Name: Patch Clamp en perfusie technieken voor het bestuderen van Ion Channels Uitgedrukt in Xenopus Eicellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-10T18:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Leer patch clamp en perfusie technieken voor het bestuderen van BK-kanaalactivatie in Xenopus oöcyten. Deze methode maakt nauwkeurige metingen van ionstromen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health beurzen R01-R01-HL70393 en NS060706 naar JCJC is een hoogleraar Biomedische Technologie aan de Spencer T. Olin Endowment.

1. Injectie van mRNA in Eicellen <ol><li> Injecteer 0,05 tot 50 ng boodschapper-RNA, dat was in vitro overgeschreven in Xenopus laevis oöcyten (fase V-VI) met behulp van Nanoject II Auto-Injector nanoliter (Drummond Scientific Company, model 3-000-204). Herhaal de injectie op een tiental eicellen voor elke mRNA. </li><li> Spoel de geïnjecteerde eicellen twee keer met behulp van ND-96 oplossing (96 mM natriumchloride (NaCl, de heer 58,44 g / mol), 2 mM kaliumchloride (KCl, de heer 74,56 g / mol), 1,8 mM calciumchloride (CaCl 2 • 2H 2 O , de heer 147,02), 1 mM magnesiumchloride (MgCl 2 • 6H 2 O, de heer 203,31 g / mol), 5 mM 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic zuur (HEPES, de heer 238,31 g / mol), 2,5 mM natriumpyruvaat (de heer 110,04 g / mol), en 1x penicilline-streptomycine. pH 7,6), en plaats ze in een cultuur plaat en incubeer bij 18 ° C gedurende 2 + dag. </li></ol> 2. De voorbereiding van de perfusie-systeem <img src="/files/ftp_upload/2269/2269fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Illustratie van de Automatiseer ValveLink 16 perfusie-systeem. Het systeem maakt gebruik van perfusie druk stikstof aan bloedtransfusie-oplossingen duwen van de oplossing reservoirs, door de perfusieslangen, en om de perfusie potlood en fooi. De stroom van elke stroom van perfusie-oplossing wordt gecontroleerd door een reservoir klep en een elektronische klep. In dit protocol, een van de reservoirs is niet onder druk en fungeert als een ophaler en een druk-release mechanisme. (Foto overgenomen uit de website van de leverancier van http://www.autom8.com) <ol><li> Sluit de leidingen naar de perfusie potlood. Zet op de elektronische afsluiterbesturing en open de elektronische kleppen. </li><li> Om te verzekeren dat de leidingen en de perfusie potlood zijn vrij van verstoppen en luchtbellen, push gedeïoniseerd (DI) water door elke slang met behulp van een injectiespuit gevuld met gedemineraliseerd water. </li><li> Sluit de leidingen aan de oplossing reservoirs en open de kraan van de gasfles naar onder druk stikstof toe te passen. </li><li> Open het reservoir klep om de slang te vullen met reservoir oplossing. Flick het reservoir zodat de bellen te verwijderen in de oplossing als dat nodig is. Sluit de klep nadat de slang is gevuld met de oplossing. </li><li> Vul de perfusie tip met water en schroef deze op de perfusie potlood. Wees voorzichtig dat er geen luchtbellen val bij het aansluiten van de tip. </li><li> Bevestig de perfusie potlood om het bad podium met behulp van boetseerklei. Zorg ervoor dat de perfusie tip is in het bad ruimte. De perfusie-systeem is nu ingesteld. </li><li> Voeg DI water in het bad. Zorg ervoor dat de doorbloeding tip is ondergedompeld in het water. </li><li> Test dat elke perfusie oplossing komt op de juiste wijze van de perfusie tip. Sluit de elektronische kraan aangesloten op de buizen van afvalinzamelaar en open de afsluiter voor een perfusie-oplossing in een tijd (140 mM kaliumhydroxide (KOH, M r 56,1 g / mol), 20 mM 4 - (2-hydroxyethyl) -1 - piperazineethanesulfonic zuur (HEPES, M r 238,31 g / mol), 2 mM kaliumchloride (KCl, M r 74,56 g / mol), 1 mM Ethyleen glycol-bis (2-aminoethylether)-N, N, N ', N'- tetra-azijnzuur (EGTA, M r 380,35 g / mol), wordt de pH ingesteld op 7.1-7.2 door methaansulfonzuur (meso 3, M r 96,1 g / mol), Ca 2 + of Mg 2 + wordt toegevoegd om de gewenste concentratie als dat nodig is). Onder de microscoop, houden aan de straal van de perfusie vloeistof die uit de perfusie tip. Sluit de klep voor perfusie-oplossing en open de klep voor de afvalinzamelaar. De perfusie straal moet bijna verdwijnen. Herhaal dezelfde test voor alle bloedtransfusie-oplossingen. </li><li> Wanneer u dat alle bloedtransfusie-oplossingen stroom goed gecontroleerd, vervangen DI water in het bad met een bad-oplossing (140 mM kaliumhydroxide (KOH, M r 56,1 g / mol), 20 mM 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic zuur (HEPES, M r 238,31 g / mol), 2 mM kaliumchloride (KCl, M r 74,56 g / mol), wordt de pH ingesteld op 7.1-7.2 door methaansulfonzuur (meso 3, M r 96,1 g / mol)). </li></ol> 3. Patch Spannen <ol><li> Overschildertijd de Ag opname elektrode met AgCl voor elke patch klemmen sessie. Verwijder eerst de elektrode draad van de pipet houder en dompel de punt de helft van de elektrode draad in een flacon met verse bleekwater gedurende tenminste 15 minuten. Deze deposito's een laagje AgCl op de draad. </li><li> Spoel de elektrode draad met gedeïoniseerd water en dep droog. Vervolgens installeert u de Ag / AgCl elektrode in de pipet houder. </li><li> Sluit het bad (referentie) elektrode naar de headstage en plaats het in het bad. Dit bereidt de elektroden voor opname. </li><li> Nu voor te bereiden op data-acquisitie. Zet de computer aan en steek de hardware sleutel in de printer-poort van uw computer. De hardware sleutel moet worden aangesloten voor u om de data-acquisitie