Name: Een inleiding tot Worm Lab: van kweken van Worms naar Mutagenesis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T22:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Leer mutagenese-methoden voor genetisch onderzoek met Pristionchus pacificus. Deze technieken met EMS en TMP/UV helpen onderzoekers mutanten te genereren en genfuncties te identificeren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door NSF subsidie ​​IOB # 0615996.

Deel 1: Voorbereiding van nematoden groei media (NGM) Petri platen Experimentele nematoden, zoals C. elegans en P. pacificus worden meestal gekweekt in het laboratorium op 6 cm Petri platen met Nematode groeimedium (NGM) 1. Wormen zijn bewaard bij 20 ° C, maar kan worden geïncubeerd bij een bereik van temperaturen (tussen 4 ° C - 25 ° C), afhankelijk van de nematode soort en de experimentele opzet. Voor te bereiden platen met NGM, standaard steriele technieken worden gebruikt om schimmel en bacteriële besmetting te voorkomen. Hieronder ziet u het protocol voor NGM platen voor te bereiden: <ol><li> Weeg 15 g agar, 2,4 g NaCl, 2 g Trypton, en 2,72 g KH 2 PO 4 in 2 L erlenmeyer, maken het volume tot 1 L met water, autoclaaf en laat het afkoelen tot 60 ° C in een waterbad. </li><li> Voeg 0,8 ml van elk van 1 M CaCl 2, cholesterol (5 mg / ml in ethanol) en een M MgSO 4. Om te voorkomen dat schimmel-en bacteriële besmetting, 1 ml streptomycine (100 mg / ml) en 1 ml nystatine (10 mg / ml) kunnen worden toegevoegd aan elke liter medium. </li><li> Met behulp van een Unispense machine en handhaven van de steriele omstandigheden, giet de media in de gewenste platen. De platen moeten worden gevuld tot ongeveer 2 / 3 rd vol. Een standaard 60 mm diameter plaat duurt ongeveer 10 ml van de media. Niet bewegen de platen totdat de agar volledig is gelified, anders zal er een oneffen oppervlak van de agar worden, waardoor het moeilijk is om wormen richten zich op de stereomicroscoop. </li><li> Eenmaal gedroogd, kan de platen onmiddellijk worden gezaaid of opgeslagen bij 4 ° C tot inzaaien met bacteriën. </li></ol> Deel 2: Voorbereiding OP50 bacteriën en zaaien NGM Petri platen P. pacificus wordt gekweekt in het laboratorium door zich te voeden op de E.coli OP50 stam. OP50 heeft een beperkte groei op de NGM borden, waardoor een dun gazon dat de visualisatie van de wormen een vergemakkelijkt. Om te groeien van een cultuur van OP50, gebruik LB-bouillon: <ol><li> Voeg 5 g bactotryptone, 2,5 g gistextract en 2,5 g NaCl aan een 500 ml schroefdop fles, vul aan tot 500 ml met gedestilleerd water en autoclaaf. </li><li> Inoculeren de bouillon met een kolonie van OP50 uit de cultuur plaat onder steriele omstandigheden en laten het 's nachts groeien bij 37 ° C. </li><li> LB-OP50 is klaar om gebruikt te worden en kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende enkele maanden als steriliteit wordt gehandhaafd. Wanneer platen moeten worden gezaaid, giet een kleine hoeveelheid van de bouillon in een kleine steriele beker en dit zal helpen voorkomen dat vervuiling van de voorraad cultuur. </li><li> Om zaad platen, afzien van 100 tot 120 ul van de OP50 op de 60 mm diameter NGM Petri plaat en draai om het te verspreiden. </li><li> Incubeer deze gezaaide plaatjes gedurende een nacht bij kamertemperatuur het gazon om te groeien. Deze geplaatste platen kunnen nu worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal 3 weken. Ze op te slaan in een omgekeerde positie helpt voorkomen dat een snelle droging. </li></ol> Deel 3: Het maken van een pick In deze paragraaf beschrijven we hoe je een keuze voor de wormen te maken. De pick wordt gebruikt om wormen overbrengen van de ene locatie naar de andere. De keuze is gemaakt van 30 gauge 90% platina 10% iridium, hoewel sommige onderzoekers misschien liever iets anders metal composities: <ol><li> Snij ongeveer 3-4 cm