Het kwantificeren van Synapsen: een immunocytochemie-gebaseerde test te Synapse Number Kwantificeer

Een van de belangrijkste doelen in de neurowetenschappen is het begrijpen van de moleculaire signalen die de vroege stadia van synapsvorming sturen. Daarom is het noodzakelijk geworden om objectieve methoden te ontwikkelen om veranderingen in de synaptische connectiviteit te kwantificeren. Om het aantal synapsen in diverse experimentele preparaten te kwantificeren, worden gecultiveerde neuronen of cryosecties van hersenweefsel gekleurd met selectieve presynaptische en postsynaptische markers om de contactpunten van synaptische verbindingen tussen neuronen te labelen.

De cellen of het weefsel worden vervolgens afgebeeld met een fluorescentiemicroscoop, waarbij achtbitsbeelden worden verkregen voor elk van de kanalen die overeenkomen met de twee immunohistochemische markers. De beelden worden geanalyseerd met Image J 1.29 in combinatie met de puncta analyzer. Om de mate van colocalisatie tussen pre- en postsynaptische markers te bepalen, kunnen de colocalisatiepunten vervolgens worden gebruikt om het aantal synapsen in het preparaat vast te stellen.

Het belangrijkste voordeel van de hier beschreven techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals elektronenmicroscopie, is dat de synaps-assay een veel hogere doorvoersnelheid mogelijk maakt voor de analyse en kwantificering van het aantal synapsen. De belangrijkste implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de diagnose en therapie van klinische aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer, epilepsie of autisme, waarbij abnormaliteiten in de synaptische connectiviteit zijn aangewezen als basis voor de onderliggende pathologie. Deze techniek kan worden gebruikt om interventievormen te identificeren die de tekortkomingen in het vermogen van aangedane neuronen om synapsen met elkaar te vormen, kunnen verminderen of verbeteren.

Hoewel deze methode nuttig is voor het bestuderen van de hersenontwikkeling, kan deze ook worden toegepast op andere modelorganismen of orgaansystemen waarin u het aantal cel-celcontacten wilt bestuderen of kwantificeren, mits u in staat bent om elke tegenoverliggende zijde van elke contactplaats selectief te labelen. Bereid neuronale culturen voor door rat retinal ganglion cells, gezuiverd uit de retina van ratten geoogst van P5 tot P7 dieren, uit te platen op glazen dekglasplaatjes gecoat met poly-D-lysin. In een 24-wellplaat krijgen de cellen de gelegenheid om drie tot vijf dagen voor transfectie te groeien bij 37 °C.

Incubeer de cellen na transfectie nog zeven tot acht dagen om de synapsen te laten ontwikkelen zodra de geplaatste cellen voldoende zijn gerijpt. Verwijder het kweekmedium uit de wells en voeg aan elke well 500 µL voorverwarmde 4% paraformaldehyde toe en fixeer ze gedurende zeven minuten. Spoel de cellen na fixatie drie keer met fosfaatgebufferde zoutoplossing bij kamertemperatuur.

Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de cellen in de wells nooit uitdrogen. Zodra een buffer uit een well is verwijderd, moet deze direct worden vervangen door de volgende buffer. Bereid een blokkeringsbuffer voor die 50% normaal geiten serum en 0,2% Triton X 100 bevat.

Nadat de PBS uit elke put is verwijderd, voegt u 200 µL blokkeerbuffer toe aan elke put en blokkeert u gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens de blokkeerbuffer en spoel drie keer met PBS. Bereid een verdunning van het primaire antilichaam in een oplossing van 90% antilichaamsbuffer en 10% NGS, met daarin het gewenste pre- en postsynaptische antilichaampaar.

Hier worden een konijnen anti-synapsine, een presynaptische marker, en een muis anti-homer, een postsynaptische marker, gebruikt. Centrifugeer de verdunning van het primaire antilichaam vijf minuten op maximale snelheid in een benchtop-centrifuge om eventueel neergeslagen antilichaam te verwijderen, en voeg vervolgens 200 µL primaire antilichaamoplossing toe aan elke well. Plaats de plaat in een bevochtigde container om uitdroging van de primaire oplossing te voorkomen.

