Name: Een 96 Goed microtiterplaat-gebaseerde methode voor de controle Formation en schimmelwerende gevoeligheid testen van Candida albicans Biofilms (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-21T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Leer een eenvoudige methode voor het vormen van Candida albicans biofilms in 96-well microtiterplaten en het testen van schimmelwerende gevoeligheid. Deze techniek is reproduceerbaar en kosteneffectief.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biofilm-gerelateerde werkzaamheden in het laboratorium wordt gefinancierd door subsidies genummerde R21DE017294 en R21AI080930 van het National Institute of Dental &amp; Craniofaciale Onderzoek en het Nationaal Instituut voor Allergie en Infectieziekten (tot JLL-R.). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de NIDCR, de NIAID of de NIH.

1. Voorbereiding van de C. albicans C. albicans is een risicogroep 1/BSL1 micro-organisme. Altijd onthouden om goed aseptisch / steriele technieken te gebruiken voor het werken met dit micro-organisme en institutionele procedures voor de juiste afvoer van biologisch gevaarlijke materialen te volgen. <ol><li> Bereid een overnachting cultuur van C. albicans in YPD (Gist Peptone Dextrose) vloeibaar medium door het enten een enkele kolonie van C. albicans in 25 ml YPD. </li><li> Incubeer cultuur in een rondschudapparaat (ongeveer 180 rpm) bij 30 ° C gedurende de nacht. De meeste C. albicans stammen zal groeien als gistcellen onder deze omstandigheden. </li><li> Centrifugeer het 's nachts culturen (ongeveer 3.000 rpm, 5-10 minuten), tweemaal wassen cellen met steriel PBS, en resuspendeer de laatste pellet in ongeveer 20-25 ml RPMI 1640 medium gebufferd met 165 mM morpholinepropanesulfonic zuur tot pH 7,0 en voorverwarmde bij 37 ° C (van nu af aan dit medium wordt aangeduid als gewoon "RPMI 1640"). </li><li> Tellen cellen met behulp van een hemacytometer. Na het tellen, Maak een suspensie van cellen op een uiteindelijke dichtheid van 1,0 x 10 6 cellen / ml in RPMI 1640. Let op: Omdat cellen hebben de neiging te aggregeren, is het belangrijk om vortex krachtig tussen de wasbeurten en voor pipetteren. </li></ol> 2. Instellen van de 96-wells microtiterplaat voor de vorming van de biofilm <ol><li> Met behulp van een multichannel pipet toe te voegen 100 ul van C. albicans schorsing in geselecteerde putjes van de 96-well microtiterplaat (-s). Voeg geen cellen te putten in kolom 12, omdat deze zal dienen als negatieve controle. </li><li> Bedek de hele microtiterplaat met de oorspronkelijke deksel, afdichting met parafilm, plaats binnen een incubator en incubeer gedurende 24 uur bij 37 ° C. De lengte van de incubatietijd kan worden aangepast aan de specifieke experimentele opzet. Bijvoorbeeld, is het mogelijk om de kinetiek van biofilmvorming over een periode van 24 onderzoeken - 48 uur per zaaien meerdere platen en verwerking van elk bord op verschillende tijdstippen (bijvoorbeeld 2, 4, 8, 12, 24 en 48 uur) </li><li> Na de vorming van biofilm, met behulp van een multichannel pipet zuig het medium goed als niet aan te raken en verstoren van de biofilms die zijn gevormd in elk van de putten. </li><li> Met behulp van een multichannel pipet Was de plaatjes driemaal in steriele PBS (200 pi per putje). U kunt ook een geautomatiseerde microtiterplaat wasmachine. Tussen wast, en vooral na de laatste wassen, laat u de platen in een omgekeerde positie door deppen met keukenpapier om de resterende PBS te verwijderen. Op dit punt biofilms gevormd op de bodem van de putten moet duidelijk zichtbaar zijn, zelfs met het blote oog en kan ook worden gevisualiseerd met behulp van een omgekeerde microscoop (figuur 1). Biofilms zijn nu klaar om te worden verwerkt voor antischimmel gevoeligheidstests assays. (Als het belangrijkste doel van het experiment is het beoordelen van de mate van biofilmvorming, de platen zijn klaar om te worden verwerkt volgens de colorimetrische methode. Hiervoor is de XTT / menadion reagens (zie stap 3 hieronder) kunnen worden toegevoegd en de resulterende kleur lezen met behulp van een microtiterplaat lezer). </li></ol> 3. Schimmelwerende Gevoeligheid Testen van Biofilms <ol><li> Uit voorraad oplossingen of poeder, bereid een werkende oplossing in RPMI 1640-medium van elke antifungale te testen. Typische hoge concentraties worden 1024 ug / ml voor fluconazol, en 16 ug / ml voor zowel amfotericine B en caspofungine. Andere concentraties kan worden gebruikt voor verschillende agenten. </li><li> Met behulp van een multichannel pipet, voeg 200 pi van de hoge concentratie van antifungale werking om de corresponderende putten in kolom 1 van elke microtiterplaat met schimmel biofilms. </li><li> Voeg 100 ul van RPMI 1640 aan elk putje in de kolommen 2 tot 10. </li><li> Voeg 100 ul van RPMI 1640 tot putten in kolom 11. </li><li> Verwijder de 100 pi van antischimmelmiddel uit de bronnen van kolom 1 en toe te voegen aan de aangrenzende putten in kolom 2 (reeds met 100 ul van medium). </li><li> Meng de inhoud goed door en neer te pipetteren om een ​​seriële verdubbeling verdunning uit te voeren, en verwijder de tips. </li><li> Herhaal dit naar rechts te verplaatsen tot aan de bronnen van de kolom 10, waarna de laatste 100 pi het volume van de bronnen van de kolom 10 na het mengen wordt weggegooid. Op deze manier is een reeks van verdunningen verdubbeling van uw agent (-s) van belang is gemaakt, van het meest geconcentreerd in putjes van kolom 1 het minst geconcentreerd in putjes van kolom 10. Onbetwiste biofilms in kolom 11 zal dienen als positieve controles, en lege waterputten in kolom 12 zal dienen als negatieve controle. </li><li> Bedek de borden met de deksels, afdichting met parafilm en incubeer gedurende 24 -48 uur bij 37 ° C. </li><li> Na de incubatieperiode Was de plaatjes als in stap 2.4 voor (3 x PBS). </li><li> Met behulp van een multichannel pipet toe te voegen 100 pi van de XTT / menadion oplossing voor elk putje met een pre-gewassen biofilm evenals negatieve controle putten voor het meten van de achtergrond XTT-colorimetrische niveaus. <ol><li> De XTT is bereid als een verzadigde oplossing van 0,5 g / L lactaat in steriele Ringer's, PBS of zoutoplossing, die moet worden filter-gesteriliseerd met behulp van een 0,22 um-poriegrootte filter. De XTT oplossing is licht gevoelig, dus het moet worden afgedekt met aluminiumfolie tijdens de bereiding. Een keer voorbereid en filter-gesteriliseerd, aliquot in 10 ml werken volumes, en bewaar bij -70 ° C. Bescherm de buizen van licht met behulp van aluminiumfolie. Dooi slechts zoveel buizen als nodig is voor een bepaald experiment vlak voor gebruik. </li><li> Menadion wordt bereid als een 10 mM voorraad-oplossing in 100% aceton, in hoeveelheden verdeeld in kleinere volumes (ongeveer 50 pL) en opgeslagen bij -70 ° C. Bereid de XTT / menadion oplossing vlak voor gebruik, door het toevoegen van een pi van de stockoplossing van menadion om een ​​buisje met 10 ml van de ontdooide XTT oplossing. </li></ol></li><li> Dek de platen in aluminium folie en incubeer in het donker gedurende 2 uur bij 37 ° C. </li><li> Ontdek de platen. Met behulp van een multichannel pipet verwijderen 80 pi van het resulterende gekleurde supernatant uit elk putje en zetten in de overeenkomstige putjes van een nieuwe microtiterplaat. </li><li> Lees de plaat (-s) in een microtiterplaat