van de draad, plaats 0,5 cm van het binnen de top van een Pasteur pipet (waarvan tip was gebroken om een ​​kleinere lengte), en dan sluit deze in het glas boven een bunsenbrander. De lengte van de draad uitsteken van het glas is ongeveer 3 tot 3,5 cm, maar kan variëren afhankelijk van individuele voorkeuren. </li><li> Platter het eind van de draad die uitsteekt met een hamer of een tang. Buig het afgeplatte gedeelte omhoog om een ​​scoop te vormen. </li><li> Glad de scherpe randen van de te halen bij een schuurpapier om te voorkomen dat beschadiging van de worm of de agar. </li></ol> Deel 4: Picking wormen <ol><li> Om wormen halen, steriliseren de platina-draad op een vlam en sleep de afgeplatte top van de pick langs de bacteriële gazon aan de vacht van de tip met dikke kleverige bacteriën, zorg ervoor dat u doorboren of schade aan de agar oppervlak. </li><li> Met behulp van de stereomicroscoop, zeer licht brush de sticky tip tegen de worm / wormen om geplukt te worden tot de worm stokken op de bacteriën op de pick. </li><li> Zodra de worm is op de punt van het plukken, onmiddellijk overdragen aan de nieuwe plaat door het aanraken of schuifdeuren de punt van de pick tegen de bacteriële gazon van de nieuwe plaat, en de worm moeten kruipen uit. Zorg moet worden genomen niet aan de oppervlakte van agar op de plaat schade anders de wormen kruipen in de gaten waardoor het moeilijk is om ze te halen. Als de worm blijft op de pick te lang, kan het uitdrogen. </li></ol> Deel 5: EMS mutagenese Ethylmethaansulfonaat (EMS) induceert een breed spectrum van mutaties in het in het genoom 2. Mutanten kunnen worden geïdentificeerd door gebreken, zoals eieren leggen, spier-defects, geslachtsbepaling, Dauer vorming, gedrag en gonade vorming. Het protocol voor EMS mutagenese is gelijk aan die beschreven voor C. elegans 1. <ol><li> Bereid 500 ml (of meer) van 1N NaOH. </li><li> Neem 4-5, 6 cm diameter Petri platen vol met wormen, die een paar honderd wormen bij het derde larvale juveniele (J3) podium en was de wormen uit met 2-3 ml van de steriele M9 per plaat. </li><li> Verzamel alle wormen in een steriele, disposable 15 ml centrifugebuis. Centrifugeer bij 1500 xg gedurende 5-7 minuten of totdat de wormen vormen een pellet. </li><li> Aspireren van de vloeistof en gebruik 2 ml M9 om opnieuw te schorsen van de wormen. Voeg 20 ul EMS naar een buisje met 2 ml M9 en schud om het te ontbinden. Voeg vervolgens deze EMS oplossing voor de 2 ml van de worm schorsing en zacht zwenken. De uiteindelijke concentratie van EMS zal 47 mm zijn. Let op: EMS is een zeer sterk mutageen en moet behandeld in een zuurkast te worden. Alle materialen (handschoenen, pipetten, tips), die in contact komen met deze mutageen moeten worden behandeld met 1 N NaOH op inactief de EMS. Draag dubbele handschoenen tijdens de gehele EMS mutagenese procedure. Gooi de gevaarlijke afvalstoffen op basis van uw instelling richtlijnen. </li><li> Plaats de centrifugebuis en bedek de dop met parafilm, horizontaal plaats deze in de zuurkast en laat de wormen incubeer gedurende 3,5 uur. De buis kan ook worden geplaatst op een lage snelheid rocker. </li><li> Draai de buis en dekking van de kap met parafilm; plaats in verticale positie en incubeer totdat de wormen gootsteen. </li><li> Zuig het supernatant af en gooi dit in een beker / kolf met 1N NaOH. Dit zal inactiveren van de EMS. </li><li> Voeg 5 ml M9 naar de wormen, Keer de buis 25-30 keer naar de wormen, centrifuge was bij 1500 xg gedurende 5-7 minuten of totdat de wormen vormen een pellet. Zuig het supernatant af en gooi in de 1N NaOH beker. </li><li> Herhaal de wasstap minstens 3 keer. </li><li> Na de laatste wasbeurt, resuspendeer de worm pellet in minimale hoeveelheid (~ 500 pi) van de M9 en pipet ze uit op NGM platen met een gazon van OP50 bacteriën. Op dit moment hoeft u niet langer aan