software, die is HEKA puls te gebruiken. </li><li> Schakelaar op de versterker (Axon Instruments, AXOPATCH 200B) en start HEKA Pulse. Laad het protocol bestand en pas de configuratie-instellingen, zoals de Stimulus Scale. Het doel voor het aanpassen van de configuratie-instellingen is om te verzekeren dat de test potentieel is precies gelijk aan het commando potentieel. Dit bereidt de data-acquisitie apparatuur. </li><li> Bereid eicellen. Dompel de eicel in stripoplossing (200 mM N-Methyl-D-glucamine (NMG, M r 195,22 g / mol), 200 mM Aspartaat (geen K +) (M r 133,1 g / mol), 2 mM kaliumchloride (KCl , M r 74,56 g / mol), 10 mM Ethyleen glycol-bis (2-aminoethylether)-N, N, N ', N'-tetra-azijnzuur (EGTA, M r 380,35 g / mol), 1 mM magnesiumchloride (MgCl 2 • 6H 2 O, M r 203,31 g / mol), 10 mM 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic zuur (HEPES, M r 238,31 g / mol), wordt de pH ingesteld op 7,4 door natriumhydroxide (NaOH, M r 40,0 g / mol) gedurende 5 - 10. min De stripoplossing los van de vitelline membraan van de plasmamembraan die het mogelijk maakt om strip de vitelline membraan. </li><li> Voorzichtig strip de vitelline membraan van de eicel gebruik van twee paar pincetten. Een devitellinized eicel is uiterst fragiel en moeten daarom worden verplaatst zo weinig als dat nodig is. </li><li> De zorg om te voorkomen dat het blootstellen van de devitellinized eicel aan lucht of bellen, gebruik dan een glazen pipet gevuld met voldoende oplossing om de eicel te dragen aan het bad. Dit bereidt de eicel voor opname. </li><li> Bereid patch pipetten. Trek de glazen pipetten na het plaatsen van een glazen capillaire buis (VWR International, Cat # 53,432 tot 921) in een Sutter P-97 Flaming / Brown Micropipet Puller. Neem de pipetten onder de microscoop naar de tip vorm en opening met een diameter te bepalen. De opening met een diameter moet worden 2-4 micrometer. </li><li> Om capacitieve stroom te verminderen tijdens het opnemen en een soepele tip, de vacht van de tip met was te verzekeren en vervolgens brand-polijsten. </li><li> Vul de pipet tip door de punt van de pipet in de pipet-oplossing (140 mM kaliumhydroxide (KOH, M r 56,1 g / mol), 20 mM 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic zuur (HEPES, M r 238,31 g / mol), 2 mM kaliumchloride (KCl, M r 74,56 g / mol), 2 mM magnesiumchloride (MgCl 2 • 6H 2 O, M r 203,31 g / mol), wordt de pH ingesteld op 7.1-7.2 door methaansulfonzuur zuur (meso 3, M r 96,1 g / mol)) en het trekken van de zuiger. Dit nat van de tip. </li><li> Vul pipet 1 / 3 vol met pipet oplossing met behulp van een injectiespuit en plaats de pipet in de pipet houder met de Ag / AgCl elektrode in en contact met de pipet oplossing. Dit bereidt de patch pipet. </li><li> Aan accijnzen een inside-out patch uit de voorbereide eicel, vinden de duidelijke rand van de eicel onder de microscoop. Verplaats de patch pipet de buurt van de eicel met behulp van manipulator. Noteer het serienummer weerstand van de pipet. De ideale serie weerstand van de patch pipet is tussen 1-1,5 MΩ bij gevuld met pipet oplossing en ondergedompeld in bad oplossing. </li><li> Langzaam duw de pipet tegen de eicel tot aan de weerstand van ongeveer verdubbelt. </li><li> Zachtjes zuigkracht aan het membraan via de mond door middel van een zuig-buis die is verbonden met de pipet houder tot een giga-ohm afdichting wordt verkregen. Het stabiliseren van de patch en houd het op spanning -30 mV voor een paar minuten. </li><li> Voor het verkrijgen van een inside-out patch, accijnzen de patch door snel druk op de pipet verder in de eicel en vervolgens voorzichtig naar buiten te trekken. </li><li> De inside-out patch is nu klaar voor het vastzetten. Verplaats de pipet die de inside-out patch tot ongeveer 100 micron uit de buurt van de opening van de perfusie tip. </li><li> Sluit de klep voor elektronisch afval verzamelen en open de klep reservoir voor de gewenste perfusie-oplossing </li><li> Beginnen met het opnemen stromingen over de patch. Verander de spanning en perfusie-oplossingen zoals gewenst. </li><li> Wanneer u klaar bent met opnemen, het reinigen van de perfusieslangen, potlood en tip door te drukken door middel van gedeïoniseerd water om klompen te voorkomen. </li></ol> 4. Representatieve resultaten Tijdens de voorbereiding van eicellen voor patch clamp, de 5-10 minuten behandeling van strippen oplossing zou het vitelline membraan los te maken van de plasma membraan, die het mogelijk maakt het strippen van de vitelline membraan. De ideale serie weerstand van de patch pipet is tussen 1-1,5 MΩ bij gevuld met pipet oplossing en ondergedompeld in bad oplossing. Hieronder vindt u een representatief opname van wild-type BK kanalen op een eicel membraan patch. Aan de linkerkant boven, de vierkante golven geven de spanning op de patch - de tweede stap van de spanning neemt toe van 50 mV tot 200 mV met een toename van 50 mV. Hieronder vindt u de bijbehorende stroom sporen als de perfusie-oplossing nominale 0 Ca 2 + (gratis [Ca 2 +] is ongeveer 0,5 nM) heeft. Het inplooi van de huidige amplitude geeft aan dat de open kans op BK kanalen neemt toe met de spanning. Aan de rechterkant, is dezelfde pleister geperfuseerd met 1,0 uM Ca 2 + bij toepassing met dezelfde spanning protocol. De huidige amplitude neemt meer onder dezelfde spanning, wat aangeeft dat de open kans neemt toe met de [Ca 2 +]. <img src="/files/ftp_upload/2269/2269fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2">

