Geoptimaliseerd transfectie strategie voor Expressie en elektrofysiologische opname van recombinant voltage-gated ion kanalen in HEK-293T cellen

Elektrofysiologie wordt vaak gebruikt om de activiteit van recombinante spanningsafhankelijke ionkanalen in gekweekte menselijke embryonale niercellen te bestuderen. Voor een succesvolle opname is het noodzakelijk dat de cellen kanalen tot voldoende niveaus op het celmembraan tot expressie brengen voor detectie en dat de cellen op een voldoende lage celdichtheid worden geplaatst voor isolatie van individuele cellen. Het uitvoeren van celopnamen wordt vaak gehinderd door de lange incubatieperioden van 28 graden Celsius die nodig zijn voor dergelijke expressie, waarbij er typisch een verlies van celadhesie en membraanstabiliteit optreedt.

Hier wordt een geoptimaliseerde methode voor celkweek en transfectie gedemonstreerd die deze problemen omzeilt. De cellen worden getransfecteerd bij een matige co fluentie, vervolgens gedurende 28 graden Celsius geïncubeerd totdat voldoende ionkanaalexpressie is bereikt. De getransfecteerde cellen worden vervolgens op laagde dichtheid op glazen dekselglasjes geplaatst en bij 37 graden Celsius gedurende enkele uren geïncubeerd om celadhesie en membraanstabilisatie mogelijk te maken.

Eenmaal goed geplaatst, worden de cellen geïdentificeerd door co-expressie van EGFP en gehele cel patch clamp. Opnamen kunnen worden uitgevoerd of de cellen kunnen opnieuw worden geïncubeerd bij 28 graden Celsius. Om de kanaaloppervlakte-expressie verder te verhogen, geven de resultaten van opname-experimenten op cellen die zijn getransfecteerd met spanningsafhankelijke calciumkanalen, zoals L CAV één L CAV twee of L cav drie, aan dat de kanalen met succes zijn getransfecteerd en tot expressie zijn gebracht door de cellen.

Hoewel alleen representatieve resultaten voor L CAV drie worden getoond, hebben we in ons laboratorium een methode ontwikkeld om de expressie van slecht tot expressie gebrachte ionkanaalgenen voor patch clamp-opname in humane cellijnen te verbeteren. De conventionele aanpak is om de cellen eerst op de dekselglasjes te splitsen en te transfecteren met plasma CDNAs die de ionkanaalgenen bevatten, en vervolgens vele dagen bij 28 graden Celsius te incuberen om een hoge efficiënte ionkanaalexpressie te bereiken voorafgaand aan elektrofysiologisch opnemen. Onze nieuwe aanpak vermindert de vereiste incubatietijd bij 28 graden Celsius voorafgaand aan het opnemen aanzienlijk.

Door de incubatietijd van 28 graden te verminderen, stellen we vast dat celmembranen veel stabieler zijn en dat de getransfecteerde cellen veel meer aan de dekselglasjes hechten. Dit verhoogt het aantal opneembare cellen en maakt de experimenten aanzienlijk efficiënter. Splits voorafgaand aan de transfectie een volledig confluente flacon HEK 2 9 3 T-cellen, één tot vier in een nieuwe flacon van 25 vierkante centimeter en plaats de cellen in een 5% koolstofdioxide-incubator van 37 graden Celsius.

Laat de cellen drie tot vier uur aanhechten. Na vier uur onderzoeken de cellen door differentieel interferentiecontrast om de aanhechting te verifiëren. Merk op dat de cellen er niet langer rond uitzien en vervlakken. Uitsteeksels of pseudopodiën zijn zichtbaar.

Cellen met minder confluentie zouden er hetzelfde uitzien, maar verder uit elkaar geplaatst zijn. Zodra de cellen zich hebben aangehecht, combineer de benodigde reagentia om een standaard calciumfosfaattransfectie uit te voeren. Bereid in totaal 12 microgram DNA in 600 microliter transfectieoplossing per flacon.

Hier worden CDNAs van verschillende ionkanalen geklond in de P-I-R-E-S twee EGFP-plasmide. Transfectie van dit expressievector in een zoogdiercellijn resulteert in de productie van verbeterd groen fluorescerend eiwit van hetzelfde mRNA als het gekloonde insert door translatie die is gestart op een interne ribosoom-entry-plaats net stroomafwaarts van de ionkanaalcoatingsequentie en stroomopwaarts van de EGFP-coatingsequentie. Dit maakt het mogelijk om positief getransfecteerde cellen te identificeren zonder mogelijke interferentie in de eiwitfunctie die kan worden veroorzaakt door het EGFP-eiwit direct aan het eiwit van belang te fuseren.

Pipette de transfectieoplossing druppelsgewijs over de cellen, draai de flacon voorzichtig en plaats deze 's nachts in de 37 graden Celsius-incubator. Controleer de transfectie-efficiëntie door de cellen onder een fluorescentiemicroscoop te bekijken. Positief getransfecteerde cellen zouden overal groen moeten zijn.

Zodra de transfectie is bevestigd, pipetteer voorzichtig vier tot vijf milliliter warm medium in de omgekeerde flacon. Was de cellen door de flacon langzaam om te draaien zodat de celoppervlakte naar beneden ligt en de flacon te wiegen zodat de wasoplossing er voorzichtig overheen beweegt. Verwijder het medium en herhaal deze wasbeurt.

Herhaal dit nog twee keer. Voeg vervolgens zes milliliter medium toe aan de flacon en incubeer gedurende twee uur bij 37 graden Celsius. De expressie van ongewervelde ionkanalen brengt enkele uitdagingen met zich mee.

Ten eerste zijn ze vaak van grote omvang en kunnen daarom een lange tijd nodig hebben om te vertalen in het endoplasmatisch reticulum. Ook kunnen ze niet efficiënt worden gericht naar het celmembraan in een zoogdiercellijn. Ten slotte, omdat verschillende soorten verschillende codongebruikfrequenties vertonen, kunnen heterologe CDNAs hoge frequenties van codons hebben die ongebruikelijk zijn in zoogdiercellen zoals HEK 2 9 3 T om enkele van deze moeilijkheden te overwinnen.

Na de twee uur durende incubatie bij 37 graden Celsius na het wassen van de transfectie, brengt u de flacons over naar een 28 graden Celsius-incubator voor twee tot zes dagen om de expressieperiode te verlengen. De incubatietijd moet empirisch worden bepaald voor elk type ionkanaal dat wordt tot expressie gebracht. Aangezien incubatie bij 28 graden Celsius gedurende langere tijd leidt tot celafscheiding en slechte membraanstabiliteit.

Voordat elektrofysiologische studies worden uitgevoerd, is verdere celvoorbereiding nodig. Verwijder eerst het medium van de getransfecteerde cellen door één milliliter 37 graden Celsius trypsinoplossing in een omgekeerde flacon te aspireren. Draai vervolgens de flacon voorzichtig terug naar de positie met de celoppervlakte naar bene