het werk in de chemische kap. </li><li> Laat de vloeistof drogen voor een paar minuten en dan oppakken en overdragen gezond uitziende J4 larven in de frisse gezaaid platen. Gooi de originele plaat op basis van uw instelling gevaarlijk afval richtlijnen. </li><li> Laat de gemutageniseerde wormen zelf te bevruchten. Met behulp van een stereomicroscoop, het scherm van de F2-generatie fenotypes voor de recessieve mutanten van belang. </li></ol> Deel 6: Psoralen mutagenese In deze paragraaf beschrijven we de procedure voor het mutagenese met behulp van TMP in combinatie met lange golflengte ultraviolet (UV). TMP / UV methode van mutagenese wordt veel gebruikt om deletiemutaties veroorzaken binnen een genoom 3. <ol><li> Verzamel wormen uit 4-5, 6 cm diameter Petri platen in een 15 ml centrifugebuis, zoals beschreven in de vorige procedure. </li><li> Voeg 10 ml M9, omkeren 20 keer om de wormen, en centrifugeer wassen bij 1500 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant en herhaal het wassen voor een totaal van 3 keer. Aspireren de vloeistof en de wormen weer te schorten in ongeveer 10 maal het volume van de M9 met 30 ug / ml van TMP. Pipetteer 20 ul van TMP (3 mg / ml) in 2 ml van de M9. Net als EMS, TMP is een krachtige kankerverwekkende stof en moeten worden behandeld met de juiste veiligheidsmaatregelen. Om te voorkomen dat mogelijke risico's van het UV-licht juiste oog draagt ​​moet worden gebruikt. De disposables moet worden weggegooid in de juiste biohazard zakken. </li><li> Incubeer het buisje in het donker gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur op een lage snelheid rocker (40 UPM). Verticaal stellen het overdekte buis gedurende 10 minuten om alle wormen laten zinken. </li><li> Verwijderen de wormen uit de bodem van de buis met een Pasteur pipet en breng ze naar een ongeplaatste NGM plaat. Verwijder het supernatant volgende gevaarlijke uw instelling de chemische richtlijnen. </li><li> Hou de plaat in het donker totdat de overmaat TMP wordt geabsorbeerd in de plaat. </li><li> Met behulp van een UV-intensiteit meter, de afstand tussen de lange golf UV-bron en de plaat zodanig dat de intensiteit op de plaat is 500 μW / cm 2 4. Verwijder het aluminium deksel en het deksel en de deksel en bloot de plaat met de TMP behandeld wormen aan de lange golf UV-straling voor 50 seconden. </li><li> Deksel en laat de wormen in het donker gedurende 5 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Pick en overdracht gezond uitziende J4 larven in de frisse gezaaid platen. Gooi de originele plaat volgende gevaarlijke uw instelling de chemische richtlijnen. </li><li> Met behulp van een stereomicroscoop, het scherm van de F2-generatie fenotypes voor de mutatie van belang. </li></ol> Deel 7: representatieve resultaten Een deel van de P. pacificus mutant fenotypes als gevolg van de mutagenese (hetzij door EMS of TMP / UV) zijn weergegeven in figuur 1. Elke mutant heeft een karakteristieke fenotype dat is gemakkelijk te onderscheiden van de wilde soort dier. Van de wormendie werden behandeld met de mutageen, 30 J3/J4 larven uit de ouderlijke generatie (P0) werden geplaatst in afzonderlijke platen en liet voor eieren, die de F1-generatie te leggen. Van de platen die een gezonde F1 nakomelingen toonden, werden in totaal 1000 F1's overgebracht naar de individuele borden en de F2 nakomelingen werden gescreend op fenotypes. Dieren met Dumpy 5,6, Ongecoördineerde 6 en 7 Transformator fenotypen gevonden. <img src="/files/ftp_upload/2293/2293fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Pristionchus pacificus wild-type en mutant dieren. A. wt hermafrodiet B. gew mannelijk C. dpy mutant D. unc mutant E. tra mutant. Bovenste twee panelen met wild-type hermafrodiet (links) en mannelijke (rechts) dieren te vergelijken met de verschillende mutanten in de resterende panelen.