<ol><li>Methfessel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+measurements+on+Xenopus+laevis+oocytes%3A+currents+through+endogenous+channels+and+implanted+acetylcholine+receptor+and+sodium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Arch%22%5BJournal%5D)">Patch clamp measurements on Xenopus laevis oocytes: currents through endogenous channels and implanted acetylcholine receptor and sodium channels.</a> Pflügers Arch. 407, 577-588 (1986).</li>
<li>Toro, L., Wallner, M., Meera, P., Tanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maxi-K+%28Ca%29%2C+Unique+Member+of+the+Voltage-Gated+K+Channel+Superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22News+Physiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Maxi-K (Ca), Unique Member of the Voltage-Gated K Channel Superfamily.</a> News Physiol. Sci. 13, 112-117 (1998).</li>
<li>Fettiplace, R., Fuchs, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+hair+cell+tuning%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of hair cell tuning.</a> Annu. Rev. Physiol. 61, 809-834 (1999).</li>
<li>Du, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-sensitive+potassium+channelopathy+in+human+epilepsy+and+paroxysmal+movement+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Calcium-sensitive potassium channelopathy in human epilepsy and paroxysmal movement disorder.</a> Nat. Genet. 37, 733-738 (2005).</li>
<li>Ledoux, J., Werner, M. E., Brayden, J. E., Nelson, M. T., T, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-activated+potassium+channels+and+the+regulation+of+vascular+tone%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Calcium-activated potassium channels and the regulation of vascular tone.</a> Physiology (Bethesda). 21, 69-78 (2006).</li>
<li>Salkoff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-conductance+potassium+channels+of+the+SLO+family%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">High-conductance potassium channels of the SLO family.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 921-931 (2006).</li>
<li>Shi, J., Cui, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Mg2%2B+enhances+the+function+of+BK-type+Ca2%2B-activated+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular Mg2+ enhances the function of BK-type Ca2+-activated K+ channels.</a> J. Gen. Physiol. 118, 589-606 (2001).</li>
<li>Magleby, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gating+mechanism+of+BK+%28Slo1%29+channels%3A+so+near%2C+yet+so+far%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Gating mechanism of BK (Slo1) channels: so near, yet so far.</a> J. Gen. Physiol. 121, 81-96 (2003).</li>
<li>Latorre, R., Brauchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+conductance+Ca2%2B-activated+K%2B+%28BK%29+channel%3A+activation+by+Ca2%2B+and+voltage%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Res%22%5BJournal%5D)">Large conductance Ca2+-activated K+ (BK) channel: activation by Ca2+ and voltage.</a> Biol. Res. 39, 385-401 (2006).</li>
<li>Cox, D. H., Cui, J., Aldrich, R. W., W, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+gating+of+a+large+conductance+Ca-activated+K%2B+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Allosteric gating of a large conductance Ca-activated K+ channel.</a> J. Gen. Physiol. 110, 257-281 (1997).</li>
<li>Cui, J., Aldrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+linkage+between+voltage+and+Ca2%2B-dependent+activation+of+BK-type+mslo1%5BTitle%5D)+AND+%22K%2B+channels.+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Allosteric linkage between voltage and Ca2+-dependent activation of BK-type mslo1.</a> K+ channels. Biochemistry. 39, 15612-15619 (2000).</li>
<li>Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+Slo1+BK+channels+by+Mg2%2B+coordinated+between+the+voltage+sensor+and+RCK1%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Activation of Slo1 BK channels by Mg2+ coordinated between the voltage sensor and RCK1.</a> 15, 1152-1159 (2008).</li>
<li>Lee, U. S., Cui, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%7Bbeta%7D+subunit-specific+modulations+of+BK+channel+function+by+a+mutation+associated+with+epilepsy+and+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">{beta} subunit-specific modulations of BK channel function by a mutation associated with epilepsy and dyskinesia.</a> J. Physiol. , 587-1481 (2009).</li>
</ol>

