Name: Geoptimaliseerd transfectie strategie voor Expressie en elektrofysiologische opname van recombinant voltage-gated ion kanalen in HEK-293T cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-19T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: Leer een geoptimaliseerde transfectiemethode voor elektrofysiologische opnames van recombinante voltage-afhankelijke ionkanalen in HEK-293T-cellen. Dit protocol verbetert celadhesie en membraanstabiliteit tijdens incubatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een Discovery exploitatiesubsidie ​​aan JDS van het Natural Science and Engineering Research Council (NSERC) van Canada, een NSERC Alexander Graham Bell Canada Graduate Beurzen (doctoraal) (naar A. Senatore) en de Hart en Stroke Foundation, Grant -In-Aid NA # 6284.

<ol><li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEK293+cell+line%3A+A+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> J. Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).</li>
<li>Senatore, A., Spafford, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+big+are+key+features+of+an+invertebrate+T-type+channel+%28LCav3%29+from+the+central+nervous+system+of+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transient and big are key features of an invertebrate T-type channel (LCav3) from the central nervous system of Lymnaea stagnalis.</a> Journal of Biological Chemistry. 285, 7447-7458 (2010).</li>
<li>Ogden, D., Stanfield, P. Patch clamp techniques for single channel and whole-cell recording. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOgden%2C+D+%22Microelectrode+techniques%3A+the+Plymouth+workshop+handbook%22">Microelectrode techniques: the Plymouth workshop handbook</a>. , The Company of Biologists. Cambridge. (1987).</li>
<li>Molleman, A. Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology. , John Wiley & Sons Ltd. England. (2003).</li>
<li>Peng, S. -Q., Hajela, R. K., Atchison, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+flow-induced+increase+in+inward+Ba2%2B+current+expressed+in+HEK293+cells+transiently+transfected+with+human+neuronal+L-type+Ca2%2Bchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Fluid flow-induced increase in inward Ba2+ current expressed in HEK293 cells transiently transfected with human neuronal L-type Ca2+channels.</a> Brain Research. 1045, 116-123 (2005).</li>
</ol>

In staat zijn om whole-cell stromen met behulp van de beschreven protocollen en oplossingen record geeft aan dat de transfectie succesvol was en dat het gewenste voltage-gated ion kanalen of ionkanaal complexen aanwezig zijn met aanzienlijke hoeveelheden op het celmembraan. Indien de cellen die positief worden getransfecteerd (dat wil zeggen fluorescerend groen) maar geen recordable stromingen, extra tijd bij 28 ° C kan nodig zijn om het kanaal eiwit goed worden verpakt en ingevoegd in de celmembraan. Merk op dat langdu...

<table border="1"><tr><td> Materiaal </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus Nummer </td><td> Commentaar </td></tr><tr><td> pIRES2-EGFP-plasmide </td><td> Clontech </td><td> 6029-1 </td><td></td></tr><tr><td> Cirkel dekglaasjes </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-545-80 </td><td> Cirkels nr. 1 - 0,13 tot 0.17mm dik, Size: 12mm </td></tr><tr><td> Versterker </td><td> Axon Instruments </td><td> Axopatch 200B of 700B Multiclamp </td><td></td></tr><tr><td> Data Acquisition System </td><td> Axon Instruments </td><td> Digidata 1440A </td><td></td></tr><tr><td> Elektrofysiologie Software </td><td> Axon Instruments </td><td> pClamp10.1 </td><td></td></tr><tr><td> Pipet manipulatoren </td><td> Sutter Instrument Co </td><td> MPC-385-2 </td><td></td></tr><tr><td> Epifluorescentie omkeermicroscoop </td><td> Zeiss Canada </td><td> Axiovert 40 CFL </td><td></td></tr><tr><td> Headstage </td><td> Axon Instruments </td><td> CV-7B </td><td></td></tr><tr><td> Headstage elektrode houder </td><td> Axon Instruments </td><td> 1-HL-U </td><td></td></tr><tr><td> Micro-elektrode houder voor aardelektrode </td><td> Wereld precisie-instrumenten </td><td> MEH3RF 15 </td><td></td></tr><tr><td> Elektrofysiologie capillairen </td><td> Sutter Instrument Co </td><td> BF-150-86-15 </td><td> Borosilicaatglas met een gloeidraad, OD 1.5mm, 0.86mm OD, 15cm lang </td></tr><tr><td> Flaming / Bruin Micropipet Puller </td><td> Sutter Instrument Co </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Micropipet brand polijstmachine </td><td> Narishige </td><td> Micro Forge MF-830 </td><td></td></tr><tr><td> Micro-drug perfusie-systeem </td><td> AutoMate Wetenschappelijke </td><td> SmartSquirt8 Valvelink8.2 </td><td></td></tr><tr><td> Drugs perfusie-systeem </td><td> AutoMate Wetenschappelijke </td><td> Valvelink8.2 met Teflon kleppen </td><td></td></tr></table>