<ol><li>Brenner, S. Genetics. 77 (1), 71-71 (1974).</li>
<li>Anderson, P. Methods Cell Biol. 48, 31-31 (1995).</li>
<li>Yandell, M. D., Edgar, L. G., Wood, W. B. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (4), 1381-1381 (1994).</li>
<li>Pires-daSilva, A. WormBook. , 1-1 (2005).</li>
<li>Kenning, C., Kipping, I., Sommer, R. J. Genesis. 40 (3), 176-176 (2004).</li>
<li>Sommer, R. J., Carta, L. K., Kim, S. Y. Fundamental and Applied Nematology. 19 (6), 511-511 (1996).</li>
<li>Pires-daSilva, A., Sommer, R. J. Genes & development. 18 (10), 1198-1198 (2004).</li>
<li>Wei, A., Yuan, A., Fawcett, G. Nucleic acids research. 30 (20), 110-110 (2002).</li>
<li>Jorgensen, E. M., Mango, S. E. Nat Rev Genet. 3 (5), 356-356 (2002).</li>
</ol>

Mutagenese is een grote schaal wordt toegepast techniek voor genetische studies in verschillende experimentele model organismen. Mutagenese experimenten worden vaak gebruikt om de functie van een gen twee te identificeren. De mutagenese hier beschreven procedures kan worden gebruikt, niet alleen voor P. pacificus, maar ook voor C. elegans en andere verwante soorten aaltjes. Hier beschrijven we twee methodes, EMS en TMP / UV mutagenese. EMS is een chemische stof d...

een inleiding tot worm lab: van kweken van worms naar mutagenesis

An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

Dit protocol beschrijft procedures voor het onderhouden nematoden in het laboratorium en hoe je ze mutagenize met behulp van twee alternatieve methoden: ethylmethaansulfonaat (EMS) en 4, 5 &#39;, 8-trimethylpsoralen in combinatie met ultraviolet licht (TMP / UV). Nematoden zijn krachtige biologische systemen voor genetische studies omwille van hun eenvoudige bouwplan en de paring systeem, dat bestaat uit zelf-bemesting hermafrodieten en mannetjes die kan genereren honderden nakomelingen per dier. Nematoden worden onderhouden in agar platen met een gazon van bacteriën en kan gemakkelijk worden overgedragen van de ene plaat naar de andere met behulp van een pick. EMS is een alkylerend middel vaak gebruikt om puntmutaties en kleine deleties veroorzaken, terwijl de TMP / UV voornamelijk veroorzaakt verwijderingen. Afhankelijk van de soort nematode wordt gebruikt, zal de concentratie van EMS en TMP moeten worden geoptimaliseerd. Te isoleren recessieve mutaties van de nematode Pristionchus pacificus, werden de dieren van de F2-generatie visueel gescreend fenotypes. Ter illustratie van deze methoden, we gemutageniseerd wormen en zocht naar Ongecoördineerde (UNC), Dumpy (dpy) en de transformator (Tra) mutanten.