De eicel uitdrukking systeem is ideaal voor elektrofysiologische karakterisatie van voltage-afhankelijke ionkanalen wegens het relatief lage achtergrond van endogene kanalen. Bovendien, omdat het een transiënte expressie systeem, biedt een efficiënte methode voor het uitvoeren van mutagenese studie van deze kanalen. Toch moet worden opgemerkt dat de eicel expressie systeem verschilt van die in zoogdiercellen, waardoor er verschillen kunnen zijn in de post-translationele modificatie en vereniging met verschillende subeen...

<table><tbody><tr><td>Nanoject II Auto-Nanoliter Injector</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Perfusiessysteem en elektronische controller</td><td>AutoMate Scientific, Inc.</td><td>ValveLink 16</td><td>Binnendiameter van perfusietip: 100 microns</td></tr><tr><td>Omgekeerde microscoop</td><td>Olympus Corporation</td><td>CKX31</td><td></td></tr><tr><td>Glazen pipetten</td><td>VWR international</td><td>53432-921</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Versterker</td><td>Axon Instruments</td><td>AXOPATCH 200B</td><td></td></tr><tr><td>Computerinterface</td><td>INSTRUTECH Corporation</td><td>ITC-18</td><td></td></tr><tr><td>Headstage</td><td>Axon Instruments</td><td>CV 203BU</td><td></td></tr></tbody></table>

patch clamp en perfusie technieken voor het bestuderen van ion channels uitgedrukt in xenopus eicellen