reader bij 490 nm. </li><li> Bereken de sessiele minimaal remmende concentraties SMIC50 en SMIC80, die de antifungale concentraties waarbij een 50% of 80% daling van de colorimetrische metingen worden gedetecteerd in vergelijking met de controle biofilms gevormd in de afwezigheid van antifungale geneesmiddelen (in dit geval de waarden voor kolom 11 , ook niet vergeten om de waarden af ​​te trekken van negatieve controle van de putten in kolom 12 met XTT only). SMIC resultaten kunnen worden gepresenteerd als een tabel (dwz meerdere isolaten tegen meerdere antimycotica) of als alternatief, de resultaten voor elke individuele schimmel te isoleren tegen elkaar antifungale kan worden gepresenteerd in een grafiek door het plotten percentage remming ten opzichte van antifungale concentratie. </li></ol> Voorbeeld: Na aftrek van de waarden in de negatieve controle, de gemiddelde OD van controle biofilms gevormd in kolom 11 is 1,32. De SMIC50 is de laagste antifungale concentratie leidt tot&gt; 50% vermindering van de colorimetrische metingen, in dit geval minder dan 1,32 x 50/100 = 0,66. Ook de SMIC80 is de laagste antifungale concentratie leidt tot&gt; 80% vermindering van de colorimetrische metingen, in dit geval minder dan 1,32 x 20 / 100 = 0.264. 4. Representatieve resultaten Figuur 1 toont een microphotograph van een C. albicans biofilm gevormd op de bodem van een put in een 96 wells microtiterplaat genomen met behulp van een omgekeerde microscoop. Figuur 2 toont XTT-colorimetrische metingen (OD 490 waarden) voor elk van de 11 biofilms van een C. albicans wild-type stam gevormd in elk van de acht verschillende rijen van dezelfde 96 goed microtiterplaat. Figuur 3 toont de activiteit van amfotericine B in verschillende concentraties tegen C. albicans biofilms; pijltjes geven SMIC50 en SMIC80 waarden. <img src="/files/ftp_upload/2287/2287fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. (A) Paneel A toont genomen microphotograph met behulp van een camera bevestigd aan een omgekeerde microscoop van een C. albicans biofilm gevormd op de bodem van de put na aspiratie van RPMI medium en de daaropvolgende wassingen met PBS. (B) Een microfoto van een typische C. albicans biofilm gevisualiseerd met behulp van scanning elektronenmicroscopie. Bars zijn 100 um en 10 um voor de panelen A en B respectievelijk. <img src="/files/ftp_upload/2287/2287fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. De vorming van meerdere gelijkwaardige C. albicans biofilms in 96-well microtiterplaten. Colorimetrische metingen (OD 490 waarden) van XTT-reductie testen van biofilms gevormd door een C. albicans wild type in putjes van microtiterplaten. Waarden zijn voor 11 onafhankelijke biofilms gevormd in elk van de acht verschillende rijen van dezelfde 96 goed microtiterplaat. Resultaten voor de verschillende rijen werden vergeleken met one-way variantie-analyse en het gebruik van de Bartlett's test voor homogeniteit van variantie en meervoudige vergelijking van de Bonferroni post-test. Geen statistisch significante verschillen werden waargenomen bij het vergelijken van alle paren van de rijen aan elkaar (P&gt; 0,05). <img src="/files/ftp_upload/2287/2287fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Typische gevolgen van antifungale testen van de gevoeligheid tegen C. albicans biofilms. grafiek die typische resultaten van de effectiviteit van verschillende amfotericine B concentraties tegen biofilms van een C. albicans wild-type stam. De waarden worden uitgedrukt als gemiddelde percentage colorimetrische metingen voor XTT-reductie assays in vergelijking met putten te controleren. SMIC50 en SMIC80 waarden zijn aangegeven met pijlen.

