Name: Geoptimaliseerd transfectie strategie voor Expressie en elektrofysiologische opname van recombinant voltage-gated ion kanalen in HEK-293T cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-19T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: Leer een geoptimaliseerde transfectiemethode voor elektrofysiologische opnames van recombinante voltage-afhankelijke ionkanalen in HEK-293T-cellen. Dit protocol verbetert celadhesie en membraanstabiliteit tijdens incubatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een Discovery exploitatiesubsidie ​​aan JDS van het Natural Science and Engineering Research Council (NSERC) van Canada, een NSERC Alexander Graham Bell Canada Graduate Beurzen (doctoraal) (naar A. Senatore) en de Hart en Stroke Foundation, Grant -In-Aid NA # 6284.

<ol><li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEK293+cell+line%3A+A+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> J. Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).</li>
<li>Senatore, A., Spafford, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+big+are+key+features+of+an+invertebrate+T-type+channel+%28LCav3%29+from+the+central+nervous+system+of+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transient and big are key features of an invertebrate T-type channel (LCav3) from the central nervous system of Lymnaea stagnalis.</a> Journal of Biological Chemistry. 285, 7447-7458 (2010).</li>
<li>Ogden, D., Stanfield, P. Patch clamp techniques for single channel and whole-cell recording. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOgden%2C+D+%22Microelectrode+techniques%3A+the+Plymouth+workshop+handbook%22">Microelectrode techniques: the Plymouth workshop handbook</a>. , The Company of Biologists. Cambridge. (1987).</li>
<li>Molleman, A. Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology. , John Wiley & Sons Ltd. England. (2003).</li>
<li>Peng, S. -Q., Hajela, R. K., Atchison, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+flow-induced+increase+in+inward+Ba2%2B+current+expressed+in+HEK293+cells+transiently+transfected+with+human+neuronal+L-type+Ca2%2Bchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Fluid flow-induced increase in inward Ba2+ current expressed in HEK293 cells transiently transfected with human neuronal L-type Ca2+channels.</a> Brain Research. 1045, 116-123 (2005).</li>
</ol>

In staat zijn om whole-cell stromen met behulp van de beschreven protocollen en oplossingen record geeft aan dat de transfectie succesvol was en dat het gewenste voltage-gated ion kanalen of ionkanaal complexen aanwezig zijn met aanzienlijke hoeveelheden op het celmembraan. Indien de cellen die positief worden getransfecteerd (dat wil zeggen fluorescerend groen) maar geen recordable stromingen, extra tijd bij 28 ° C kan nodig zijn om het kanaal eiwit goed worden verpakt en ingevoegd in de celmembraan. Merk op dat langdu...

<table border="1"><tr><td> Materiaal </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus Nummer </td><td> Commentaar </td></tr><tr><td> pIRES2-EGFP-plasmide </td><td> Clontech </td><td> 6029-1 </td><td></td></tr><tr><td> Cirkel dekglaasjes </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-545-80 </td><td> Cirkels nr. 1 - 0,13 tot 0.17mm dik, Size: 12mm </td></tr><tr><td> Versterker </td><td> Axon Instruments </td><td> Axopatch 200B of 700B Multiclamp </td><td></td></tr><tr><td> Data Acquisition System </td><td> Axon Instruments </td><td> Digidata 1440A </td><td></td></tr><tr><td> Elektrofysiologie Software </td><td> Axon Instruments </td><td> pClamp10.1 </td><td></td></tr><tr><td> Pipet manipulatoren </td><td> Sutter Instrument Co </td><td> MPC-385-2 </td><td></td></tr><tr><td> Epifluorescentie omkeermicroscoop </td><td> Zeiss Canada </td><td> Axiovert 40 CFL </td><td></td></tr><tr><td> Headstage </td><td> Axon Instruments </td><td> CV-7B </td><td></td></tr><tr><td> Headstage elektrode houder </td><td> Axon Instruments </td><td> 1-HL-U </td><td></td></tr><tr><td> Micro-elektrode houder voor aardelektrode </td><td> Wereld precisie-instrumenten </td><td> MEH3RF 15 </td><td></td></tr><tr><td> Elektrofysiologie capillairen </td><td> Sutter Instrument Co </td><td> BF-150-86-15 </td><td> Borosilicaatglas met een gloeidraad, OD 1.5mm, 0.86mm OD, 15cm lang </td></tr><tr><td> Flaming / Bruin Micropipet Puller </td><td> Sutter Instrument Co </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Micropipet brand polijstmachine </td><td> Narishige </td><td> Micro Forge MF-830 </td><td></td></tr><tr><td> Micro-drug perfusie-systeem </td><td> AutoMate Wetenschappelijke </td><td> SmartSquirt8 Valvelink8.2 </td><td></td></tr><tr><td> Drugs perfusie-systeem </td><td> AutoMate Wetenschappelijke </td><td> Valvelink8.2 met Teflon kleppen </td><td></td></tr></table>

geoptimaliseerd transfectie strategie voor expressie en elektrofysiologische opname van recombinant voltage-gated ion kanalen in hek-293t cellen

