Name: Het kwantificeren van Synapsen: een immunocytochemie-gebaseerde test te Synapse Number Kwantificeer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-16T17:30:00.000+00:00
Duration: 18 min 11 s
Description: Leer synapsen kwantificeren in neuronale culturen en hersenweefsel met immunocytochemie. Deze methode gebruikt colocalisatie van pre- en postsynaptische markers voor betrouwbare analyse van synaptische connectiviteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Puncta Analyzer plug-in voor Image J werd door Barry Wark (huidig ​​adres: Physion Consulting) geschreven in het lab van Ben A. Barres (Stanford University). Financiering; <ul><li> Alfred P. Sloan Foundation </li><li> De Esther A. en Joseph Klingenstein Fund, Inc </li><li> Brede Biomedical Research Foundation </li><li> Remedie voor de ziekte van Huntington s Initiatief </li></ul>

<ol><li>Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological%2C+morphological%2C+and+electrophysiological+variation+among+retinal+ganglion+cells+purified+by+panning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning.</a> Neuron. 1, 791-803 (1988).</li>
<li>Meyer-Franke, A., Kaplan, M. R., Pfrieger, F. W., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+signaling+interactions+that+promote+the+survival+and+growth+of+developing+retinal+ganglion+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Characterization of the signaling interactions that promote the survival and growth of developing retinal ganglion cells in culture.</a> Neuron. 15, 805-819 (1995).</li>
<li>Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gabapentin+receptor+alpha2delta-1+is+a+neuronal+thrombospondin+receptor+responsible+for+excitatory+CNS+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Gabapentin receptor alpha2delta-1 is a neuronal thrombospondin receptor responsible for excitatory CNS synaptogenesis.</a> Cell. 139, 380-392 (2009).</li>
<li>Pfrieger, F. W., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+efficacy+enhanced+by+glial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro.</a> Science. 277, 1684-1687 Forthcoming.</li>
<li>Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+synapse+number+by+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of synapse number by glia.</a> Science. 291, 657-661 (2001).</li>
<li>Christopherson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombospondins+are+astrocyte-secreted+proteins+that+promote+CNS+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis.</a> Cell. 120, 421-433 (2005).</li>
<li>Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatal+and+postnatal+development+of+retinocollicular+projections+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Prenatal and postnatal development of retinocollicular projections in the mouse.</a> J. Comp. Neurol. 230, 552-575 (1985).</li>
<li>Schmidt, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+retinotopic+connections%3A+selective+stabilization+by+an+activity-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Formation of retinotopic connections: selective stabilization by an activity-dependent mechanism.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 5, 65-84 (1985).</li>
<li>Sachs, G. M., Jacobson, M., Caviness, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+changes+in+arborization+patterns+of+murine+retinocollicular+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Postnatal changes in arborization patterns of murine retinocollicular axons.</a> J. Comp. Neurol. 246, 395-408 (1986).</li>
<li>Elmariah, S. B., Oh, E. J., Hughes, E. G., Balice-Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+regulate+inhibitory+synapse+formation+via+Trk-mediated+modulation+of+postsynaptic+GABAA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytes regulate inhibitory synapse formation via Trk-mediated modulation of postsynaptic GABAA receptors.</a> J. Neurosci. 25, 3638-3650 (2005).</li>
<li>Hughes, E. G., Elmariah, S. B., Balice-Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+secreted+proteins+selectively+increase+hippocampal+GABAergic+length%2C+branching+and+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Moll.+Cell.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte secreted proteins selectively increase hippocampal GABAergic length, branching and synaptogenesis.</a> Moll. Cell. Neurosci. 43, 136-145 (2010).</li>
</ol>

De synaps assay hierboven beschreven is gevestigd in de context van onze experimentele doelen, waarin we vooral focussen op prikkelende projecties van RGC, hetzij in gezuiverde cultuur of in de hersenen sectie. We hebben een referentie tabel met antilichamen die goed werken voor etikettering excitatoire synapsen (tabel 1). Dit synaps assay kan worden aangepast aan het aantal synaps van een neuronale populatie of een ander subtype synaptic waarvoor er een selectieve pre-en postsynaptische mar...