Screening voor mutanten met fenotypische afwijkingen is een eenvoudige methode voor het identificeren van genen die functie in een bepaald biologisch proces. In dit artikel beschrijven we hoe u de cultuur vrij levende wormen (bv.<em&gt; Pristionchus pacificus</em&gt;) In het laboratorium en tonen twee verschillende mutagenese methoden, EMS en TMP / UV.

Een inleiding tot Worm Lab: van kweken van Worms naar Mutagenesis

Dit protocol beschrijft procedures voor het onderhouden van nematoden in het laboratorium en hoe deze gemutageerd kunnen worden met behulp van twee alternatieve methoden: ethylmethaan...

Het algemene doel van deze procedure is het uitvoeren van twee verschillende mutagenese-protocollen die veelvuldig worden gebruikt om mutanten van nematoden te genereren, zoals ceno, hepatitis elegance en prisca. Pacificus-mutagenese is een krachtig instrument om de functie van genen te ontrafelen. Dit wordt bereikt door eerst culturen voor te bereiden met grote aantallen wormen in het laatste larvale stadium vóór de volwassenheid, waarmee de mutagenese zal worden uitgevoerd.De volgende stap is om de wormen te mutageniseren met behulp van twee alternatieve procedures: behandeling met ethylmethaansulfonaat, of EMS-mutagenese in combinatie met ultraviolette straling. De derde stap van de procedure is om gezonde uitziende wormen over te brengen naar agarplaten die vers zijn geënt met bacteriën, wat dient als voedingsbron. De laatste stap van de procedure is het screenen op mutante fenotypes van belang in de eerste, tweede of derde generatie.Hoi, ik ben Jore van het laboratorium van Dr. Andre Perez, de Silva bij de afdeling Biologie aan de University of Texas at Arlington. De TMPUV- en EMS-mutagenese-procedures helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van genetisch onderzoek, zoals welke genen betrokken zijn bij biologische processen die een belangrijke rol spelen tijdens de ontwikkeling. Hoi, mijn naam is Manish Phar; hoewel de gedemonstreerde mutagenesemethoden bedoeld zijn voor Pristi Onca S Pacificus, kunnen ze zeer algemeen worden toegepast voor andere experimentele modellen, zoals de nematode Caenorhabditis elegans, en zelfs gewervelde dieren zoals zebravissen.Laten we beginnen. Onze pick voor het overbrengen van wormen van de ene naar de andere locatie is gemaakt van 30 gauge, 90% platina en 10% iridium draad. Hoewel sommige onderzoekers wellicht een voorkeur hebben voor licht verschillende metaalsamenstellingen voor het maken van een pick, wordt er ook een Pasteurpipet gebruikt om de pick vast te houden.Begin met het afbreken van de verlengde punt van de Pasteurpipet tot de gewenste lengte. Knip ongeveer drie tot vier centimeter draad af en plaats 0,5 centimeter hiervan in de punt van de Pasteurpipet; smelt de draad met een bunsenbrander in het glas vast.De lengte van de draad die uit het glas steekt is ongeveer drie tot drie en een halve centimeter, maar kan variëren afhankelijk van persoonlijke voorkeur. Plat het uiteinde van de uitstekende draad af met een tang. Buig vervolgens het platte gedeelte omhoog om een schepje te vormen.Strijk tot slot de scherpe randen van de pick glad met schuurpapier om beschadiging van de worm of de agar te voorkomen. Om wormen te picken, steriliseert u de draad van de pick in een vlam en sleept u vervolgens de afgeplatte punt over een bacteriële lawn op een NGMP tree