Incubeer overnacht bij vier graden Celsius na de incubatie met het primaire antilichaam. Spoel elke put drie keer. Voeg 200 microliters van de geschikte secundaire antilichamen toe, verdund 1:1000 in een vooraf bereid antilichaambuffer met 10% NGS, met PBS.

Plaats de schaal, zoals voorheen, in de bevochtigingskamer en incubeer deze na de incubatie met de secundaire antilichamen gedurende twee uur bij kamertemperatuur in het donker. Spoel elke put drie tot vier keer met PBS. Breng een druppel vector shield montage medium met DPI aan op een glazen objectglas.

Keer vervolgens het dekglas met de cellen om op de druppel om deze te monteren. Breng tot slot rond de randen van het dekglas transparante nagellak aan. Zorg ervoor dat u de dekglazen tijdens het aanbrengen niet verschuift of beweegt.

Aangezien dit de cellen zal blootstellen, laat u de preparaten ten minste 30 minuten drogen op een droge, donkere plaats. Hier wordt de beeldvorming uitgevoerd met een zeiss axio imager fluorescentiemicroscoop die is uitgerust met geschikte filtersets en een 63 keer olie-immersieobjectief. Plaats een preparaat met niet-getransfecteerde cellen op de objecttafel van de microscoop.

Gebruik de DPI-filterset om de celkernen te visualiseren en selecteer cellen die zich op een afstand van ten minste twee celdiameters van hun dichtstbijzijnde buren bevinden. Het gebruik van DPI voor deze stap helpt bij het vermijden van bias en waarborgt de willekeur van de celselectie. Maak voor elke geselecteerde cel beelden van acht bit met de juiste filtersets, in dit geval GFP en Texas Red.

De overgelegde pseudo-gekleurde afbeelding moet pre- en postsynaptische markers respectievelijk in rood en groen tonen. Plaats vervolgens een objectglas met getransfecteerde cellen op de microscooptafel. Hier zijn de cellen getransfecteerd met een TD tomato expressievector.

Gebruik deze marker om cellen te selecteren zoals voorheen. Maak voor elke geselecteerde cel acht pit-afbeeldingen met de juiste filtersets, in dit geval GFP, Texas Red en Sci five. De over elkaar gelegde pseudogekleurde afbeelding moet de postsynaptische markers in rood, groen en blauw tonen.

Hier wordt het programma puncture analyzer gebruikt voor de kwantificering van colokaliserende synaptische puncta. De Puncta analyzer-plugin is geschreven door Barry Walk en is op aanvraag beschikbaar in ImageJ 1.26. Open een van de verzamelde afbeeldingen.

Gebruik de cirkelvormige selectietool om een regio te selecteren met een straal van ongeveer één celdiameter rond de SOR van belang. Ga nadat de regio van belang is geselecteerd naar het menu plugins en selecteer puncture analyzer. Selecteer in het verschijnende venster met analyse-opties Red Channel en Green Channel. Kies vervolgens subtract background en stel het resultatenbestand in.

Klik op ok. Definieer vervolgens een locatie om de resultaten op op te slaan. In het venster dat verschijnt, kunnen deze resultaten naar Excel worden geëxporteerd voor verdere analyse.

Zorg vervolgens dat een rolling ball radius van 50 is geselecteerd en vink de optie voor een witte achtergrond uit. Deze aanpassing is niet vereist, maar wordt vaak geprefereerd door gebruikers van de applicatie. Klik voor een betere visualisatie op oké.

Er verschijnt een nieuw venster naast een masker dat overeenkomt met de afbeelding van het rode kanaal. Pas de drempelwaarde aan totdat het rode masker zo nauwkeurig mogelijk overeenkomt met zoveel mogelijk afzonderlijke puncties. Klik op 'done' zonder te veel ruis te introduceren.

Stel de minimale punctu-grootte in op vier pixels. Pas verder niets aan. Klik op ok.

Herhaal de vorige stap, maar nu voor het groene kanaal. Nadat dit voor het groene kanaal is herhaald, zal de plug-in kwantificeringen leveren die overeenkomen met de puncta in elk kanaal afzonderlijk en de gelokaliseerde puncta tussen de twee kanalen. De hier getoonde synapse assay kan worden toegepast op cryosecties van de hersenen en op elk ander zenuwstelselweefsel, zoals het ruggenmerg of het netvlies.