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

De in vitro expressie en elektrofysiologische opname van recombinant voltage-gated ionkanalen in gekweekte humane embryonale niercellen (HEK-293T) is een alomtegenwoordige onderzoeksstrategie. HEK-293T cellen moeten worden uitgeplaat op dekglaasjes bij laag genoeg dichtheid, zodat ze niet in contact met elkaar, om voor de elektrofysiologische opname mogelijk te maken zonder verstorende effecten als gevolg van contact met de aangrenzende cellen. Getransfecteerd kanalen moeten ook uitdrukken met een hoog rendement bij het plasmamembraan van whole-cell patch clamp-opname van aantoonbare stromen boven geluidsniveau. Heterologe ion kanalen vereisen vaak lange incubatieperiode bij 28 ° C na transfectie om adequate membraan expressie te bereiken, maar er zijn steeds meer verlies van cel-adhesie dekglaasje en membraan stabiliteit bij deze temperatuur. Om dit probleem te omzeilen, ontwikkelden we een optimale strategie om transfecteren en plaat HEK-293T cellen. Deze methode vereist dat de cellen worden getransfecteerd bij een relatief hoge confluentie, en geïncubeerd bij 28 ° C voor de verschillende incubatie periode post-transfectie zodat er passende ionkanaal eiwit expressie. Getransfecteerde cellen worden daarna uitgeplaat op dekglaasjes en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende enkele uren, die zorgt voor stijve cel gehechtheid aan de dekglaasjes en membraan restabilization. Cellen kunnen worden opgenomen kort na plateren, of kan worden overgedragen aan 28 ° C voor verdere incubatie. We vinden dat de eerste incubatie bij 28 ° C, na transfectie maar voor plating, is de sleutel voor de efficiënte expressie van heterologe ion kanalen die normaal gesproken niet goed te spreken over de plasmamembraan. Positief getransfecteerde, zijn gekweekte cellen geïdentificeerd door co-expressie eGFP of eGFP uiting van een bicistronische vector (bijv. pIRES2-EGFP) die de recombinante ionkanaal cDNA net stroomopwaarts van een interne ribosoom entry site en een eGFP coderende sequentie. Whole-cell patch clamp opname vereist gespecialiseerde apparatuur, plus het vervaardigen van gepolijste registrerende elektroden en L-vormige massa-elektroden van borosilicaatglas. Drug delivery van de farmacologie van ionen kanalen studie kan worden bereikt door direct micropipetting drugs in de opname gerecht, of door gebruik te maken microperfusion of zwaartekracht stroom systemen die een ononderbroken stromen van het geneesmiddel oplossing productie van meer dan opgenomen cellen.

Betrouwbare methode voor zeer efficiënte<em&gt; In vitro</em&gt; Expressie en de daaropvolgende elektrofysiologische opname van recombinant voltage-gated ionkanalen in gekweekte humane embryonale niercellen (HEK-293T).

Geoptimaliseerd transfectie strategie voor Expressie en elektrofysiologische opname van recombinant voltage-gated ion kanalen in HEK-293T cellen

De in vitro expressie en elektrofysiologische registratie van recombinante spanningsafhankelijke ionkanalen in gekweekte menselijke embryonale niercellen (HEK-293T) ...

Elektrofysiologie wordt veelvuldig gebruikt om de activiteit van recombinante spanningsafhankelijke ionkanalen in gecultiveerde menselijke embryonale niercellen te bestuderen. Voor een succesvolle registratie is het vereist dat de cellen kanalen in voldoende mate in het celmembraan tot expressie brengen voor detectie, en dat de cellen met een lage genoeg celdichtheid worden gezaaid om individuele cellen te kunnen isoleren. Het uitvoeren van celregistraties wordt vaak bemoeilijkt door de lange incubatieperioden bij 28 °C die nodig zijn voor deze expressie, waarbij doorgaans een verlies van celadhesie en membraanstabiliteit optreedt.Hier wordt een geoptimaliseerde methode voor celkweek en transfectie gedemonstreerd die deze problemen omzeilt. De cellen worden getransfecteerd bij een matige confluentie en vervolgens geïncubeerd bij 28 °C totdat een adequate expressie van de ionkanalen is bereikt. De getransfecteerde cellen worden vervolgens bij een lage dichtheid op glazen dekglasjes geplaatst en gedurende enkele uren geïncubeerd bij 37 °C om celadhesie en membraanstabilisatie mogelijk te maken.Zodra ze op de juiste wijze zijn uitgeplaat, worden de cellen geïdentificeerd op basis van

optimized-transfection-strategy-for-expression-electrophysiological

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We zullen zien hoe het effect van een enkele puntmutatie op de functie van een ionkanaal studie.

Mutagenese en Functionele analyse van ionenkanalen heteroloog Uitgedrukt in zoogdiercellen

Hier beschreven is een procedure voor het verkrijgen van lange stukken huidige opname van een ionkanaal met de cel-bijgevoegde patch-clamp techniek. Deze methode maakt het mogelijk voor het observeren, in real time, het patroon van open-close kanaal conformaties dat de biologische signaal ten grondslag liggen. Deze gegevens informeren over kanaal woningen in ongestoord biologische membranen.