geoptimaliseerd transfectie strategie voor expressie en elektrofysiologische opname van recombinant voltage-gated ion kanalen in hek-293t cellen

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

De in vitro expressie en elektrofysiologische opname van recombinant voltage-gated ionkanalen in gekweekte humane embryonale niercellen (HEK-293T) is een alomtegenwoordige onderzoeksstrategie. HEK-293T cellen moeten worden uitgeplaat op dekglaasjes bij laag genoeg dichtheid, zodat ze niet in contact met elkaar, om voor de elektrofysiologische opname mogelijk te maken zonder verstorende effecten als gevolg van contact met de aangrenzende cellen. Getransfecteerd kanalen moeten ook uitdrukken met een hoog rendement bij het plasmamembraan van whole-cell patch clamp-opname van aantoonbare stromen boven geluidsniveau. Heterologe ion kanalen vereisen vaak lange incubatieperiode bij 28 ° C na transfectie om adequate membraan expressie te bereiken, maar er zijn steeds meer verlies van cel-adhesie dekglaasje en membraan stabiliteit bij deze temperatuur. Om dit probleem te omzeilen, ontwikkelden we een optimale strategie om transfecteren en plaat HEK-293T cellen. Deze methode vereist dat de cellen worden getransfecteerd bij een relatief hoge confluentie, en geïncubeerd bij 28 ° C voor de verschillende incubatie periode post-transfectie zodat er passende ionkanaal eiwit expressie. Getransfecteerde cellen worden daarna uitgeplaat op dekglaasjes en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende enkele uren, die zorgt voor stijve cel gehechtheid aan de dekglaasjes en membraan restabilization. Cellen kunnen worden opgenomen kort na plateren, of kan worden overgedragen aan 28 ° C voor verdere incubatie. We vinden dat de eerste incubatie bij 28 ° C, na transfectie maar voor plating, is de sleutel voor de efficiënte expressie van heterologe ion kanalen die normaal gesproken niet goed te spreken over de plasmamembraan. Positief getransfecteerde, zijn gekweekte cellen geïdentificeerd door co-expressie eGFP of eGFP uiting van een bicistronische vector (bijv. pIRES2-EGFP) die de recombinante ionkanaal cDNA net stroomopwaarts van een interne ribosoom entry site en een eGFP coderende sequentie. Whole-cell patch clamp opname vereist gespecialiseerde apparatuur, plus het vervaardigen van gepolijste registrerende elektroden en L-vormige massa-elektroden van borosilicaatglas. Drug delivery van de farmacologie van ionen kanalen studie kan worden bereikt door direct micropipetting drugs in de opname gerecht, of door gebruik te maken microperfusion of zwaartekracht stroom systemen die een ononderbroken stromen van het geneesmiddel oplossing productie van meer dan opgenomen cellen.

Betrouwbare methode voor zeer efficiënte<em&gt; In vitro</em&gt; Expressie en de daaropvolgende elektrofysiologische opname van recombinant voltage-gated ionkanalen in gekweekte humane embryonale niercellen (HEK-293T).