Mits er een geschikt pre- en postsynaptisch markerpaar beschikbaar is. Begin met het oogsten van hersenweefsel van een muis die is geëuthanaseerd door exsanguinatie en perfusie met PBS. Plaats de gehele hersenen gedurende de nacht bij vier graden Celsius in 4%paraldehyde in PBS tot de volgende dag.

Spoel de hersenen drie keer af met PBS. Cryoprotegeer de hersenen door deze te plaatsen in 30% sucrose in PBS.

Het weefsel zal aanvankelijk drijven; houd het op vier graden Celsius totdat het weefsel naar de bodem zinkt. Op dat moment is de cryoprotectie voltooid. Bed het daarna brein in de gewenste oriëntatie voor het maken van coupes in een twee-op-één oplossing van 20% sucrose met OCT en PBS.

Bijvoorbeeld sagittaal of coronaal. Plaats vervolgens een plat metalen oppervlak bovenop een emmer droogijs. Plaats het ingebedde brein hierop om het te laten invriezen; zodra het bevroren is, wordt het brein overgebracht naar een vrieszak en bewaard bij -80 °C voor maximaal een jaar vóór het maken van de coupes.

Snijd het weefsel met een cryostaat in secties van 12 tot 16 micron en monteer deze op glazen objectglazen. Droog de objectglazen vervolgens door ze in een oven van 37 °C te plaatsen. Spoel ze daarna drie keer met PBS om residuele OCT te verwijderen.

Een paraffinepen wordt gebruikt om een hydrofobe barrière rondom het objectglas te creëren, waarna blokkeringsbuffer op het glas wordt aangebracht; de paraffineborder voorkomt dat de buffer van het glas afstroomt. Plaats de objectglazen gedurende één uur bij kamertemperatuur in 20% normaal geiten serum in PBS voor de blokkering. Plaats de coupes vervolgens in primaire antilichamen verdund in PBS met 0,3% Triton en 10% normaal geiten serum.

Hier wordt konijnen-anti-PSD 95 gebruikt om glutamaterge, postsynaptische compartimenten te labelen en cavia-anti-vglut2 om glutamaterge presynaptische terminals te labelen. Plaats de coupes bij 4 °C en incubeer deze gedurende 36 tot 60 uur. Was na de incubatie het primaire antilichaam weg door de coupes drie keer gedurende elk 15 minuten onder te dompelen in PBS.

Zorg er na deze stap voor dat de objectglazen worden beschermd tegen direct licht. Breng secundaire antilichamen aan, verdund 1:200 in PBS met 0,3% triton en 10% normaal geiten serum. In dit geval: geit anti-guineapig.

Alexa 488 en geit anti-konijn Alexa 594 worden gebruikt. Incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur in het donker.

Was de objectglaasjes door ze vier keer gedurende elk 15 minuten onder te dompelen in PBS voor het monteren. Voeg kleine druppels Vector Shield monteermedium toe met een wattenstaafje en dek de objectglaasjes af met dekglasjes. Breng nagellak aan om verschuivingen van de dekglasjes te voorkomen.

De beeldvorming van weefselcoupes moet worden uitgevoerd met een confocale microscoop met geschikte lasers, gebruikmakend van een 63x olie-immersie-objectief voor elke coupe-afbeelding, waarbij seriële optische coupes worden gemaakt met intervallen van 0,33 micron over een totale diepte van vijf micron, voor in totaal 15 optische coupes. Er moeten minimaal drie coupes per dier worden afgebeeld en er moeten minimaal drie dieren per experimentele conditie worden opgenomen. Genereer maximumintensiteitsprojecties uit groepen van drie opeenvolgende coupes, wat resulteert in vijf projecties die elk een diepte van één micron vertegenwoordigen.