<ol><li>Bachmann, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+activity+of+caspofungin+against+Candida+albicans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">In vitro activity of caspofungin against Candida albicans biofilms.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46, 3591-3596 (2002).</li>
<li>Hawser, S. P., Norris, H., Jessup, C. J., Ghannoum, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+a+2%2C3-bis%282-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl%29-5-%5B%28phenylamino%29carbonyl%5D-2H-t+etrazolium+hydroxide+%28XTT%29+colorimetric+method+with+the+standardized+National+Committee+for+Clinical+Laboratory+Standards+method+of+testing+clinical+yeast+isolates+for+susceptibility+to+antifungal+agents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of a 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-t etrazolium hydroxide (XTT) colorimetric method with the standardized National Committee for Clinical Laboratory Standards method of testing clinical yeast isolates for susceptibility to antifungal agents.</a> J Clin Microbiol. 36, 1450-1452 (1998).</li>
<li>Kuhn, D. M., Balkis, M., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uses+and+limitations+of+the+XTT+assay+in+studies+of+Candida+growth+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Uses and limitations of the XTT assay in studies of Candida growth and metabolism.</a> J Clin Microbiol. 41, 506-508 (2003).</li>
<li>Kuhn, D. M., George, T., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+susceptibility+of+Candida+biofilms%3A+Unique+efficacy+of+amphotericin+B+lipid+formulations+and+echinocandins%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Antifungal susceptibility of Candida biofilms: Unique efficacy of amphotericin B lipid formulations and echinocandins.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 46, 1773-1780 (2002).</li>
<li>Nobile, C. J., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+albicans+transcription+factor+Bcr1p%3A+a+regulator+of+cell-surface+genes+and+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biol%22%5BJournal%5D)">C. albicans transcription factor Bcr1p: a regulator of cell-surface genes and biofilm formation.</a> Current Biol. 15, 1150-1155 (2005).</li>
<li>Ramage, G., Saville, S. P., Thomas, D. P., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+biofilms%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Candida biofilms: an update.</a> Eukaryot Cell. 4, 633-638 (2005).</li>
<li>Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., p, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+method+for+in+vitro+antifungal+susceptibility+testing+of+Candida+albicans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms.</a> Antimicrob Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).</li>
<li>Bachmann, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+combinations+against+Candida+albicans+biofilms+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Antifungal combinations against Candida albicans biofilms in vitro.</a> Antimicrob Agents Chemother. 47, 3657-3659 (2003).</li>
<li>Ramage, G., VandeWalle, K., Bachmann, S. P., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+pharmacodynamic+properties+of+three+antifungal+agents+against+preformed+Candida+albicans+biofilms+determined+by+time-kill+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">In vitro pharmacodynamic properties of three antifungal agents against preformed Candida albicans biofilms determined by time-kill studies.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46, 3634-3636 (2002).</li>
<li>Ramage, G., VandeWalle, K., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+biofilm+formation+by+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Iberoam.+Micol%22%5BJournal%5D)">Characteristics of biofilm formation by Candida albicans.</a> Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).</li>
<li>Tellier, R., Krajden, M., Grigoriew, G. A., Campbell, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+endpoint+determination+system+for+antifungal+susceptibility+testing+of+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Innovative endpoint determination system for antifungal susceptibility testing of yeasts.</a> Antimicrob Agents Chemother. 36, 1619-1625 (1992).</li>
<li>Nett, J., Andes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+biofilm+development%2C+modeling+a+host-pathogen+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Candida albicans biofilm development, modeling a host-pathogen interaction.</a> Curr Opin Microbiol. 9, 340-345 (2006).</li>
</ol>