Geoptimaliseerd transfectie strategie voor Expressie en elektrofysiologische opname van recombinant voltage-gated ion kanalen in HEK-293T cellen

De in vitro expressie en elektrofysiologische registratie van recombinante spanningsafhankelijke ionkanalen in gekweekte menselijke embryonale niercellen (HEK-293T) ...

Elektrofysiologie wordt veelvuldig gebruikt om de activiteit van recombinante spanningsafhankelijke ionkanalen in gecultiveerde menselijke embryonale niercellen te bestuderen. Voor een succesvolle registratie is het vereist dat de cellen kanalen in voldoende mate in het celmembraan tot expressie brengen voor detectie, en dat de cellen met een lage genoeg celdichtheid worden gezaaid om individuele cellen te kunnen isoleren. Het uitvoeren van celregistraties wordt vaak bemoeilijkt door de lange incubatieperioden bij 28 °C die nodig zijn voor deze expressie, waarbij doorgaans een verlies van celadhesie en membraanstabiliteit optreedt.Hier wordt een geoptimaliseerde methode voor celkweek en transfectie gedemonstreerd die deze problemen omzeilt. De cellen worden getransfecteerd bij een matige confluentie en vervolgens geïncubeerd bij 28 °C totdat een adequate expressie van de ionkanalen is bereikt. De getransfecteerde cellen worden vervolgens bij een lage dichtheid op glazen dekglasjes geplaatst en gedurende enkele uren geïncubeerd bij 37 °C om celadhesie en membraanstabilisatie mogelijk te maken.Zodra ze op de juiste wijze zijn uitgeplaat, worden de cellen geïdentificeerd op basis van co-expressie van EGFP en whole-cell patchclamp. De opname kan worden uitgevoerd of de cellen kunnen opnieuw worden geïncubeerd bij 28 °C. Om de expressie van kanalen op het celoppervlak verder te verhogen, tonen resultaten van opname-experimenten op cellen die zijn getransfecteerd met spanningsafhankelijke calciumkanalen, zoals L CAV 1, L CAV 2 of L cav 3, aan dat de kanalen succesvol zijn getransfecteerd en tot expressie zijn gebracht door de cellen.Hoewel er slechts representatieve resultaten voor L CAV drie worden getoond, hebben we in ons laboratorium een methode ontwikkeld om de expressie van ionkanaalgenen met een lage expressie te verbeteren voor patch-clampmetingen in menselijke cellijnen. De conventionele aanpak is momenteel om de cellen eerst op dekglasplaatjes uit te plaattsen en te transfecteren met plasma CDNAs die de ionkanaalgen bevatten, om vervolgens meerdere dagen bij 28 °C te incuberen om een hoogefficiënte ionkanaalexpressie te bereiken voorafgaand aan de elektrofysiologische meting. Onze nieuwe aanpak vermindert de benodigde incubatietijd bij 28 °C vóór de meting aanzienlijk.Door de incubatietijd van 28 °C te verkorten, stellen we vast dat celmembranen veel stabieler zijn en de getransfecteerde cellen veel beter hechten aan de dekglasjes. Dit verhoogt het aantal registreerbare cellen en maakt de experimenten aanzienlijk efficiënter. Splits vóór de transfectie een volledig confluente kolf met HEK 2 9 3 T-cellen in een verhouding van één op vier over naar een nieuwe kolf van 25 cm², en plaats de cellen in een incubator op 37 °C met 5% CO2.Laat de cellen drie tot vier uur hechten; onderzoek de cellen na vier uur met differentieel interferentiecontrast om de hechting te verifiëren. Let op dat de cellen niet langer rond zijn en zich afplatten. Extensies of pseudopodia zijn zichtbaar.Cellen met een lagere confluentie zien er hetzelfde uit, maar liggen verder uit elkaar. Zodra de cellen zijn gehecht, combineert u de benodigde reagentia om een standaard calciumfosfaat-transfectie uit te voeren. Bereid in totaal 12 micrograms DNA voor in 600 microliters transfectieoplossing per kolf.Hier worden cDNA's van diverse ionkanalen gekloond in het P-I-R-E-S twee EGFP-plasmide. Transfectie van deze expressievector in een zoogdiercellijn resulteert in de productie van enhanced green fluorescent protein uit hetzelfde mRNA als het gekloonde insert, via translatie die wordt geïnitieerd bij een interne ribosoom-entrysite stroomafwaarts van de coderende sequentie van het ionkanaal en stroomopwaarts van de coderende sequentie van het EGFP. Hierdoor kunnen positief getransfecteerde cellen worden geïdentificeerd zonder mogelijke interferentie in de eiwitfunctie die veroorzaakt zou kunnen worden door het EGFP-eiwit direct te fuseren aan het eiwit van interesse.Pipetteer de transfectie-oplossing druppelsgewijs over de cellen, draai vervolgens