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Antigeen </td><td> Soorten </td><td> Monoklonale / Polyklonale </td><td> Verkoper </td><td> Catalogusnummer </td><td> Verdunning </td><td> Werken in Cultuur </td><td> Werken in de artikelen </td></tr><tr><td rowspan="10"> Presynaptische </td><td> Synapsin </td><td> Konijn </td><td> Polyklonale </td><td> Synaptic Systems </td><td> 106004 </td><td> 1:750 </td><td> Y </td><td> ND </td></tr><tr><td> Synapsin </td><td> Muis </td><td> Monoklonale </td><td> Synaptic Systems </td><td> 106001 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Fagot </td><td> Muis </td><td> Monoklonale </td><td> Assay Designs </td><td> VAM-PS003F </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Fagot </td><td> Cavia </td><td> Polyklonale </td><td> Synaptic Systems </td><td> 141004 </td><td> 1:1000 </td><td> Y </td><td> ND </td></tr><tr><td> Synaptotagmin een </td><td> Konijn </td><td> Polyklonale </td><td> Synaptic Systems </td><td> 105002 </td><td> 1:750 </td><td> Y </td><td> N </td></tr><tr><td> Synaptobrevin 2 (C1.69.1) </td><td> Muis </td><td> Monoklonale </td><td> Synaptic Systems </td><td> 104211 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Synaptofysine (C1.7.2) </td><td> Muis </td><td> Monoklonale </td><td> Synaptic Systems </td><td> 101011 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> VGlut1 </td><td> Muis </td><td> Monoklonale </td><td> Millipore </td><td> MAB5502 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td> VGlut1 </td><td> Cavia </td><td> Polyklonale </td><td> Millipore </td><td> AB5905 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td> VGlut2 </td><td> Cavia </td><td> Polyklonale </td><td> Millipore </td><td> AB2251 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td rowspan="6"> Postsynaptische </td><td> PSD-95 (6G6-1C9 kloon) </td><td> Muis </td><td> Monoklonale </td><td> Affiniteit Bio Reagentia </td><td> MA1-045 </td><td> 1:750 </td><td> Y </td><td> N </td></tr><tr><td> PSD-95 </td><td> Konijn </td><td> Polyklonale </td><td> Zymed </td><td> 51-6900 </td><td> 1:500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td> Homerus </td><td> Muis </td><td> Monoklonale </td><td> Synaptic Systems </td><td> 160011 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> ND </td></tr><tr><td> Homerus </td><td> Rat </td><td> Polyklonale </td><td> Millipore </td><td> AB5875 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Gephyrin </td><td> Konijn </td><td> Polyklonale </td><td> Synaptic Systems </td><td> 147003 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Gephyrin </td><td> Muis </td><td> Monoklonale </td><td> Synaptic Systems </td><td> 147 </td><td> 1:200 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr></tbody></table> Tabel 1: Geeft een overzicht van voorbeelden van goede pre-en postsynaptische markeringen die we met succes hebben gebruikt in onze synaps test. Wees ervan bewust dat dit geen uitputtende lijst van alle beschikbare markers. Y = ja, N = Nee, ND = niet bepaald. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Cat. Nee. </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 20012-027 </td></tr><tr><td> poly-d-lysine </td><td> Sigma </td><td> P6407 </td></tr><tr><td> Laminine </td><td> Cultrex </td><td> 3400-010-01 </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Roche Diagnostics Gmbh </td><td> 9002-93-1 </td></tr><tr><td> Normaal Geit Serum </td><td> Gibco </td><td> 16210 </td></tr><tr><td> VectaShield met DAPI </td><td> Vector Laboratories </td><td> H-1200 </td></tr><tr><td> Oktober </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td></tr><tr><td> Tris-Base (50 mm) </td><td> Visser </td><td> BP152-5 </td></tr><tr><td> Bovine Serum Albumine </td><td> Sigma </td><td> A2153 </td></tr><tr><td> L-lysine </td><td> Sigma </td><td> L-1137 </td></tr><tr><td> 16% PFA-oplossing </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 15711 </td></tr><tr><td> Granular PFA </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 19210 </td></tr><tr><td> 24-well plaat cultuur </td><td> Valk </td><td> 35-3047 </td></tr><tr><td> Geit anti-muis Alexa geconjugeerde antilichamen </td><td> Invitrogen </td><td> --- </td></tr><tr><td> Leveren </td><td> Vennootschap </td><td> Cat. Nee. </td></tr><tr><td> 12mm, nr. 0 dekglaasjes </td><td> Karl Hecht Gmbh </td><td> 1105209 </td></tr><tr><td> Nee 1,5 glazen dekglaasje (voor plakjes) </td><td> VWR Scientific </td><td> 48393241 </td></tr><tr><td> Objectglaasjes </td><td> VWR Scientific </td><td> 48311-703 </td></tr></tbody></table>

het kwantificeren van synapsen: een immunocytochemie-gebaseerde test te synapse number kwantificeer

Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number

Een van de belangrijkste doelstellingen in de neurowetenschappen is het begrijpen van de moleculaire signalen dat de vroege stadia van synapsvorming instrueren. Als zodanig is noodzakelijk geworden om objectieve benaderingen te ontwikkelen voor veranderingen in de synaptische verbindingen te kwantificeren. Vanaf monster fixatie, dit protocol beschreven hoe u synaps aantal kwantificeren, zowel in gedissocieerde neuronale cultuur en in de hersenen secties met behulp van immunocytochemie. Met behulp van vak-specifieke antilichamen, we label presynaptische terminals alsmede ten aanzien sites van postsynaptische specialisatie. We definiëren synapsen als punten van colocalization tussen de signalen die door deze markers. Het aantal van deze colocalizations wordt gekwantificeerd met behulp van een plug in Puncta Analyzer (geschreven door Bary Wark, beschikbaar op aanvraag, c.eroglu @ cellbio.duke.edu) onder de ImageJ analyse software platform. De synaps assay beschreven in dit protocol kan worden toegepast op alle neurale weefsel of de bereiding waarvoor u selectief pre-en postsynaptische markers. Dit synaps test is een waardevol instrument dat op grote schaal kan worden gebruikt in de studie van synaptische ontwikkeling.

Dit protocol beschrijft hoe u synaps nummer zowel in gedissocieerde neuronale cultuur en in de hersenen secties met behulp van immunocytochemie kwantificeren. Met behulp van vak-specifieke antilichamen, we label presynaptische terminals alsmede ten aanzien sites van postsynaptische specialisatie. We definiëren synapsen als punten van colocalization tussen de signalen die door deze markers.

Het kwantificeren van Synapsen: een immunocytochemie-gebaseerde test te Synapse Number Kwantificeer

Een van de belangrijkste doelen in de neurowetenschappen is het begrijpen van de moleculaire signalen die de vroege stadia van synaptogenese aansturen. Hierdoor is het ...

Een van de belangrijkste doelen in de neurowetenschappen is het begrijpen van de moleculaire signalen die de vroege stadia van synapsvorming aansturen. Daarom is het noodzakelijk geworden om objectieve benaderingen te ontwikkelen om veranderingen in de synaptische connectiviteit te kwantificeren. Om het aantal synapsen in diverse experimentele preparaten te kwantificeren, worden gecultiveerde neuronen of cryosecties van hersenweefsel gekleurd met selectieve presynaptische en postsynaptische markers om de punten van synaptisch contact tussen neuronen te labelen.De cellen of het weefsel worden vervolgens gefotografeerd met een fluorescentiemicroscoop, waarbij eight-bit beelden worden verkregen voor elk van de kanalen die overeenkomen met de twee immunohistochemische markers. De beelden worden geanalyseerd met ImageJ 1.29 in combinatie met de puncta analyzer. Om de mate van colocalisatie tussen pre- en postsynaptische markers te bepalen, kunnen de colocalisatiepunten worden gebruikt om het aantal synapsen in het preparaat vast te stellen.Het belangrijkste voordeel van de hier beschreven techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals elektronenmicroscopie, is dat de synapse-assay e

quantifying-synapses-an-immunocytochemistry-based-assay-to-quantify

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

De overvloed aan neurotransmitter receptoren geclusterd bij synapsen grote invloed op synaptische sterkte. Deze methode kwantificeert fluorescent gelabelde neurotransmitter receptoren in drie dimensies met single-synaps resolutie...