JLL-R is eigenaar van het eigen vermogen in MicrobeHTS Technologies, Inc, dat is het ontwikkelen van antimycotica. MicrobeHTS Technologies, Inc mits er geen financiële steun voor deze studies.

Hier beschrijven we een eenvoudige, snelle, zuinige en zeer reproduceerbaar 96 wells microtiterplaat model voor de vorming van Candida biofilms in combinatie met een colorimetrische methode die de metabole activiteit van cellen die maatregelen in de biofilm met behulp van XTT. Deze 96 wells microtiterplaat model voor de vorming van biofilm werd oorspronkelijk ontwikkeld voor C. albicans, maar kan gebruikt worden voor andere Candida spp. en eenvoudig worden aangepast voor andere schimmels organ...

<table><tbody><tr><td>Sabouraud-dextrose agar</td><td>BD Biosciences</td><td>211584</td><td>Om platen voor verse subculturen van schimmelisolaten voor te bereiden</td></tr><tr><td>YPD: Yeast peptone dextrose</td><td>US Biological</td><td>Y2076</td><td>Medium voor vermeerdering van vloeibare overnight-culturen</td></tr><tr><td>RPMI-1640 zonder natriumbicarbonaat, aangevuld met L-glutamine</td><td>Cellgro</td><td>50-020-PB</td><td>Vloeibaar medium voor biofilmvorming</td></tr><tr><td>Morfolinepropaansulfonzuur (MOPS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP308</td><td>Om RPMI 1640 te bufferen</td></tr><tr><td>Fosfaatgebufferde zoutoplossing, PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>Buffer voor wasstappen</td></tr><tr><td>XTT-natriumzout</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X4251</td><td>Zie bovenstaande voor bereidingsinstructies</td></tr><tr><td>Ringer&amp;rsquo;s lactaat</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC0409-7953-09</td><td>Voor bereiding van XTT-oplossing</td></tr><tr><td>Menadion</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5625</td><td>Waarschuwing: gevaarlijk bij contact met de huid, inademing of inname</td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Conische centrifugebuisjes van 15 ml</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>Conische centrifugebuisjes van 50 ml</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>96-wells microtiterplaten: Polystyreen, vlakke bodem, behandeld voor weefselkweek</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Multikanaalpipet en tips</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Alle leveranciers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtiterplaatlezer</td><td>Alle leveranciers</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

een 96 goed microtiterplaat-gebaseerde methode voor de controle formation en schimmelwerende gevoeligheid testen van candida albicans biofilms

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

Candida albicans blijft de meest voorkomende oorzaak van schimmelinfecties bij een groeiende populatie van gecompromitteerde patiënten en candidiasis is nu de derde meest voorkomende infectie bij Amerikaanse ziekenhuizen. Verschillende manifestaties van candidiasis worden geassocieerd met biofilm vorming, zowel op de host weefsels en / of medische hulpmiddelen (bijvoorbeeld katheters). Biofilmvorming draagt ​​negatieve klinische implicaties, zoals cellen in de biofilms worden beschermd tegen gastheer immuunreacties en van de actie van de antischimmelmiddelen. We hebben een eenvoudige, snelle en robuuste in vitro model voor de vorming van C. albicans biofilms met 96 wells microtiterplaten-platen, die ook kan worden gebruikt voor de biofilm antischimmel gevoeligheid testen. Het uitlezen van deze test is colorimetrische, gebaseerd op de reductie van XTT (een tetrazolium zout) door de metabool actieve schimmel biofilm cellen. Een typisch experiment duurt ongeveer 24 uur voor de biofilmvorming, met een extra 24 uur voor antischimmel gevoeligheid testen. Door zijn eenvoud en het gebruik van algemeen beschikbare laboratorium-materiaal en apparatuur, deze techniek democratizes biofilm onderzoek en is een belangrijke stap op weg naar de standaardisatie van antifungale gevoeligheid testen van schimmel biofilms.

Beschrijven we een eenvoudige, snelle en robuuste methode voor de vorming van<em&gt; Candida albicans</em&gt; Biofilms met 96 well microtiterplaten en het nut van in antifungale testen van de gevoeligheid van de cellen in biofilms.

Een 96 Goed microtiterplaat-gebaseerde methode voor de controle Formation en schimmelwerende gevoeligheid testen van Candida albicans Biofilms

Candida albicans blijft de meest voorkomende oorzaak van schimmelinfecties bij een groeiende populatie immuungecompromitteerde patiënten en candidiasis is inmiddels de derde ...