voorzichtig met de fles en plaats deze gedurende de nacht in de incubator van 37 °C. Controleer de transfectie-efficiëntie door de cellen onder een fluorescentiemicroscoop te bekijken. Positief getransfecteerde cellen moeten over de gehele cel groen kleuren.Zodra de transfectie is geverifieerd, pipetteer voorzichtig vier tot vijf milliliter warm medium in de omgekeerde kolf. Was de cellen door de kolf langzaam om te draaien zodat het celoppervlak naar beneden wijst en de kolf voorzichtig te schudden zodat de wasoplossing zachtjes over de cellen beweegt. Verwijder het medium en herhaal deze wasstap.Stap nog twee keer. Voeg vervolgens zes milliliters medium toe aan de kolf en incubeer gedurende twee uur bij 37 °C. De expressie van ionkanalen van ongewervelden brengt enkele uitdagingen met zich mee.Ten eerste zijn ze vaak groot en kan de translatie aan het endoplasmatisch reticulum daarom lang duren. Daarnaast worden ze mogelijk niet efficiënt naar het celmembraan getransporteerd in een zoogdiercellijn. Ten slotte kunnen heterologe CDNAs, aangezien verschillende soorten variërende frequenties in codongebruik vertonen, een hoge frequentie bevatten van codons die ongebruikelijk zijn in zoogdiercellen zoals HEK 2 9 3 T, om sommige van deze moeilijkheden te overwinnen.Na de incubatie van twee uur bij 37 °C na het wassen van het transfectieproduct, worden de flessen voor twee tot zes dagen overgebracht naar een incubator van 28 °C om de expressieperiode te verlengen. De incubatietijd moet empirisch worden bepaald voor elk type ionkanaal dat tot expressie wordt gebracht, aangezien incubatie bij 28 °C gedurende langere perioden leidt tot celdetachement en een slechte membraanstabiliteit.Verdere celvoorbereiding is nodig voorafgaand aan het uitvoeren van elektrofysiologische studies. Verwijder eerst het medium van de getransfecteerde cellen met een aspiratiepipet en voeg één milliliter trypsine-oplossing van 37 °C toe aan een omgekeerde kolf. Zet de kolf vervolgens voorzichtig terug in de positie waarbij het oppervlak van de cellen naar beneden is gericht, zodat de trypsine zachtjes over de cellen kan stromen.Zet de kolf terug en verwijder de trypsine. Voeg vervolgens 250 µL warme trypsine direct op de cellen toe en incubeer gedurende drie tot vijf minuten bij 37 °C totdat de cellen loslaten. Plaats ondertussen drie tot acht met poly-L-lysine gecoate dekglasjes in een kweekschaal van 60 mm en voeg 5 mL warm kweekmedium toe.Zodra de cellen zijn losgekoppeld, worden ze door ongeveer zes keer op en neer pipetteren gesuspendeerd in vier milliliter warm medium. Druk vervolgens met de punt van de micropipet op de dekglasjes om er zeker van te zijn dat ze zich onderin de schaal bevinden. Voeg daarna 250 tot 500 µL van de geresuspendeerde cellen toe. Incubeer de cellen gedurende drie uur bij 37 °C om ze te laten hechten aan de dekglasjes.Het te lang laten staan van de cellen bij 37 °C zal leiden tot celdeling en verdunning van de getransfecteerde plasmiden. De getransfecteerde cellen moeten worden uitgeplaats met een voldoende lage dichtheid, zodat ze van elkaar geïsoleerd zijn zoals hier getoond. Dit zal de elektrofysiologische registratie vergemakkelijken.Voor cellen die hulp-subunits vereisen, is het vaak noodzakelijk om de cellen over te brengen naar 28 °C en deze nog drie tot vier dagen te incuberen voordat de elektrofysiologische registratie plaatsvindt. Voor cellen die geen hulp-subunits vereisen, kan de registratie direct na deze incubatie worden uitgevoerd.De hier gebruikte elektrofysiologische opstelling omvat een versterker, gemotoriseerde dubbele pipetmanipulatoren, een epifluorescentiemicroscoop en perfusiesystemen. De apparatuur is gemonteerd op een trillingsisolatetafel. Elektrische ruis wordt beperkt door een 40 inch hoge type twee Faraday-kooi. De elektronische controlesystemen omvatten een pc uitgerust met een Digitidata 1440, een analoog-digitaal converterinterface in samenhang met pClamp 10.1-software.De monitorversterker van de computer, de gemotoriseerde manipulator en een profusiecontrolesysteem met klepkoppelingen zijn allemaal buiten de kooi van Faraday gemonteerd. Op een vrijstaand metalen elektrisch rek van 19 inch is alle elektrische apparatuur geaard via een koperen verdeelstrip en aangesloten op een isolatietransformator van medische kwaliteit, die zorgt voor lijnisolatie, een consistente aarding en