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Het protocol hier gepresenteerde is ontworpen om de activering van de grote geleiding, spanning-en Ca 2 +-geactiveerde K + (BK) kanalen te bestuderen. Het protocol kan ook worden gebruikt om de structuur-functie relatie van andere ionkanalen en neurotransmitter-receptoren een studie. BK-kanalen worden op grote schaal, uitgedrukt in verschillende weefsels en zijn betrokken bij tal van fysiologische functies, inclusief de regulering van gladde spiercontractie, frequentie tuning van binnenste haarcellen en de regulatie van neurotransmitters 2-6. BK kanalen worden geactiveerd door membraan depolarisatie en door intracellulaire Ca 2 + en Mg 2 + 6-9. Daarom is het protocol ontworpen om zowel het membraan spanning en het intracellulaire oplossing te controleren. In dit protocol wordt boodschapper-RNA van de BK-kanalen geïnjecteerd in Xenopus laevis oöcyten (fase V-VI), gevolgd door 2-5 dagen incubatie bij 18 ° C 10-13. Membraan patches die een of meerdere BK kanalen bevatten, zijn uitgesneden met de &#39;inside-out configuratie met behulp van patch-clamp technieken 10-13. De intracellulaire kant van de pleister is geperfuseerd met gewenste oplossingen tijdens de opname, zodat het kanaal activatie onder verschillende omstandigheden kunnen worden onderzocht. Samen te vatten, is het mRNA van BK-kanalen geïnjecteerd in Xenopus laevis oöcyten op kanaal eiwitten te uiten over de eicel membraan; patch clamp technieken worden gebruikt om de stromen door de kanalen onder gecontroleerde spanning en intracellulaire oplossingen op te nemen.

Ionische stroom van BK kanalen wordt geregistreerd met behulp van patch-clamp technieken. BK kanalen worden uitgedrukt in<em&gt; Xenopus oöcyten</em&gt; Door het injecteren van boodschapper-RNA. De intracellulaire oplossing tijdens de patch clamp opnames wordt bestuurd door een perfusie-systeem.

Patch Clamp en perfusie technieken voor het bestuderen van Ion Channels Uitgedrukt in Xenopus Eicellen

Het hier gepresenteerde protocol is ontworpen om de activatie van de groot-conductance, voltage- en Ca2+-geactiveerde K+ (BK)-kanalen te bestuderen. Het protocol kan ...