Het algemene doel van deze procedure is het vormen van Candida albicans-biofilms en het onderzoeken van de gevoeligheid ervan voor antifungale middelen. Dit wordt bereikt door eerst deze schimmelbiofilms te vormen in de putjes van 96-wells microtiterplaten, waarna antifungale middelen aan de vooraf gevormde biofilms worden toegevoegd en deze gedurende 24 tot 48 uur na deze toevoeging worden geïncubeerd.Een colorimetrische methode die de metabole activiteit van cellen binnen de biofilms meet, wordt gebruikt om de activiteit van deze antifungals te bepalen, teneinde de minimale inhiberende concentratie van antifungals tegen biofilms vast te stellen. Hiermee kunnen uiteindelijk resultaten worden verkregen die het vermogen tot biofilmvorming en de antifungal-gevoeligheid aantonen via een eenvoudige en toegankelijke methode op basis van 96-wells microtiterplaten in combinatie met een colorimetrische uitlezing. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze eenvoudig en relatief goedkoop is, een hoge reproduceerbaarheid vertoont en de vorming van meerdere equivalente biofilms mogelijk maakt.Bovendien is het compatibel met de 96-well platformtechnologie die algemeen beschikbaar is in de meeste onderzoeks- en klinische laboratoria. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van caniden, aangezien deze infecties zeer vaak geassocieerd worden met biofilmvorming.Gebruik juiste microbiologische hanteertechnieken om een lus vol cellen te nemen van een verse subcultuur van albicans op een SAU dextrose koperplaat en inoculeer deze in een erlenmeyer van 125 milliliter met 25 milliliters gist-pepton-dextrosebouillon. Plaats de cultuur in een orbitale schudmachine ingesteld op 180 RPM en 30 °C en incubeer deze gedurende de nacht. Giet na de nachtelijke incubatie de gistculturen in conische buizen van 50 milliliter en centrifugeer deze gedurende 5 tot 10 minuten bij 3000 RPM. Verwijder het supernatant en vortex.Resuspend het pellet krachtig om de cellen te ontmengen. Voeg vervolgens steriele PBS toe om te wassen voordat de culturen opnieuw worden gecentrifugeerd. Herhaal deze wasstap nogmaals en resuspend dan de cellen.In ongeveer 20 milliliters RPMI 1640, medium gebufferd tot pH 7.0. Gebruik hiervoor een oplossing van 165 millimolar mops, voorverwarmd op 37 degrees Celsius. Bereid vanuit deze suspensie een verdunning van 1 op 100 met behulp van een standaard hemocytometer en een lichtveldmicroscoop. Tel de cellen.Bereid vervolgens een uiteindelijke celluspendersie voor van 1 × 10⁶ per ml in verwarmd gebufferd RPMI 1640. Breng met een meerkanaals pipet 100 µL van de Sea Albican-suspensie over in geselecteerde wells van een steriele 96-wells microtiterplaat met een platte bodem. Laat de wells in kolom 12 leeg, aangezien deze als negatieve controles zullen dienen.Dek de plaat af, sluit deze af met parafilm en incubeer deze 24 uur lang bij 37 °C om de biofilms te laten vormen. Aspireer na de incubatie voorzichtig het medium uit elke well en gooi dit weg. Let er hierbij op dat de aan de bodem gevormde biofilms niet worden verstoord.Was door 200 µL PBS aan elke well toe te voegen en laat dit weglopen door de plaat voorzichtig om te keren en af te drogen op een stapel papieren handdoeken. Herhaal deze wasstap drie keer. Op dit punt zijn biofilms met het blote oog detecteerbaar