piekspanningsonderdrukking. Bereid de experimenten voor door vuurgepolijste micropipetten met een weerstand van twee tot vijf mega ohm te monteren op de micropipetthouder op de headstage.De patchpipetten worden gevuld met de interne oplossing; tik tegen de pipetten om luchtbellen te verwijderen en monteer ze vervolgens op de headstage. Gebruik daarna een pincet om één dekglas met geplaatste cellen over te brengen naar een plastic Petrischaal van 35 millimeter die drie milliliter externe registreeroplossing op kamertemperatuur bevat. Het volume van de registreeroplossing moet nauwkeurig worden gemeten bij het uitvoeren van drugexperimenten waarbij bekende hoeveelheden van een drug met een micropipet aan de schaal worden toegevoegd; plaats de schaal vervolgens op de microscooptafel.Vul vervolgens een halfcel van een micro-elektrodehouder met drie molair cesiumchloride. Plaats daarna de referentie-elektrode in de halfcel en positioneer de maselektrode in het bad met behulp van de micromanipulator; breng de patchpipet naar beneden in de badoplossing. Visualiseer de cellen in fluorescentiemodus en centreer een geïsoleerde, positief getransfecteerde, adherente groene cel in het midden van het gezichtsveld.Breng de patchpipet in badmodus dicht bij de cel. Zet de vierkantsgolf-curve die op het computerscherm wordt weergegeven op nul. Pas de positie van de patchpipet aan zodat deze de cel net raakt en de vierkantsgolf-stroomcurve op het scherm begint te fluctueren.Pas een zachte zuiging toe met een aangesloten spuit tot er een giga-ohm seal is gevormd. Zodra een giga-ohm seal is bereikt, schakelt u het programma over naar de patch-modus. Pas een korte zuigpuls toe met de spuit om door het celmembraan te breken.Schakel vervolgens over naar de celmodus en gebruik de celparameters op de versterker. Om de capacitieve transient te compenseren, is het noodzakelijk om de patch te equilibreren, zodat de intracellulaire registratie-oplossing kan dialyseren in de gepatchte cel. Voer hier de voltage-clamp-protocollen in die voor dit experiment zijn geschreven.De experimentator heeft een protocol ontworpen om ionenstromen door spanningsafhankelijke ionkanalen te meten die ontstaan wanneer de spanning over het celmembraan wordt gemoduleerd. In dit geval kijken we naar een IV-protocol waarbij de software de cel op minus 110 millivolt houdt en vervolgens een stap zet naar minus 70 millivolt voor 250 milliseconden. Daarna volgt een terugkeer naar het rustpotentiaal van minus 110 millivolt, waarbij elke volgende stap met 10 millivolt toeneemt, zodat de stappen naar minus 70 millivolt, minus 60 millivolt, enzovoort gaan, totdat de laatste stap naar plus 20 millivolt is.Filter de geregistreerde stromingen bij 10 kilohertz met een Lowpass Bessel-filter op de versterker en digitaliseer bij een bemonsteringsfrequentie van twee kilohertz met de clamp X 10.1-software; gebruik alleen registraties met een minimale lekkage van minder dan 10%. Voor de analyse werden HEK 2 93 T-cellen gekweekt en getransfecteerd met L Cav. Drie calciumkanalen, zoals hier getoond. Succesvolle transfectie van heterologe ionkanaal-cDNA's werd aangetoond door fluorescentie gegenereerd vanuit de P-I-R-E-S twee eeg FP-vector.Hier tonen we de succesvolle expressie van een cav3-spanningsafhankelijk calciumkanaal uit een ongewervelde. Wanneer cellen niet zijn getransfecteerd, kunnen er geen calciumstromen worden opgewekt. Getransfecteerde cellen genereren daarentegen grote stromen wanneer whole-cell voltage-clamp-protocollen op de cellen worden toegepast.Experimentatoren kunnen verschillende elektrofysiologische condities en data-analyseregimes gebruiken, afhankelijk van hun vereisten. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om uw eigen oordeel te gebruiken met betrekking tot de timing van de experimenten. Aangezien verschillende kanalen met verschillende efficiënties in het celmembraan worden tot expressie gebracht, is het aan u om de optimale strategie te bepalen om zowel de levensvatbaarheid van de cellen te verhogen als de oppervlakte-expressie van de kanalen waarin u geïnteresseerd bent te maximaliseren.Na het bekijken van deze video hopen we dat u een goed inzicht heeft gekregen in het cultiveren en onderhouden van een menselijke cellijn, evenals in het transfecteren van heterologe ionkanaal-cDNA's en subunit-cDNA's in deze cellen voor elektrofysiologische registraties.