Geautomatiseerde Kwantificering van synaptische Fluorescentie in<em&gt; C. elegans</em

This video demonstrates live-cell imaging of immunological synapse topology, investigating the interactions between T lymphocytes and epithelial cells carrying fluorescent antigens. Fluorescence microscopy reveals red cytoplasm displacement and yellow membrane rings in endothelial cells, indicating the formation of immunological synapses.

Assessing Immunological Synapse Topology through Live-Cell Imaging

This video demonstrates the immunofluorescence staining of a mouse brain slice to quantify the distribution of a specific presynaptic protein. The process involves blocking nonspecific sites, applying primary antibodies for the target protein and a reference marker, followed by secondary antibody labeling and nuclear counterstaining. The reference marker ensures accurate quantification by providing a consistent baseline, and the distribution of the presynaptic protein is analyzed across brain...

Quantifying the Distribution of a Presynaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

Source: McLeod, F., et al. Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates a method for visualizing synaptic markers in hippocampal brain slices using confocal immunofluorescence analysis. The slices are immunostained with primary antibodies targeting presynaptic and postsynaptic markers, followed by fluorophore-conjugated secondary antibodies. The labeled markers are then visualized using confocal microscopy to evaluate the synaptic...

Microscopic Analysis of Synapses in Mouse Hippocampal Slices Using Immunofluorescence

Hier beschrijven we een complete workflow voor de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van immuun synapsen tussen primaire menselijke T-cellen en cellen antigeen-presenteren. De methode is gebaseerd op imaging stroom cytometry, waarmee de verwerving en evaluatie van verscheidene duizend cel beelden binnen een relatief korte periode van tijd.

Kwalitatieve en kwantitatieve analyse van de immuun SYNAPS in het menselijke systeem met behulp van Imaging Stroom Cytometry

Een protocol voor het nauwkeurig identificeren en analyseren van synapsen in hippocampal plakjes met immunofluorescentie wordt in dit artikel beschreven.

Evaluatie van SYNAPS dichtheid in Hippocampal knaagdier hersenen plakjes

We beschrijven een optische assay voor synaptic Vesikel (SV) recycling in gekweekte neuronen. Dit protocol combineert met dubbele transfectie uitspreken een presynaptische marker en proteïne van belang stelt ons in staat te vinden presynaptische sites, hun synaptic vesikel recycling capaciteit bepalen van de rol van de proteïne van belang.

Een optische Assay voor Synaptic vesikel Recycling in gekweekte neuronen Overexpressing presynaptische eiwitten

Hier beschrijven we een kwantitatieve benadering bij de vaststelling van de verdeling van een synaptic eiwit ten opzichte van een marker eiwit met immunofluorescentie kleuring, confocal microscopie en computer-gebaseerde analyse.

Kwantificeren van de heterogene verdeling van een Synaptic proteïne in de hersenen van de muis met immunofluorescentie

Dit protocol beelden zowel de immunologische Synapse vorming en de daaropvolgende gepolariseerde secretoire verkeer naar de immunologische Synapse. Celconjugaten werden gevormd tussen een superantigen-gepulseerde Raji-cel (optredend als een antigeen-presentercel) en een Jurkat-kloon (optredend als effector helper T lymfocyten).

Imaging van de humane immunologische SYNAPS

DetectSyn is een onbevooroordeelde, snelle fluorescerende test die veranderingen meet in het relatieve synapsnummer (pre- en postsynaptische betrokkenheid) over behandelingen of ziektetoestanden. Deze techniek maakt gebruik van een nabijheidsligatietechniek die zowel in gekweekte neuronen als in vast weefsel kan worden gebruikt.

DetectSyn: een snelle, onbevooroordeelde fluorescerende methode om veranderingen in synapsdichtheid te detecteren

Hier presenteren we twee protocollen om microgliale inslokking van vGLUT1-positieve synapsen en pHRodo Red-gelabelde ruwe synaptosomen te kwantificeren met behulp van flowcytometrie.

Kwantificering van microgliale inslokking van synaptisch materiaal met behulp van flowcytometrie

Leer synapsen kwantificeren in neuronale culturen en hersenweefsel met immunocytochemie. Deze methode gebruikt colocalisatie van pre- en postsynaptische markers voor betrouwbare analyse van synaptische connectiviteit.

Het kwantificeren van Synapsen: een immunocytochemie-gebaseerde test te Synapse Number Kwantificeer

Meer video's verkennen