en kunnen ze worden gevisualiseerd met een omgekeerde microscoop met behulp van SEM.We kunnen vaststellen dat de biofilms bestaan uit een verstrengeld mengsel van filamenten en gistcellen. Zodra de biofilmvorming is geverifieerd, kan de testen van antifungale middelen beginnen met gebruik van gebufferd RPMI 1640-medium; bereid werkoplossingen met een hoge concentratie van de te testen antifungale middelen. Typische hoge concentraties zijn 1024 µg/mL voor fluconazol en 16 µg/mL voor amfotericine B en caspofungine.Voeg vervolgens 200 µL antifungale oplossingen toe aan de wells in kolom één en 100 µL gebufferd RPMI 1640-medium aan de wells in kolom twee tot en met 11. Voer een reeks seriële verdunningen uit door 100 µL van de antifungale oplossingen met de hoogste concentratie over te brengen van de wells in kolom één naar die in kolom twee.Pipetteer na voorzichtig op en neer mengen 100 µL van de wells uit kolom twee naar die van kolom drie, en herhaal dit tot aan kolom 10. Voeg geen antifungale oplossing toe aan kolom 11, aangezien deze als positieve controle dient, en verwijder de laatste 100 µL uit de wells van kolom 10. Alle wells, behalve die in kolom 12.Het uiteindelijke volume moet nu 100 µL zijn. Dek de plaat af, verzegel deze met Parafilm en incubeer deze bij 37 °C gedurende 24 tot 48 uur om de antifungale middelen hun werking te laten vertonen. Na de incubatie wordt de plaat drie keer gewassen in PBS zoals eerder beschreven, waarna aan alle wells, inclusief de wells voor de negatieve controle, 100 µL XTT-mediumoplossing wordt toegevoegd.In kolom 12. Dek de plaat af, wikkel deze in aluminiumfolie om deze tegen het licht te beschermen en incubeer bij 37 °C gedurende twee uur. Verwijder na de incubatie de folie van de plaat om de kleurontwikkeling mogelijk te maken.De aanvankelijk heldere XTT-oplossing zal oranje zijn geworden na verwerking door metabolisch actieve cellen. Breng 80 µL van de gekleurde supernatanten over naar een nieuwe microtiterplaat met een platte bodem. Gebruik een colorimetrische microtiterplaatlezer ingesteld op een golflengte van 490 nm om de plaat af te lezen, zoals hier wordt getoond. In afwezigheid van antifungalicida waren de colorimetrische metingen onbehandeld.De biofilms van de SEA-aanvragers in de verschillende rijen zijn equivalent. Om het effect van de eerst geteste antifungale verbindingen te evalueren, trekt u eerst een gemiddelde achtergrondwaarde, verkregen uit de negatieve controleputjes in kolom 12, af van alle andere waarden. Bereken vervolgens het percentage inhibitie met behulp van de positieve controles in rij 11.De maximale waarden, de antifungale concentraties waarbij een afname van 50% of 80% in de colorimetrische metingen wordt gedetecteerd, staan bekend als de Cecil minimale remmende concentraties. Deze waarden worden doorgaans gebruikt als een referentiemaat voor de potentie van een verbinding. Met deze eenvoudige high-throughput methode kunnen fungale biofilms in vitro binnen 24 uur worden gevormd, waarna geselecteerde verbindingen na de initiële ontwikkeling kunnen worden gescreend op antifungale activiteit.Deze techniek baande de weg voor onderzoekers op het gebied van de medische mycologie om biofilmvorming te verkennen en de activiteit van antifungale middelen te onderzoeken. Opnieuw: de cellen in biofilms.