optimized-transfection-strategy-for-expression-electrophysiological

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We zullen zien hoe het effect van een enkele puntmutatie op de functie van een ionkanaal studie.

Mutagenese en Functionele analyse van ionenkanalen heteroloog Uitgedrukt in zoogdiercellen

Hier beschreven is een procedure voor het verkrijgen van lange stukken huidige opname van een ionkanaal met de cel-bijgevoegde patch-clamp techniek. Deze methode maakt het mogelijk voor het observeren, in real time, het patroon van open-close kanaal conformaties dat de biologische signaal ten grondslag liggen. Deze gegevens informeren over kanaal woningen in ongestoord biologische membranen.

Eenkanaals-Cell bevestigd Patch-clamp-opname

De expressie van recombinante eiwitten door zoogdiersystemen wordt een aantrekkelijke methode voor het produceren van eiwitcomplexen voor structurele biologie. Hier presenteren we een eenvoudig maar zeer efficiënt expressiesysteem dat gebruik maakt van in suspensie gekweekte zoogdiercellen om eiwitcomplexen te zuiveren voor structurele studies.

Recombinante eiwitexpressie voor Structurele Biologie in HEK 293F Suspension cellen: een nieuwe en toegankelijke aanpak

De moleculaire mechanismen die de coördinatie van de vorming van remmende GABA-erge synapsen tijdens ontogenie zijn grotendeels onbekend. Om deze processen te onderzoeken, hebben we een co-cultuurmodel systeem dat embryonale medium stekelige GABAerge neuronen samen gekweekt met stabiel getransfecteerde humane embryonale nier 293 (HEK293) cellen die functionele GABAA-receptoren omvat ontwikkeld.

