Het kwantificeren van Synapsen: een immunocytochemie-gebaseerde test te Synapse Number Kwantificeer
November 16th, 2010
Dit protocol beschrijft hoe u synaps nummer zowel in gedissocieerde neuronale cultuur en in de hersenen secties met behulp van immunocytochemie kwantificeren. Met behulp van vak-specifieke antilichamen, we label presynaptische terminals alsmede ten aanzien sites van postsynaptische specialisatie. We definiëren synapsen als punten van colocalization tussen de signalen die door deze markers.
Een van de belangrijkste doelen in de neurowetenschappen is het begrijpen van de moleculaire signalen die de vroege stadia van synapsvorming aansturen. Daarom is het van cruciaal belang om objectieve benaderingen te ontwikkelen om veranderingen in synaptische connectiviteit te kwantificeren. Om het aantal synapsen in verschillende experimentele preparaten te kwantificeren, worden gekweekte neuronen of cryosecties van hersenweefsel gekleurd met selectieve pre- en postsynaptische markers om punten van synaptische contact tussen neuronen te labelen.
De cellen of het weefsel worden vervolgens geïmagerd op een fluorescente microscoop en achtbitbeelden die vereist zijn voor elk van de kanalen die overeenkomen met de twee immunohistochemische markers. De beelden worden geanalyseerd met behulp van image J 1.29 met een puncta-analyzer. Om de mate van coloclisatie tussen pre- en postsynaptische markers te bepalen, kunnen punten van coloclisatie vervolgens worden gebruikt om het aantal synapsen in de bereiding te bepalen.
Het belangrijkste voordeel van de hier beschreven techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals elektronenmicroscopie, is dat de synapstest een veel hogere doorvoeranalyse en kwantificering van het aantal synapsen mogelijk maakt. De belangrijkste implicaties van deze techniek strekken zich uit naar de diagnose en therapie van klinische aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer, epilepsie of autisme, waarbij afwijkingen en synaptische connectiviteit zijn geïmpliceerd als basis voor de onderliggende pathologie. Deze techniek kan worden gebruikt om vormen van interventie te identificeren die de tekortkomingen die we zien in het vermogen van aangetaste neuronen om synapsen met elkaar te vormen, kunnen verminderen of verbeteren.
Hoewel deze methode nuttig is voor het bestuderen van hersontwikkeling, kan deze ook worden toegepast op andere modelorganismen of orgaansystemen waarin je geïnteresseerd bent in het bestuderen of kwantificeren van het aantal cel-op-cel-contacten waarvoor je de mogelijkheid hebt om elk tegenoverliggend vlak van elke contactsite selectief te labelen. Bereid neuronale culturen door ratretinaal ganglioncellen te kweken die gezuiverd zijn uit ratretina, geoogst uit P vijf tot zeven dieren op glazen deksels bedekt met poly de lycine. In een 24-wellplaat worden de cellen gedurende drie tot vijf dagen gedurende 37 graden Celsius laten groeien voorafgaand aan transfectie.
Na transfectie worden de cellen gedurende zeven tot acht dagen geïncubeerd om synapsen te laten ontwikkelen wanneer de geplateerde cellen voldoende zijn gerijpt. Verwijder het kweekmedium uit de wells en voeg 500 microliters voorverwarmde 4% paraformaldehyde toe aan elke well gedurende zeven minuten. Bij kamertemperatuur, na fixatie, spoel de cellen drie keer met fosfaatgebufferd zoutoplossing.
Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de cellen nooit mogen drogen in de wells. Zodra een buffer uit een well is verwijderd, moet deze onmiddellijk worden vervangen door de volgende buffer. Bereid een blokkeerbuffer met 50% normaal geitenserum en 0,2% Triton X 100.
Na het verwijderen van PBS uit elke well, voeg 200 microliters van de blokkeerbuffer toe aan elke well en blokkeer gedurende 30 minuten. Bij kamertemperatuur, verwijder de blokkeerbuffer en spoel drie keer. Met PBS, bereid een primaire antilichaamverdunning voor in 90% antilichaambuffer, 10% NGS-oplossing bevattende de pre- en postsynaptische antilichaampaar naar keuze.
Hier worden een konijn-antisynapsin, een pre-synaptisch marker en een muis-anti homer. Een postsynaptische marker worden gebruikt. Centrifugeer de primaire antilichaamverdunning gedurende vijf minuten op maximale snelheid in een tafelcentrifuge om eventueel geprecipiteerd antilichaam te verwijderen, voeg vervolgens 200 microliters primaire antilichaamoplossing toe aan elke well. Plaats de plaat in een bevochtigde container om uitdroging van de primaire oplossing te voorkomen.
Incubeer een nacht op vier graden Celsius na de incubatie met primair antilichaam. Spoel elke well drie keer. Met PBS, voeg 200 microliters van de juiste secundaire antilichamen toe, verdund een op duizend in antilichaambuffer bevattend 10% NGS, bereid.
Zoals eerder, plaats de schaal in de bevochtigde kamer en incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur in het donker na de incubatie met secundaires. Spoel elke well drie tot vier keer met PBS. Plaats een druppel vector shield montagemedium met DPI op een glasplaat.
Keer vervolgens het dekglas met de cellen om op de druppel om te monteren. Toepaste vervolgens helder nagellak rond de randen van het deksel. Wees voorzichtig om de deksels niet te stoten of te verplaatsen tijdens het aanbrengen.
Aangezien dit de cellen zal delen, laat de slides minimaal 30 minuten drogen in een droge, donkere plaats. Hier wordt beeldvorming uitgevoerd met behulp van een zes axio imager fluorescentiemicroscoop uitgerust met geschikte filtersets en een 63 keer olie-immersieobjectief. Plaats een schuifje met niet-getransfecteerde cellen op het microscoopplatform.