Het algemene doel van deze procedure is om de activering van BK-kanalen vast te leggen onder een gecontroleerde spanning, terwijl tegelijkertijd de intracellulaire oplossing wordt beheerst. Dit wordt bereikt door eerst BK-kanalen tot expressie te brengen in Xenopus-ocyten door deze te injecteren met BK-kanaal mRNA. De tweede stap van de procedure is het voorbereiden van het perfusiesysteem.De derde stap van de procedure is het vormen van een giga-seal tussen het oocytenmembraan en de patchpipet. De laatste stap van de procedure is het uitsnijden van het membraanpatch. Uiteindelijk tonen resultaten verkregen via patchclamp-technologie gekoppeld aan een perfusiesysteem aan dat BK-kanalen worden geactiveerd door veranderingen in voltage en calciumconcentratie.Hoi, ik ben Jin Cho Young van het laboratorium van Dr. Jamie Zus aan de Washington University. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de neurowetenschappen, waaronder vragen over het moleculaire mechanisme voor de activatie van ionkanalen. Laten we beginnen.De eerste stap in de procedure begint enkele dagen voor de patch clamping en maakt gebruik van BK-kanaal mRNA dat in vitro is getranscribeerd. Injecteer na het oogsten van Xenopus Lavu Cytes stadium vijf tot zes 0,05 tot 50 nanogram BK-kanaal mRNA in een cyte. Gebruik hiervoor een nano inject two auto nanoliter injector.Herhaal de injectie bij een dozijn oocyten voor elk mRNA na de injectie. Spoel de oocyten twee keer met ND 96-oplossing. Plaats de oocyten vervolgens in een kweekplaat en incubeer ze bij 18 °C gedurende twee of meer dagen om de oocyten de tijd te geven het BK-kanaal tot expressie te brengen.Na twee tot vijf dagen incubatie zouden de oocyten BK-kanalen moeten tot expressie brengen en zijn ze klaar voor patchklemmen. Voordat u de oocyten hanteert, stelt u alles klaar wat u verder nodig heeft voor het patchklemmen, beginnend met het perfusiesysteem. Het hier getoonde systeem is de automate valve link.Gedrukte stikstof van het 16 profusion-systeem duwt de profusion-oplossingen uit de oplossingreservoirs via de profusion-slangen naar de profusion-pen en -tip. De stroom van elke stroom profusion-oplossing wordt geregeld door één reservoirklep en één elektronische klep. In dit protocol wordt een van de reservoirs niet onder druk gezet en fungeert dit als afvalopvanger, evenals als drukontlastingsmechanisme.Perfusie-oplossingen met verschillende concentraties calcium of magnesium kunnen voorafgaand aan de experimenten worden bereid. Voeg de perfusie-oplossingen toe aan de reservoirs en label elk reservoir om de concentratie calcium of magnesium aan te geven. Om het perfusiesysteem op te stellen, sluit u eerst de slangetjes aan op het perfusiepotlood.Zet vervolgens de elektronische klepcontroller aan en open de elektronische kleppen om er zeker van te zijn dat de slangetjes en het profusiepenseel vrij zijn van verstoppingen en luchtbellen. Duw met een spuit gevuld met gedeïoniseerd water gedeïoniseerd water door elk slangetje. Sluit op dit punt de slangetjes aan op de oplossingsreservoirs en open de klep van de gascilinder om stikstof onder druk toe te dienen.Open één reservoirklep om de slang te vullen met een van de reservoiroplossingen. Klik indien nodig op de reservoirklep om luchtbellen uit de oplossing te verwijderen. Sluit de reservoirklep nadat de slang is gevuld met de oplossing, vul de perfusietip met water en schroef deze op het perfusiepotlood.Zorg ervoor dat er geen luchtbellen ingesloten raken. Bevestig bij het aansluiten van de tip de perfusiepen aan de badtafel met boetseerklei en controleer of de perfusietip zich in de badruimte bevindt. Het perfusiesysteem is nu geïnstalleerd.Voeg op dit punt gedeïoniseerd water toe aan het bad. Zorg ervoor dat de perfusietip ondergedompeld is in het water. Controleer of elke perfusieoplossing correct uit de perfusietip komt.Sluit de elektronische klep die is verbonden met de slang van de afvalopvang en open de klep voor een van de perfusie-oplossingen. Observeer onder de microscoop de straal perfusievloeistof die uit de perfusietip komt. Sluit de klep voor die perfusie-oplossing en open de klep voor de afvalopvang.De perfusiestroom zou bijna moeten verdwijnen. Herhaal dezelfde test voor elk van de perfusieoplossingen. Wanneer u heeft geverifieerd dat alle perfusieoplossingen correct stromen, vervangt u het gedeioniseerde water in het bad door de gewenste badoplossing.Nu is het tijd om de opnameapparatuur klaar te zetten. De zilveren registratie-elektrode moet vóór elke patchclamp-sessie opnieuw worden gecoat met zilverchloride. Verwijder eerst de elektrodedraad uit de pipethouder en dompel het onderste deel van de elektrodedraad gedurende ten minste 15 minuten onder in een flesje met verse bleek.Hiermee wordt een laag zilverchloride op de draad afgezet. Spoel de elektrodedraad met gedeïoniseerd water en dep deze droog. Plaats vervolgens de zilver-zilverchloride-elektrode terug in de pipethouder.Zet nu uw computer aan. Sluit de hardware-sleutel aan op de printerpoort van uw computer. De