a-96-well-microtiter-plate-based-method-for-monitoring-formation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

De test beschrijft een snelle wijze te vroeg biofilmvorming in bacteriën en schimmels te meten. Deze methode maakt gebruik van een microtiterplaat als substraat voor microbiële biofilm en de vorming van biofilm wordt gevisualiseerd met behulp van kristalviolet stam. De test geeft zowel een kwalitatieve of kwantitatieve test voor de vroege biofilmvorming.

Microtiter Dish biofilm vorming Assay

We hebben een hoge dichtheid microarray platform bestaande uit 3D nano-biofilms...

Candida albicans Biofilm Chip (Ca BChip) voor high-throughput antimycoticum Screening

This video demonstrates an in vitro assay to screen antifungal compounds using a broth microdilution assay. Test compounds are serially diluted in a microtiter plate and incubated with a fungal inoculum. Post-incubation, the plate is examined for wells without visible fungal growth to assess the antifungal potential of the test compounds and their minimum inhibitory concentration (MIC).

An In Vitro Broth Microdilution Assay for the Screening of Antifungal Compounds

This video demonstrates an in vitro technique to study the effect of antibodies on fungal biofilms. The pathogenic fungus Candida tropicalis secretes a virulence factor secreted aspartyl proteinase 2 (Sap2), facilitating biofilm formation. Upon introducing a heat-inactivated serum containing Sap2-specific antibodies that inhibit biofilm maturation, the viability of the fungal cells is assessed using a chromogenic assay.

An In Vitro Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilm

We presenteren een experimentele procedure van Candida albicans biofilmontwikkeling in een muis subcutaan model. Schimmelbiofilms werden gekwantificeerd door het bepalen van het aantal kleurvormende eenheden en door niet-invasieve bioluminescentie-beeldvorming, waarbij de hoeveelheid geproduceerd licht overeenkomt met het aantal levensvatbare cellen.

Candida albicans biofilm ontwikkeling op medisch-relevante vreemde lichamen in een muis Subcutane Model Gevolgd door bioluminescentiebeeldvorming

Dit protocol beschrijft het gebruik van een aanpasbaar geautomatiseerde microfluidic apparaat te visualiseren van biofilm vorming in Candida albicans , onder fysiologische omstandigheden van de gastheer.

Visualisatie van Biofilm vorming in Candida albicans met behulp van een geautomatiseerd Microfluidic-apparaat

Een eenvoudig en flexibel Bouillon microdilution methode voor het screenen van antischimmel verbindingen en extracten.

Bouillon Microdilution In Vitro Screening: een gemakkelijke en snelle methode om te ontdekken van nieuwe antischimmel Compounds

Hier presenteren we een stapsgewijze protocol om te onderzoeken de mitochondriale ademhaling en de glycolytic functie in Candida Albicans met behulp van een extra flux-analyzer.

Bio-energetica onderzoek naar Candida albicans met behulp van Real-time extracellulaire Flux Analysis

Om de interne kenmerken van Candida albicans biofilms te bekijken en te kwantificeren, bereiden we vaste intacte exemplaren voor die worden verduidelijkt door refractieve indexmatching. Vervolgens kan optische sectioning microscopie worden gebruikt om driedimensionale beeldgegevens te verkrijgen, hoewel de volledige dikte van de biofilm.

Verduidelijken en beeldvorming Candida albicans Biofilms

Dit protocol beschrijft een methode voor het verkrijgen van kwantitatieve gegevens over de antischimmelactiviteit van peptiden en andere verbindingen, zoals antischimmelmiddelen met kleine moleculen, tegen Candida albicans. Het gebruik van optische dichtheid in plaats van het tellen van kolonievormende eenheden om groeiremming te kwantificeren, bespaart tijd en middelen.

Kwantificeren van de antischimmelactiviteit van peptiden tegen Candida albicans

Een 96-well microtiter plaat-gebaseerd protocol met behulp van een 2,3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfofenyl)-5-carboxanilide-2H-tetrazolium (XTT) reductietest wordt hierin beschreven, om de effecten van antilichamen op biofilms gevormd door C. tropicalis te bestuderen. Dit in vitro protocol kan worden gebruikt om het effect van potentiële nieuwe antischimmelverbindingen op de metabole activiteit van Candida-soortencellen in biofilms te controleren.

Een oplosbare tetrazolium-gebaseerde reductietest om het effect van antilichamen op Candida tropicalis biofilms te evalueren

Leer een eenvoudige methode voor het vormen van Candida albicans biofilms in 96-well microtiterplaten en het testen van schimmelwerende gevoeligheid. Deze techniek is reproduceerbaar en kosteneffectief.

Een 96 Goed microtiterplaat-gebaseerde methode voor de controle Formation en schimmelwerende gevoeligheid testen van Candida albicans Biofilms (Video) | JoVE Journal

Een 96 Goed microtiterplaat-gebaseerde methode voor de controle Formation en schimmelwerende gevoeligheid testen van Candida albicans Biofilms

Meer video's verkennen