plate om de punt te voorzien van een dikke laag kleverige bacteriën. Wees voorzichtig om het agar-oppervlak niet door te prikken of te beschadigen, terwijl u zeer lichtmatig een stereomicroscoop gebruikt.Wrijf de plakkerige punt tegen de worm die moet worden opgepikt, totdat de worm aan de bacteriën op de pick blijft hechten. Zodra de worm zich op de punt van de pick bevindt, wordt deze onmiddellijk overgebracht naar de nieuwe plaat door de punt van de pick tegen het bacteriële gazon van de nieuwe plaat te drukken of te schuiven. Er moet voorzichtig worden gewerkt om het agar-oppervlak van de plaat niet te beschadigen, omdat de wormen in de gaten kunnen kruipen en dan moeilijk terug te halen zijn.De worm moet van de prikker afkruipen wanneer u de punt van de prikker tegen de bacteriële lawn aanraakt of verschuift. De worm mag niet te lang op de prikker blijven, anders kan deze uitdrogen. We zullen EMS-mutagenese demonstreren op vier tot vijf Petri-schalen van zes centimeter diameter met prisca pacificus-wormen in het derde larvale juveniele stadium.Was de wormen van elke plaat af met gebruik van twee tot drie milliliter steriele M9 per plaat. Er zouden enkele honderden wormen moeten zijn. Verzamel de wormen in een steriele wegwerpcentrifugebuis van 15 milliliter.Centrifugeer bij 1500 Gs gedurende vijf tot zeven minuten of totdat de wormen een pellet vormen. Aspireer de vloeistof en gebruik twee milliliter M9 om de wormen te resuspenderen terwijl u dubbele handschoenen draagt en in een zuurkast werkt; voeg 20 µL EMS toe aan een buisje met twee milliliter M9 en schud om het op te lossen. Voeg dit vervolgens toe aan twee milliliter wormsuspensie en draai voorzichtig rond.De uiteindelijke concentratie van EMS zal 47 millimolar zijn. Plaats de centrifugebuis met paraformaldehyde op een rocker met lage snelheid in de zuurkast en laat de wormen drie en een halve uur incuberen. Aan het einde van de incubatie van drie en een halve uur wordt de buis verticaal geplaatst en geïncubeerd totdat de wormen naar beneden zakken; aspireer vervolgens het supernatant en gooi dit weg in een bekerglas met één normale natriumhydroxide-oplossing om de EMS in het supernatant te inactiveren.Spoel uw handen telkens met 1 N natriumhydroxide voordat u ze uit de zuurkast haalt. Om het EMS te inactiveren, voegt u 5 mL M9 toe aan de wormen. Keer de buis 25 tot 30 keer om om de wormen te wassen en centrifugeer bij 1500 G gedurende 5 tot 7 minuten of tot de wormen een pellet vormen na centrifugatie; aspireer vervolgens het supernatant en gooi dit in de beker met 1 N natriumhydroxide.Herhaal deze wasstap van het toevoegen van M9, centrifugeren en het verwijderen van het supernatant ten minste drie keer. Suspendeer na de laatste wasbeurt het wormpellet in een minimale hoeveelheid M9 en pipetteer de wormsuspensie op NGM-platen met een gazon van OP 50-bacteriën. Laat de vloeistof enkele minuten drogen, waarna gezonde J4-larven worden geselecteerd en overgebracht naar vers gezaaide platen.Laat de gemuteerde wormen ongeveer acht tot 10 dagen later zelfbevruchten en gebruik een stereomicroscoop om de fenotypen van de F2-generatie te screenen op een overmaat aan mutanten van belang. Deze procedure voor mutagenese wordt gedemonstreerd met ppac pacificus-wormen van vier tot vijf Petri-schalen met een diameter van zes centimeter, verzameld in een centrifugebuis van 