Gebruik de DPI-filterset om celkernen te visualiseren, selecteer cellen die ten minste twee celdiameters verwijderd zijn van hun dichtstbijzijnde buren. Gebruik van DPI voor deze stap zal helpen om bias te vermijden en willekeur van celselectie te garanderen. Voor elke geselecteerde cel, verkrijg achtbitbeelden met behulp van de juiste filtersets in dit geval, GFP en Texas Red.
Het supergelegde pseudogekleurde beeld zou pre- en postsynaptische markers in respectievelijk rood en groen moeten tonen. Plaats vervolgens een schuifje met getransfecteerde cellen op het microscoopplatform. Hier zijn de cellen getransfecteerd met een TD-tomaatexpressievector.
Gebruik deze marker om cellen te selecteren zoals eerder. Voor elke geselecteerde cel, verkrijg acht pit-afbeeldingen met behulp van de juiste filtersets in dit geval, GFP, Texas Red en Sci vijf. Het supergelegde pseudogekleurde beeld zou de postsynaptische markers in rood, groen en blauw moeten hebben.
Hier wordt het puncta-analyzerprogramma gebruikt voor kwantificering van gecolociliseerd synaptisch punctuur. De Puncta-analyzer-plugin is geschreven door Barry Walk
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode om het aantal synapsen te kwantificeren in zowel gedissocieerde neuronale culturen als herfsnedes met behulp van immunocytochemie. Door gebruik te maken van compartiment-specifieke antilichamen, worden presynaptische terminalen en postsynaptische sites gelabeld, waardoor het mogelijk is om synapsen te identificeren door middel van coloclisatie van deze markers.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Immunoctytochemie
- Synaptische connectiviteit
Achtergrond
- Het begrijpen van synapsevorming is cruciaal in de neurowetenschap.
- Objectieve kwantificering van synaptische connectiviteit is essentieel voor onderzoek.
- Immunohistochemische markers worden gebruikt om synaptische contacten te visualiseren.
- Fluorescentiemicroscopie helpt bij het beeldvormen van neuronale preparaten.
Doel van het onderzoek
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor het kwantificeren van het aantal synapsen.
- Om synaptische connectiviteit te analyseren in verschillende experimentele opstellingen.
- Om het begrip van synaptische interacties in neuronale culturen en herfweefsels te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Kleuring van gekweekte neuronen of herfweefsel met presynaptische en postsynaptische markers.
- Beeldvorming met behulp van een fluorescentiemicroscoop.
- Beeldanalyse uitgevoerd met ImageJ-software.
- Coloclisatie van markers gebruikt om de aanwezigheid van synapsen te bepalen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle labelen van synaptische structuren in neuronale culturen en herfsnedes.
- Kwantitatieve analyse van het aantal synapsen bereikt door middel van coloclisatie.
- De effectiviteit van het immunocytochemie-protocol is aangetoond.
- Een raamwerk voor toekomstige studies over synaptische connectiviteit is geboden.
Conclusies
- Het protocol biedt een robuuste methode voor het kwantificeren van synapsen.
- Het kan worden toegepast op verschillende neuronale preparaten.
- Deze benadering verbetert het begrip van synaptische dynamica.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantifying synaptic connectivity provides a mechanistic readout for target validation in neurodegenerative and neuropsychiatric drug discovery. This immunocytochemistry-based assay enables objective, high-throughput assessment of synapse formation or loss, supporting early-stage hypothesis testing and pathway clarification. The method enhances predictive confidence by linking molecular interventions to quantifiable changes in synaptic density, informing go/no-go decisions in preclinical portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying changes in pre- and postsynaptic marker colocalization.
- Scientific Value: Supports biological de-risking through objective measurement of synaptic density alterations.
- Scientific Value: Enables functional target validation by linking molecular perturbations to synapse number outcomes.
Screening & Assay Development
- Operational Value: Generates standardized, quantitative readouts compatible with ImageJ-based analysis pipelines.
- Operational Value: Enables assay reproducibility across dissociated cultures and brain sections using compartment-specific antibodies.
- Operational Value: Facilitates screening readiness through high-throughput quantification of synaptic puncta.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Connects discovery findings to preclinical continuity via disease-relevant synaptic phenotypes.
- Translational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by quantifying synapse formation in model systems.
- Translational Value: Aligns with biomarker strategies by providing measurable synaptic endpoints for target engagement.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, enabling iterative assessment of synaptic modulation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying synapse formation or loss in response to genetic or pharmacological perturbations.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized immunolabeling and puncta analysis for compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative colocalization outputs that enable comparison of synaptic density across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling synaptic changes observed in neurodevelopmental and neurodegenerative disorders.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for assessing synaptic effects across multiple targets and model systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing ambiguity in mechanistic links between targets and synaptic phenotypes.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined antibody pairs and ImageJ-based quantification.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of synaptic targets before costly later-stage studies.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by quantifying target effects on a key pathophysiological process in brain disorders.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunocytochemistry, fluorescent microscopy, and image analysis.
- Dependent on access to validated pre- and postsynaptic antibody pairs and compatible microscopy systems.
- Necessitates standardization of fixation, permeabilization, and blocking protocols across sample types.
- Involves adaptation considerations when transferring from cultured neurons to tissue sections.
- Limited by the availability and specificity of synaptic markers for the target neural system.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
2:16
Preparing and Fixing Dissociated Purified Rat Retinal Ganglion Cells
7:04
Image Analysis and Co-localized Puncta Quantification
1:17
Introduction
5:33
Imaging
9:18
Preparing and Fixing Brain Sections
12:39
Imaging of Tissue Sections
17:15
Conclusion
13:34
Representative Imaging and Synapse Assay Results