hardware-sleutel moet zijn aangesloten om de software voor gegevensverwerving, HEA pulse, te kunnen gebruiken.Zet de versterker aan en start de software voor gegevensverwerving. HEA-puls. Laad het protocolbestand en pas de configuratie-instellingen aan, zoals de stimulusschaal.Het doel van het aanpassen van de configuratie-instellingen is om te garanderen dat het testpotentiaal exact gelijk is aan het commandeerpotentiaal. Nu zijn we klaar om de oocyten voor te bereiden. Haal de oocyten uit de incubator.Dompel de oocyten gedurende vijf tot 10 minuten onder in de stripping-oplossing. De stripping-oplossing laat het vitelline membraan los van het plasmamembraan, waardoor het mogelijk wordt om het vitelline membraan te verwijderen. Stripp na vijf tot 10 minuten voorzichtig het vitelline membraan van de oocyten.Gebruik twee pincetten. Een divi OC-locatie is uiterst fragiel en mag daarom zo min mogelijk worden verplaatst. Zorg ervoor dat de Devi-oöcyt niet wordt blootgesteld aan lucht of bellen en gebruik een glaspipet gevuld met voldoende oplossing om de oöcyt naar het bad over te brengen.De kanalen op het oocytmembraan zijn nu blootgesteld en gereed voor de patchpipet. Trek een patchpipet door een glazen capillaire buis in de micropipettentrekker te plaatsen. Observeer de pipetten onder een microscoop om de vorm van de tip en de diameter van de opening te bepalen.De openingsdiameter moet twee tot vier micrometer zijn om de capacitieve stroom tijdens de opname te verminderen; om een gladde punt te verkrijgen, wordt de punt met was gecoat en vervolgens verhit. Polijst de punt onder een microscoop. Vul de pipetpunt door de punt van de pipet in de pipetoplossing te plaatsen en de zuiger naar achteren te trekken.Hiermee wordt de punt van de pipet bevochtigd. Vul de pipet vervolgens voor een derde met pipetoplossing met behulp van een spuit. Plaats de pipet daarna in de pipethouder met de zilver-zilverchloride-elektrode erin.Zorg ervoor dat de draadelektrode in contact staat met de pipetvloeistof. De volgende stap is het uitsnijden van een inside-out patch uit de geprepareerde oocyten. Zoek eerst de heldere rand van de oocyt op onder de microscoop.Beweeg met de manipulator de patchpipet dicht bij de oocyten en zorg dat deze ondergedompeld is. Meet in de badoplossing de serieweerstand van de pipet. De ideale serieweerstand van de patchpipet ligt tussen 1 en 1,5 mΩ wanneer deze is gevuld met pipetoplossing en is ondergedompeld in de badoplossing.Duw de pipet nu langzaam tegen de oocyte aan totdat de weerstand ongeveer verdubbelt. Creëer een giga-ohm seal door voorzichtig met de mond te zuigen via een zuigbuis die is verbonden met de pipethouder. Nadat is bevestigd dat er een giga seal is gevormd, wordt de patch gestabiliseerd door deze gedurende enkele minuten op minus 30 millivolt te houden.Om een inside-out patch te verkrijgen, exciseert u de patch door de pipet snel verder in de OO-site te duwen en deze vervolgens voorzichtig terug te trekken. De inside-out patch is nu klaar voor patchclamping. Verplaats de pipet met de inside-out patch tot ongeveer 100 microns afstand van de opening van de perfusietip.Sluit de elektronische klep voor afvalverzameling en open de reservoirklep voor de gewenste perfusie-oplossing. Begin met het registreren van de stromen over de patch. Wijzig de spanning en de perfusie-oplossingen naar wens.Wanneer u klaar bent met opnemen, reinigt u de perfusieslangen en de tip door gedeïoniseerd water door te spoelen om verstoppingen te voorkomen. De hier verkregen patchclamp-opnamen laten zien dat de wild-type BK-kanalen op een oocytenmembraanpatch reageren op zowel voltage als calcium. Deze figuur toont een patch-opname met nominaal nul calcium in de perfusie-oplossing.De blokgolven boven de stroomsporen geven de spanning aan die op de patch is aangelegd. Er werden vier spanningen aangelegd, variërend van 50 millivolt tot 200 millivolt in stappen van 50 millivolt. De maximale stroom, ongeveer twee nano ampère, werd bereikt bij de maximale spanning van 200 millivolt.Deze toename in stroomamplitude bij een stijgend voltage gaf aan dat de openingswaarschijnlijkheid van BK-kanalen toenam met het voltage. Deze figuur toont de respons van de inside-out patch op verschillende voltages. Er werden voltagesprongen toegepast terwijl er één micromol calcium in de perfusie-oplossing aanwezig was.Zoals in de voorgaande figuur, bij de respons op de spanningsstap van 200 millivolt, nam de bovenste respons toe tot ongeveer drie nano amps wanneer er calcium aanwezig was in de Perfu eight, vergeleken met twee nano amps zonder calcium. Dit geeft aan dat de openingswaarschijnlijkheid van de BK-kanalen toenam in de aanwezigheid van calcium. Samenvattend toonde deze patchclamp-procedure aan dat de BK-kanalen spannings- en calciumafhankelijk waren.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de activatie van het ijzerkanaal kunt registreren met behulp van de patchclamptechniek in combinatie met een pro-fueling systeem. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