15 milliliter. Voeg 10 milliliter M9 toe aan het wormpellet.Keer het buisje 20 keer om om de wormen te wassen en centrifugeer 5 minuten bij 1500 Gs. Verwijder na centrifugatie het supernatant. Herhaal het wassen van de wormen met M nine in totaal drie keer; aspireer na de laatste wasbeurt de vloeistof en resuspendeer de wormen in ongeveer 10 keer hun eigen volume M nine.Voeg vervolgens 4,5,8-trimethyl-SOREIN of TMP toe vanuit een voorraadoplossing van 3 mg/mL om een eindconcentratie van 30 µg/mL te verkrijgen. Incubeer de buis met TMP 15 minuten lang in het donker bij kamertemperatuur op een rocker met een lage snelheid. Plaats de buis na de incubatie 10 minuten verticaal zodat alle wormen naar beneden zakken; in deze video wordt de buis onbedekt getoond, maar de TMP-oplossing mag niet aan licht worden blootgesteld.Omdat deze chemische stof lichtgevoelig is, dient een Pasteurpipet te worden gebruikt om de wormen van de bodem van de buis te verwijderen en over te brengen naar een onbezet NGM-plaatje. Bewaar het plaatje in het donker totdat het overtollige TMP in het plaatje is geabsorbeerd. Zodra het TMP in het plaatje is geabsorbeerd, kunnen de wormen worden behandeld met ultraviolet licht.Een van de meest kritische stappen in de TMP UV-neurogenese-procedure is het hanteren van de juiste afstand tussen de langgolvige UV-bron en de plaat. Daarom moet de afstand meerdere keren worden aangepast om de juiste intensiteit van het UV-licht op de plaat te verkrijgen. De intensiteit moet worden geregistreerd met de intensiteitsmeter en moet 500 µW/cm² bedragen.Tijdens deze stap dient een geschikte oogbescherming te worden gedragen vanwege het potentiële risico van het uv-licht. Gebruik een uv-intensiteitsmeter om de afstand tot de langgolvige uv-bron te bepalen die resulteert in een intensiteit van 500 µW/cm².Verwijder vervolgens het aluminiumfolie en het deksel en plaats de plaat met de TMP-behandelde wormen op een afstand van de lamp zodat de intensiteit op de plaat 500 µW/cm² is. Stel de plaat 50 seconden lang bloot aan de langgolvige UV-straling, sluit de plaat daarna en laat de wormen vijf uur in het donker bij kamertemperatuur rusten. Pluk na vijf uur gezonde uitziende J4-larven en breng deze over naar vers gezaaide platen.Screen tot slot de F1-, F2- of F3-generatie op fenotypes van belang met behulp van een stereomicroscoop. Hier worden enkele van de ppac pacificus-mutante fenotypes getoond die in de F2-generatie zijn geïdentificeerd na mutagenese met EMS of T-M-P-U-V. De bovenste twee panelen in deze afbeeldingen zijn voorbeelden van een wildtype hermafrodiet en een wildtype mannetje.Elke mutant heeft een kenmerkend fenotype dat gemakkelijk te onderscheiden is van het wildtype dier. Paneel C is een voorbeeld van een dumpy mutant. Paneel D toont een uncoordinated mutant en paneel E is van een transformer mutant. Eenmaal beheerst, kan de EMS-mutagenese in vier en een halve uur worden uitgevoerd, en de TMP uuv-mutagenese kan in vijf en een halve uur worden gedaan indien correct uitgevoerd.Deze tijdsperiode omvat ook de incubatietijd. Vergeet niet dat EMS en TMP extreem gevaarlijk zijn en dat er bij het werken ermee altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van een laboratoriumjas, het gebruik van dubbele handschoenen, een zuurkast en een veiligheidsbril. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