Remmende Synapse Formation in een co-cultuur model Integratie GABAergic Medium Maxomys Neuronen en HEK293 cellen die stabiel GABA A Receptoren

Een methode voor het afbeelden van veranderingen in membraanpotentiaal met behulp van genetisch gecodeerde spanningsindicatoren wordt beschreven.

Imaging Membraan Potentiële twee soorten genetisch gecodeerde Fluorescent Voltage Sensors

De productie op laboratoriumschaal van eukaryote eiwitten met passende post-translationele modificatie vormt een belangrijke barrière. Hier is een robuust protocol met snelle implementatie en doorlooptijd voor eiwitexpressie met behulp van een zoogdier-expressiesysteem. Dit systeem ondersteunt selectieve aminozuren, selectieve markering van eiwitten en kleine moleculaire modulatoren van glyconsamenstelling.

High Yield Expressie van recombinante humane eiwitten met de Transient Transfectie van HEK293 cellen in suspensie

Het bestuderen van ionkanalen via een heteroloog tot expressie brengen systeem is uitgegroeid tot een kern techniek in het biomedisch onderzoek. In dit manuscript presenteren we een tijd efficiënte methode om strak ionkanaal expressie te komen door het uitvoeren transiënte transfectie onder controle van een induceerbare promoter.

Controleerbaar Ion Channel Expression door middel Induceerbare tijdelijke transfectie

Nieuwe therapeutische strategieën in cardiale regeneratieve geneeskunde vereisen uitgebreide en gedetailleerde studies in grote preklinische diermodellen voordat zij kunnen worden beschouwd voor gebruik bij de mens. We laten hier zien een percutane contrast echocardiografie geleide intramyocardial injectietechniek bij konijnen, die is waardevol voor de hypothese testen van de werkzaamheid van dergelijke nieuwe therapieën.

Percutane Contrast echocardiografie geleide Intramyocardial injectie en cel levering in een grote preklinische Model

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor eencellige elektroporatie dat genen kan leveren in zowel excitatory als remmende neuronen in een reeks in vitro hippocampale slice-cultuurleeftijden. Onze aanpak zorgt voor een nauwkeurige en efficiënte expressie van genen in individuele cellen, die kunnen worden gebruikt om cel-autonome en intercellulaire functies te onderzoeken.

Eencellige elektroporatie over verschillende organotypische slicecultuur van hippocampale excitatory en klassespecifieke remmende neuronen

Met behulp van het goedkope kationische polymeer polyethylenimine (PEI) produceerden we lentivirale deeltjes voor stabiele expressie van shRNA's in H9 menselijke embryonale stamcellen (hESCs) en transiënt getransduceerde H9-afgeleide neurale voorlopercellen (NPC's) met een hoge efficiëntie.

Lentivirale gemedieerde levering van shRNA's aan hESCs en NPC's met behulp van goedkope kationische polymeerpolyethylenimine (PEI)

Voor het bestuderen van reacties van exciteerbare cellen in vitro, beschrijft het protocol optische monitoring van veranderingen in het genereren van actiepotentiaal als gevolg van elektroporatie op een eenvoudig exciteerbaar celmodel van genetisch gemanipuleerde tet-on spiking HEK-cellen, evenals veranderingen in transmembraanspanning met geautomatiseerde extractie van relevante parameters.

Monitoring van door elektroporatie geïnduceerde veranderingen in het genereren van actiepotentieel in genetisch gemanipuleerde Tet-On Spiking HEK-cellen

Leer een geoptimaliseerde transfectiemethode voor elektrofysiologische opnames van recombinante voltage-afhankelijke ionkanalen in HEK-293T-cellen. Dit protocol verbetert celadhesie en membraanstabiliteit tijdens incubatie.

Geoptimaliseerd transfectie strategie voor Expressie en elektrofysiologische opname van recombinant voltage-gated ion kanalen in HEK-293T cellen (Video) | JoVE Journal

Geoptimaliseerd transfectie strategie voor Expressie en elektrofysiologische opname van recombinant voltage-gated ion kanalen in HEK-293T cellen

Meer video's verkennen