patch-clamp-perfusion-techniques-for-studying-ion-channels-expressed

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit is bedoeld als een kennismaking met klem opnemen patch van Xenopus laevis oöcyten. Het omvat vitelline membraan verwijderen, de vorming van een gigaohm afdichting (gigaseal), en de optionele conversie van de patch naar buiten-out topologie.

Patch Clamp Opname van ionenkanalen Uitgedrukt in Xenopus Eicellen

We zullen zien hoe het effect van een enkele puntmutatie op de functie van een ionkanaal studie.

Mutagenese en Functionele analyse van ionenkanalen heteroloog Uitgedrukt in zoogdiercellen

Geoptimaliseerd transfectie strategie voor Expressie en elektrofysiologische opname van recombinant voltage-gated ion kanalen in HEK-293T cellen

We beschrijven een methode om de activiteit van K+-countertransporterende P-type ATPasen te kwantificeren door heterologe expressie van de enzymen in Xenopus oöcyten en het meten van Rb+ of Li+ opname in individuele cellen door middel van atomaire absorptie spectrofotometrie. De methode is een gevoelige en veilige alternatief voor radio-isotoop flux experimenten waardoor complexe kinetische studies worden vergemakkelijkt.

Meten kationtransport van Na, K en H, K-ATPase in<em&gt; Xenopus</em&gt; Eicellen door atomaire absorptiespectrometrie: Een alternatief voor Radio-isotopen Assays

Ter aanvulling gebruikte methoden bestuderen TRPV4's worden twee methoden beschreven: De mechanische gevoeligheid kan worden bestudeerd door Ca 2 +-aequorine luminometrie in transgene gist bij hypo-osmotische uitdaging. Het kan ook in TRPV4-RNA worden onderzocht geïnjecteerd Xenopus oöcyten door whole-cell twee-elektrode voltage clamp of patch klem in op cel-of uitgeschakelde modus.

Gist luminometrische en Xenopus Eicel Elektrofysiologische Examens van de Moleculaire mechanische gevoeligheid van TRPV4

De opengesneden Vaseline gap benadering wordt gebruikt om lage ruis opnames van ionische en gating stromen van spanningsafhankelijke ionkanalen uitgedrukt in Xenopus oöcyten met een hoge resolutie van snelle kanaal kinetiek verkrijgen. Met kleine wijzigingen, kunnen spanningsklem fluorimetrie worden gekoppeld aan de opengesneden eicel protocol.

De<em&gt; Xenopus</em&gt; Eicel opengesneden Vaseline Gap voltage-clamp techniek Met fluorometrie

Hier beschreven is een procedure voor het verkrijgen van lange stukken huidige opname van een ionkanaal met de cel-bijgevoegde patch-clamp techniek. Deze methode maakt het mogelijk voor het observeren, in real time, het patroon van open-close kanaal conformaties dat de biologische signaal ten grondslag liggen. Deze gegevens informeren over kanaal woningen in ongestoord biologische membranen.

Eenkanaals-Cell bevestigd Patch-clamp-opname

Geoptimaliseerde procedures voor de isolatie van enkele follikels, cytoplasmatische RNA-microinjecties, het verwijderen van omliggende cellagen en eiwitexpressie in Xenopus eicellen worden beschreven. Daarnaast wordt een eenvoudige methode gepresenteerd voor snelle oplossingsveranderingen in elektrofysiologische experimenten met ligand-gebonden ionenkanalen.

Xenopus Eicellen: Geoptimaliseerd Methoden voor Micro-injectie, Verwijdering van folliculaire Lagen en Fast Solution Veranderingen in elektrofysiologische experimenten

Dit artikel beschrijft een versterking van conventionele Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) waar Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) worden gebruikt in plaats van maleimide kleurstoffen, om structurele herrangschikkingen in ionenkanalen te onderzoeken. De procedure omvat Xenopus oocyt DNA injectie, RNA / fUAA coinjection, en gelijktijdige stroom en fluorescentie metingen.

Spanningsklem Fluorometrie in<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocyten Met Fluorescerende Onnatuurlijke Aminozuren

Hier presenteren we een protocol om gap junction-eiwitten in Xenopus-eicellen tot expressie te brengen en junctionele stroom tussen twee geapofesteerde eicellen te registreren met behulp van een commerciële versterker die is ontworpen voor dubbele oöcytspanningsklemopnamen in een hoge zijstroommeetmodus.

Opname gap junction stroom van Xenopus Oocyten

Leer patch clamp en perfusie technieken voor het bestuderen van BK-kanaalactivatie in Xenopus oöcyten. Deze methode maakt nauwkeurige metingen van ionstromen mogelijk.

Patch Clamp en perfusie technieken voor het bestuderen van Ion Channels Uitgedrukt in Xenopus Eicellen

Meer video's verkennen