Agar-Block microkosmos voor de gecontroleerde Plant Tissue Ontleding door Aerobic Fungi

Het algemene doel van deze procedure is om een aërobe houtafbrekende schimmel in een microkosmos van een petrischaal te inoculeren waar de houtvochtigheid en exogene substraten strikt worden gecontroleerd. Dit wordt bereikt door eerst microkosmen voor te bereiden met exacte volumes van bekende media. Vervolgens worden het te degraderen hout en eventuele exogene vaste substraten geassembleerd op een plastic raster op het agri-oppervlak zonder contact tussen substraten toe te staan.

De microkosmos wordt vervolgens geïnoculeerd en geïncubeerd met de testschimmel. Na incubatie worden houtblokken geoogst om massaverlies te bepalen en weefsels voor analyse voor te bereiden. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de mate van houtafbraak en de rol van exogene elementbronnen laten zien door middel van massa verliesmetingen, waarnemingen van myceliële morfologie en gerichte elementanalyses zoals inductief gekoppelde plasmaspectroscopie.

Hallo, mijn naam is Brooke Jacobson van het laboratorium van Dr. Jonathan Schilling in de afdeling Bioproducts en Biosystems Engineering aan de Universiteit van Minnesota. Vandaag gaan we je een procedure laten zien voor het gebruik van petrischalen als micro-omgevingen voor de afbraak van plantenweefsel door aërobe schimmels. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de mechanismen van schimmelafbraak van lignocellulose te bestuderen.

Lignocellulose is het plantenweefsel dat bestaat uit lignine, cellulose en hemicellulose. Het weefsel dat we het vaakst bestuderen is hout. Fouten met de minder technische aspecten van de ontwerp van de auger-blok zijn de meest voorkomende oorzaken van falen en de belangrijkste bronnen van variabiliteit tussen studies, waardoor videopublicatie van onze auger-blok opstelling nuttig is. We weten uit ervaring dat deze procedure resultaten oplevert met hoge kwaliteit en lage variabiliteit.

Dus laten we beginnen. Gebruik voor deze experimenten petrischalen die een centimeter dieper zijn dan typische petrischalen om de kopruimte boven het houtblok te vergroten. In de microkosmos.

Begin met de voorbereiding van de microkosmos door genoeg agar te maken voor 20 milliliter per petrischaal voor calcium en ijzervrij. Typ agar op 15 gram agar in een 500 milliliter volumetrisch kolf met ongeveer 400 milliliter gedeïoniseerd water, aangevuld met supplementen. Gebruik eerder bereide stockoplossingen om micronutriënten aan het mengsel toe te voegen.

Zodra de voedingsstoffen zijn toegevoegd, vult u de volumetrische kolf tot de 500 milliliter lijn. Breng vervolgens het medium over in een 1000 milliliter kolf. Autoclaveer bij 121 graden Celsius en 16 PSI gedurende 20 minuten.

Zorg ervoor dat u een volume van 500 milliliter per kolf niet overschrijdt om te voorkomen dat agri vóór het toedienen van testplaten stolt. Laat na het autoclaven het medium afkoelen tot het aanvoelt om condensatie te minimaliseren. Het minimaliseren van vocht is cruciaal in deze experimenten, aangezien vochtgehalte of mc.

Meer dan 80% veroorzaakt anoxie in weefsels. Beperk de afbraak door aërobe schimmels en verhoog de variabiliteit eens.Koel. Gebruik een draagbare pipetstang en 10 milliliter steriele polystyreen pipetten om asseptisch over te brengen.

Breng de agar over in een hoge stapel platen in een bioveiligheidskast. Snijd vervolgens genereus plastic maasrasters om in de bodem van de plaat te passen. Na het snijden en grondig wassen van rasters met zeep en water, bereid de maasrasters voor op drogen en autoclaven voor deze demonstratie.

Zuidelijke gele den of SYP wordt gebruikt omdat het een belangrijke bron van hout vertegenwoordigt. Gebruik niet-behandeld hout en snijd 19 bij 19 millimeter knoopvrije blokken uit een enkele longitudinale snede langs de nerf. Snijd deze lengte in blokken van 19 millimeter kubus.

Splits de 19 millimeter kubusvormige blokken in twee langs de nerf met een beitel en hamer in plaats van een zaag. Dit maakt een ruwe blokrand om op de plastic maas in het agri-blok microkosmos te plaatsen en een gladde bovenrand om te labelen. Label de gladde rand van de blokken met een potlood, snijd voldoende blokken om de behandelingen te voldoen, evenals de niet-geïnoculeerde controles die zowel als besmettingsmonitoren zullen dienen als als baseline gegevensmonsters, geconditioneerd in parallel voor in de oven gedroogde materialen, plaats monsters in aluminium weipannen en in een convectieoven bij 100 graden Celsius gedurende 48 uur.

Breng de monsters over van de oven naar een desiccator om ze af te koelen. Weeg de monsters vooraf om het initiële ovendrooggewicht te bepalen. Bereid tenslotte de monsters voor inclusief plastic rasters en hout voor autoclavage door ze strak in folie te wikkelen om natteling te minimaliseren.

Dit vereist niet dat elk monster afzonderlijk wordt ingepakt, maar dat de stoombelasting laag en consistent is. Autoclaveer de gelabelde monsters bij 121 graden Celsius en 16 PSI gedurende één uur. Verzamel in een steriele bioveiligheidskast lege AE's, een bronplaat voor inoculum maasplant substraat exogene materialen, een sharpie paraform strips, pincetten en overdrachtsgereedschappen.

De volgende stap van de inoculatie is het toevoegen van de items aan de agri, bevat petrischalen om het risico op besmetting te minimaliseren. Vlam de overdrachtsgereedschappen en pincetten met 95% ethanol af zoals ze worden gebruikt. Voeg eerst het plastic maas toe aan de petrischaal.

Voeg vervolgens het houtsubstraat hier toe. Twee houtblokken worden langs de lengte van het maas toegevoegd, zodat gegevens kunnen worden gekoppeld van de vroege en late oogst. Deze blokken worden zij aan zij met graan en met de punt van de bron van schimmelinoculum geplaatst.

Voeg vervolgens de exogene materialen toe.Hier. De rol van gips wordt getest op afbraak door een filamenteuze schimmel. Daarom moet de schimmel deze gipsschijven tegenkomen voordat deze het hout bereikt.

Eén gipsschijf wordt tussen elk blok en inoculum punt bovenop het maas geplaatst. Zorg ervoor dat er geen contact is tussen de schijven in het hout terwijl ze dicht bij elkaar worden gehouden. Gebruik voor het schimmelinoculum een nummer vier kurk Boer met een diameter van zeven millimeter om pluggen te maken van twee weken oude