Eenkanaals-Cell bevestigd Patch-clamp-opname

De expressie van recombinante eiwitten door zoogdiersystemen wordt een aantrekkelijke methode voor het produceren van eiwitcomplexen voor structurele biologie. Hier presenteren we een eenvoudig maar zeer efficiënt expressiesysteem dat gebruik maakt van in suspensie gekweekte zoogdiercellen om eiwitcomplexen te zuiveren voor structurele studies.

Recombinante eiwitexpressie voor Structurele Biologie in HEK 293F Suspension cellen: een nieuwe en toegankelijke aanpak

Een methode voor het afbeelden van veranderingen in membraanpotentiaal met behulp van genetisch gecodeerde spanningsindicatoren wordt beschreven.

Imaging Membraan Potentiële twee soorten genetisch gecodeerde Fluorescent Voltage Sensors

De productie op laboratoriumschaal van eukaryote eiwitten met passende post-translationele modificatie vormt een belangrijke barrière. Hier is een robuust protocol met snelle implementatie en doorlooptijd voor eiwitexpressie met behulp van een zoogdier-expressiesysteem. Dit systeem ondersteunt selectieve aminozuren, selectieve markering van eiwitten en kleine moleculaire modulatoren van glyconsamenstelling.

High Yield Expressie van recombinante humane eiwitten met de Transient Transfectie van HEK293 cellen in suspensie

Het bestuderen van ionkanalen via een heteroloog tot expressie brengen systeem is uitgegroeid tot een kern techniek in het biomedisch onderzoek. In dit manuscript presenteren we een tijd efficiënte methode om strak ionkanaal expressie te komen door het uitvoeren transiënte transfectie onder controle van een induceerbare promoter.

Controleerbaar Ion Channel Expression door middel Induceerbare tijdelijke transfectie

Nieuwe therapeutische strategieën in cardiale regeneratieve geneeskunde vereisen uitgebreide en gedetailleerde studies in grote preklinische diermodellen voordat zij kunnen worden beschouwd voor gebruik bij de mens. We laten hier zien een percutane contrast echocardiografie geleide intramyocardial injectietechniek bij konijnen, die is waardevol voor de hypothese testen van de werkzaamheid van dergelijke nieuwe therapieën.

Percutane Contrast echocardiografie geleide Intramyocardial injectie en cel levering in een grote preklinische Model

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor eencellige elektroporatie dat genen kan leveren in zowel excitatory als remmende neuronen in een reeks in vitro hippocampale slice-cultuurleeftijden. Onze aanpak zorgt voor een nauwkeurige en efficiënte expressie van genen in individuele cellen, die kunnen worden gebruikt om cel-autonome en intercellulaire functies te onderzoeken.

Eencellige elektroporatie over verschillende organotypische slicecultuur van hippocampale excitatory en klassespecifieke remmende neuronen

Met behulp van het goedkope kationische polymeer polyethylenimine (PEI) produceerden we lentivirale deeltjes voor stabiele expressie van shRNA's in H9 menselijke embryonale stamcellen (hESCs) en transiënt getransduceerde H9-afgeleide neurale voorlopercellen (NPC's) met een hoge efficiëntie.

Lentivirale gemedieerde levering van shRNA's aan hESCs en NPC's met behulp van goedkope kationische polymeerpolyethylenimine (PEI)

Recombinant adeno-geassocieerd virus (rAAV) wordt veel gebruikt voor klinische en preklinische genafgifte. Een ondergewaardeerd gebruik van rAAV's is de robuuste transductie van gekweekte cellen zonder dat zuivering nodig is. Voor onderzoekers die nieuw zijn op het gebied van rAAV, bieden we een protocol voor het klonen van transgencassettes, de productie van ruwe vectoren en de transductie van celculturen.

Transgenexpressie in gekweekte cellen met behulp van ongezuiverde recombinante adeno-geassocieerde virale vectoren

Voor het bestuderen van reacties van exciteerbare cellen in vitro, beschrijft het protocol optische monitoring van veranderingen in het genereren van actiepotentiaal als gevolg van elektroporatie op een eenvoudig exciteerbaar celmodel van genetisch gemanipuleerde tet-on spiking HEK-cellen, evenals veranderingen in transmembraanspanning met geautomatiseerde extractie van relevante parameters.

Monitoring van door elektroporatie geïnduceerde veranderingen in het genereren van actiepotentieel in genetisch gemanipuleerde Tet-On Spiking HEK-cellen

Leer een geoptimaliseerde transfectiemethode voor elektrofysiologische opnames van recombinante voltage-afhankelijke ionkanalen in HEK-293T-cellen. Dit protocol verbetert celadhesie en membraanstabiliteit tijdens incubatie.

Geoptimaliseerd transfectie strategie voor Expressie en elektrofysiologische opname van recombinant voltage-gated ion kanalen in HEK-293T cellen (Video) | JoVE Journal

Geoptimaliseerd transfectie strategie voor Expressie en elektrofysiologische opname van recombinant voltage-gated ion kanalen in HEK-293T cellen

Meer video's verkennen