.
- Excisie van het membraanpatch voor het opnemen van ionische stromen.
Belangrijkste resultaten
- BK-kanalen worden geactiveerd door veranderingen in voltage.
- Calciumconcentratie heeft ook invloed op de activering van BK-kanalen.
- Patch clamp-technologie neemt effectief ionische stromen van BK-kanalen op.
- Het perfusiesysteem maakt nauwkeurige controle van experimentele omstandigheden mogelijk.
Conclusies
- Het onderzoek toont met succes de activering van BK-kanalen met behulp van patch clamp-technieken.
- De resultaten geven inzicht in de rol van voltage en calcium bij kanaalactivering.
- Deze methodologie kan worden toegepast op verdere studies naar het gedrag van ionenkanalen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables precise interrogation of ion channel function under controlled voltage and intracellular conditions, supporting target validation in neuroscience and cardiovascular drug discovery. By isolating BK channel responses to pharmacological or genetic perturbations, it provides quantitative data for mechanistic de-risking of therapeutic hypotheses. The Xenopus oocyte expression system offers a scalable platform for early-stage assay development and lead optimization workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional validation of BK channel targets by measuring voltage- and calcium-dependent activation under controlled intracellular perfusion.
- Operational Value: Supports hypothesis testing through isolated membrane patches, reducing cellular complexity and improving signal-to-noise for target de-risking.
- Predictive Value: Generates dose-response relationships to ligands or mutants, informing structure-function relationships and lead selection criteria.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces stable, reproducible ion channel expression in oocytes, enabling standardized electrophysiological assays for compound screening.
- Quantitative Output: Delivers precise current measurements (e.g., nanoamp-scale) that correlate with channel open probability, supporting hit validation and SAR studies.
- Platform Reuse: Adaptable to other ion channels and receptors via mRNA substitution, increasing throughput across target families.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: BK channels are implicated in smooth muscle tone, neurotransmitter release, and neuronal excitability—key areas for CNS, cardiovascular, and urology indications.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes stem from direct channel modulation versus off-target effects, improving target confidence.
- Translational Continuity: Data from oocyte systems inform preclinical model selection and biomarker strategy for voltage- or calcium-sensing modalities.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to lead identification stages, providing functional confirmation after target identification and before medium-throughput screening campaigns.
- Discovery Biology: Tests therapeutic hypotheses by correlating channel activity with voltage/intracellular ligand conditions, supporting pathway validation.
- Screening: Enables secondary confirmation of primary hits via direct measurement of ion flux, improving hit-to-lead progression.
- Analytics: Generates quantitative current-voltage and dose-response relationships that inform potency, efficacy, and selectivity assessments.
- Translational Research: Supports biomarker alignment by linking channel function to physiological readouts relevant to indication biology.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiology capability for ion channel targets across multiple therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into ion channel gating, reducing ambiguity in target validation and improving predictive confidence.
- Operational Value: Standardizes perfusion and patch clamp procedures, enhancing reproducibility across laboratories and experimental batches.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by delivering direct functional data on target engagement, reducing late-stage attrition due to target misvalidation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of ion channel programs based on validated biophysical properties and ligand sensitivity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology (mRNA synthesis/injection), electrophysiology, and perfusion system setup.
- Depends on specialized instrumentation including patch clamp amplifiers, microinjectors, perfusion valves, and data acquisition software (e.g., HEA pulse).
- Necessitates standardization of oocyte preparation, incubation timing, and solution formulation across users and sites.
- Adaptation to alternative model systems (e.g., mammalian cells) may require optimization of expression and sealing efficiency.
- Practical limitations include oocyte variability, seal stability, and perfusion solution exchange kinetics, which must be controlled for data integrity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:45
Introduction
1:10
Injecting mRNA into Oocytes
4:26
Preparing the Ag/AgCl Wire and the Data Acquisition Equipment
1:51
Preparing the Perfusion System
5:33
Stripping the Vitelline Membrane from the Oocyte
6:14
Preparing the Patch Pipettes
7:06
Obtaining an Inside-Out Patch
8:08
Patch Clamping
8:41
Recording of Wild-Type BK Channels on and Oocyte Membrane Patch
9:57
Conclusion