an-introduction-to-worm-lab-from-culturing-worms-to-mutagenesis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een procedure voor vloeibare-based kweken en verstrekking...

High-throughput screening &#39;en biosensing met fluorescerende C. elegans Stammen

Deze video beschrijft een techniek om een enkel nematode snel te screenen op een genetische marker door PCR-screening. In het voorbeeldprotocol screenen we op CRISPR-gebaseerde genoombewerking.

Single Worm PCR: een methode om genomisch DNA te extraheren en te versterken

C. elegans is meestal gekweekt op vaste agar platen of in vloeibare culturen bezaaid met E. coli. Om te voorkomen dat bacteriële bijproducten van verstorende toxicologische en nutritionele studies, hebben we gebruik gemaakt van een axenische vloeibaar medium, CeHR, te groeien en te synchroniseren een groot aantal wormen voor een reeks afgeleide toepassingen.

Kweken Caenorhabditis elegans In Axenische Liquid Media en Creatie van transgene Worms door bombardement met microdeeltjes

Hier presenteren we de nematode Caenorhabditis elegans als een veelzijdig hostmodel aan de studie van microbiële interactie.

De Nematode Caenorhabditis Elegans - een veelzijdig In Vivo -Model om te studeren van Host-microbe interacties

Worm-align/Worm_CP is een eenvoudige FIJI / CellProfiler workflow die kan worden gebruikt om recht te maken en uit te lijnen Caenorhabditis elegans monsters en om hele worm beeld-gebaseerde tests te scoren zonder de noodzaak van voorafgaande training stappen. We hebben Worm-align/Worm_CP toegepast op de kwantificering van warmte-shock geïnduceerde expressie bij levende dieren of lipide druppels in vaste monsters.

Worm-align en Worm_CP, Twee Open-Source Pipelines voor straightening en kwantificering van fluorescentie beeldgegevens verkregen van Caenorhabditis elegans

De genetisch trekbare nematode Caenorhabditis elegans kan worden gebruikt als een eenvoudig en goedkoop model voor het ontdekken van geneesmiddelen. Hier wordt een protocol beschreven om antikankertherapieën te identificeren die de downstream signalering van RAS- en EGFR-eiwitten remmen.

Identificatie van EGFR- en RAS-remmers met Caenorhabditis elegans

Dit protocol beschrijft een 96-well verstoring van individuele bacterieel gekoloniseerde Caenorhabditis elegans na koude verlamming en oppervlaktebleking om externe bacteriën te verwijderen. De resulterende suspensie wordt op agarplaten geplaatst om nauwkeurige kwantificering van bacteriële belasting in grote aantallen individuele wormen mogelijk te maken.

Gegevens met één worm gebruiken om heterogeniteit in caenorhabditis elegans-bacteriële interacties te kwantificeren

Compostmicrokosmos brengt de microbiële diversiteit in de natuur in het laboratorium om microbioomonderzoek in Caenorhabditis elegans te vergemakkelijken. Hier worden protocollen verstrekt voor het opzetten van microkosmosexperimenten, waarbij de experimenten het vermogen aantonen om de microbiële diversiteit van het milieu te moduleren om de relaties tussen microbiële diversiteit in het milieu en de samenstelling van het microbioom van de wormdarm te onderzoeken.

Compost microkosmos als microbieel diverse, natuurlijk-achtige omgevingen voor microbioomonderzoek in Caenorhabditis elegans

Hier wordt een geoptimaliseerd protocol gepresenteerd voor het kweken van geïsoleerde individuele nematoden op vaste media in microgefabriceerde multi-well-apparaten. Met deze aanpak kunnen individuele dieren gedurende hun hele leven worden gevolgd op een verscheidenheid aan fenotypen die verband houden met veroudering en gezondheid, waaronder activiteit, lichaamsgrootte en -vorm, bewegingsgeometrie en overleving.

Langetermijnkweek en monitoring van geïsoleerde Caenorhabditis elegans op vaste media in multiwell-apparaten

Plaatsgerichte mutagenese van hele plasmiden is een eenvoudige manier om iets verschillende varianten van een origineel plasmide te creëren. Hier laten we zien op een eenvoudige en kosteneffectieve manier om de base substituties te introduceren in een plasmide met behulp van standaard reagentia.

Homemade plaatsgerichte mutagenese van Whole Plasmids

Leer mutagenese-methoden voor genetisch onderzoek met Pristionchus pacificus. Deze technieken met EMS en TMP/UV helpen onderzoekers mutanten te genereren en genfuncties te identificeren.

Een inleiding tot Worm Lab: van kweken van Worms naar Mutagenesis

Meer video's verkennen