Deze werden gekwantificeerd met Image J zoals beschreven voor RG Cs, met een aangepaste ROI om het aantal gevormde synapsen in afwezigheid van astrocyten te bepalen. Immunochemie werd uitgevoerd op gedissocieerde rgc behandeld met basaal groeimedium, gebruikmakend van antilichamen tegen bassoon (weergegeven in rood) en homer (weergegeven in groen), zoals verwacht. Er worden zeer weinig punten van synaptische colocalisatie waargenomen; om het effect van door astrocyten uitgescheiden moleculen op het aantal gevormde synapsen te bepalen, werden in vitro gedissocieerde RG Cs elke drie dagen behandeld met geconditioneerd medium van muisastrocyten gedurende in totaal 12 dagen, gevolgd door de kleuring.

Talrijke synapsen waren zichtbaar in dit neuron, maar soon is in rood weergegeven. Homer is in groen weergegeven; gedissocieerde RDC's getransfecteerd met cytoplasmatisch Lee dat TD tomato tot expressie bracht, werden behandeld met enkel basaal groeimedium. Synapsen zijn niet zichtbaar.

TD-tomaat is in het blauw te zien en de synaps is in het rood te zien. Er is zeer weinig signaal zichtbaar voor de postsynaptische marker homer, weergegeven in het groen. Wanneer dezelfde cellen chronisch worden behandeld met geconditioneerd medium van rattenastrocyten, zijn er veel synapsen zichtbaar.

TD tomaat is hier in blauw, synapsine in rood en homer in groen. Er wordt een gezuiverde RGC getoond die is behandeld met astrocyte-geconditioneerd medium en is gekleurd voor presynaptische markeringen in rood en postsynaptische homer-groene markeringen; drempelmaskers gegenereerd met puncture analyzer komen overeen met de twee aanwezige kanalen. Na het identificeren van colocalisatiepunten geeft Puncta analyzer een grafische weergave van deze punten weer.

Een numerieke output wordt geleverd door de puncta-analyzer, die het aantal discrete puncta aangeeft dat in beide kanalen is geïdentificeerd, evenals voor punten van colocalisatie. De gegevens voortvloeiend uit de analyse van dit neuron illustreren het vermogen van door astrocyten gesecreteerde moleculen om de vorming van synapsen te bevorderen; dit wordt hier getoond als een synaps-assay waarin de colocalisatie van pre- en postsynaptische immunohistochemische kleuring werd gekwantificeerd om de potentiering van astrocyten-geïnduceerde synapsvorming aan te tonen door overexpressie van de neuronale receptor voor het belangrijke, door astrocyten gesecreteerde synaptogene molecuul thrombospondine. In deze figuur wordt het gemiddelde aantal synapsen per neuron getoond dat chronisch is behandeld met basaal groeimedium, gm, of met astrocyten-geconditioneerd medium.

A-C-M-A-C-M bevordert de synapsvorming in retinale ganglioncellen die de thrombospondine-receptor overexpresseren sterker dan in cellen die een lege vector overexpresseren. Om de synapsdichtheid in de superieure colliculus van muizen te kwantificeren, werden pre- en postsynaptische compartimenten afzonderlijk gelabeld met compartimentspecifieke immunohistochemische markers. Zoals hier getoond, was er een toename in het aantal synapsen van postnatale dag zeven tot P 14.

Dit illustreert de toename van het aantal synapsen in de superior colliculus gedurende dit ontwikkelingsvenster. Zodra men deze methode beheerst, kan dit protocol in ongeveer twee dagen worden voltooid voor gedissocieerde neuronale culturen en in ongeveer vijf dagen voor hersensecties, uitgaande van het oogsten uit het dier volgens deze procedure. Andere methoden, zoals elektrofysiologie en elektronenmicroscopie, worden gebruikt om te verifiëren dat de veranderingen in het aantal synapsen respectievelijk wijzen op veranderingen in zowel functionele synapsen als ultrastructureel normale synapsen.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u immunohistochemie toepast op uw experimentele preparaat om het aantal synapsen te kwantificeren. Dit protocol beschrijft in detail hoe compartiment-specifieke antilichamen worden gebruikt om pre- en postsynaptische compartimenten selectief te labelen. In deze context definiëren we synapsen als punten van colocalisatie tussen de signalen die zijn verkregen van elk van deze markers.