Name: Real-time beeldvorming van leukotriënen B 4 Mediated Cel Migratie en BLT1 Interacties met β-arrestine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 45 s
Description: Leer real-time beeldvorming van leukocytenmigratie naar leukotrieen B4 met behulp van levende celtechnieken. Deze methode onthult receptorinteracties met β-arrestine voor inflammatoire ziekteonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het onderzoek wordt ondersteund door National Institutes of Health beurzen AI-52381, CA138623 en Kentucky Lung Cancer Research Board en institutionele steun van James Graham Brown Cancer Center.

Methodologie Beschrijving van de microscoop Live-cell imaging experimenten uitgevoerd met behulp van TE-FM Epi-fluorescentie systeem aan Nikon omkeermicroscoop Eclipse TE300. De microscoop uitgerust met verwarming podium. Een koele snap HQ digitale Z / W CCD (Roper Scientific) camera en Lamda 10-2 optische filter-wisselaar (Sutter instrument bedrijf) is aangesloten microscoop. Excitatie en emissie golflengtes worden gecontroleerd met filter wielen en gecontroleerd door Lamba 10-2 filterwiel controller, moet Sutter Instruments Co Sluitertijd 500 ms is voldoende om RFP of GFP te bekijken in levende cellen. Hardware controle en acquisitie van beelden worden gecontroleerd door Metamorph software. De keuze van de filters voor de onderhavige studie zijn, filter sets S480/20x, S525/40m en S565/25x, S620/60m voor GFP en RFP, respectievelijk; EGFP / DsRed dual dichroïde, Chroma Technology. Dit filter wiel is geschikt voor maximaal zes filter sets. Microscoop is bevestigd met Voorafgaand ProScan podium controller met Joy stick. Al deze hardware bijlagen kunnen worden gecontroleerd door Metamorph software. De microscoop wordt ook verbonden met Micromanipulators aan de micropipetten te houden. A. Meten leukotrieen B 4 Directed dendritische cel-migratie Met behulp van de hierboven beschreven microscoop instelling, hebben we methoden ontwikkeld voor het volgen van ligand gericht dendritische cel migratie in real time. Twee micromanipulators (Narishige) zijn aan de microscoop. De chemotaxis van muis beenmerg afgeleide dendritische cellen (BMDCs) in de richting LTB 4 gradiënt werd opgenomen. Hier beschrijven we de methoden om de micro-pipetten voor te bereiden met behulp van micro-pipet trekker, het laden van de ligand in de micro-pipet en het opzetten van de chemotaxis experiment op het verwarmde stadium van de microscoop om directionele migratie van cellen te controleren. Deze methode kan worden toegepast om de effectiviteit van verschillende chemoattractants test in het induceren van migratie als gevolg van remmers van chemotaxis in levende cellen. De isolatie van BMDCs 21 van de muis is beschreven in diverse publicaties, waaronder Jupiter 22. 1. Voorbereiding van de BMDCs <ol><li> Het bord van de BMDCs (na kweken gedurende 10 dagen) op de cover slip bodem Fluoro schaal en laat ze groeien voor 16 uur vooruit van het experiment. </li><li> Was de cellen met 3 ml 1X PBS minstens 2 keer (door het toevoegen van 3 ml 1X PBS aan de plaat en opzuigen van de buffer out). </li><li> Voeg 2 mL van 1XPBS tot plaat. De cellen zijn nu klaar voor het experiment. Houden de cellen in 37 ° C incubator voor om te experimenteren. </li></ol> Voorbereiding van de ligand geladen micro-pipet: <ol start="4"><li> Bevestig de glazen capillaire buizen (Glass standaard, 0,75 mm x 0,4 mm, 6 ", Cat # 625500, AM Systems, INC) op de verticale micropipet trekker (Narishige International USA, Inc). </li><li> Houden de temperatuur op 52 ° C en laat het glas te smelten en uit elkaar trekken om scherpe rand tips te vormen. </li><li> Bevestig de pipet op de micro-pipet houder. </li><li> Strijk de ruwe randen van micro-pipet met behulp van micro smeden M-900 (Narishige International USA, Inc), door te kijken onder de microscoop. </li><li> Voor te bereiden op zijn minst 10 tot 20 pipetten voor elk experiment. Opmerking: De micropipetten kan ook worden gekocht van World precisie-instrumenten (μ TIP, T1801TW1F). </li><li> Neem de gewenste concentratie (500 pi van 100 nM LTB 4 in het huidige experiment) van ligand in 1 mL effendorf tube en houden de micro-pipet tip in de oplossing en laat de oplossing tot het aangaan van de micro-pipet (terug vulling). </li><li> Neem 1 ml ligand en in de spuit (1 cc tuberculine spuit) en langzaam vult het ligand met behulp van micro-Fill naald (MF 28G-5, World precisie-instrumenten) in de micro-pipet van boven. </li><li> Bevestig de slang, die strak aansluit op de pipet pipet en het buisje om de naald (21 G 11 / 2) aan 1 ml injectiespuit, die is gevuld met ligand. </li><li> Nu, voorzichtig bewegen van de ligand gevulde micro-pipet aan de microscoop podium en bevestig op micro-manipulatoren. </li><li> Van toepassing zijn weinig druk van de spuit om er zeker van ligand wordt langzaam loslaten van de tip. </li><li> Breng de vergulde onvolwassen BMDCs aan de microscoop en bewaar ze op het verwarmde plaat (37 ° C) het podium. </li><li> Verwijder het deksel van fluor schotel. </li><li> Focus van de cellen met behulp van olie-immersie 60X objectief. </li><li> Voorzichtig, omlaag brengen van de ligand geladen pipet met behulp van 'Grof Manual Manipulator MN-188NE' om de nabijheid van de cellen. </li><li> Focus van de pipet met behulp van 'Hydraulische Fine micromanipulator MN-188 NE ". </li><li> Van toepassing zijn weinig druk van de spuit om ervoor te zorgen dat ligand is het vrijgeven van in het gerecht. </li><li> Stel de beeldacquisitie parameters te verwerven in fel ingediend (10 ms belichting) in om de 15 sec voor 2 uur bij gebruik Metamorph software. </li><li> Houd controle op elke 30 min voor de progression van de migratie naar ligand. </li><li> Als de cellen zijn overvol op pipetpunt, de locatie van de punt in de plaat om de migratie van experiment voort te zetten. </li></ol> B. Het meten van GPCR (BLT1) en cytosolisch eiwit (β-arrestine) interacties, Translocatie in levende cellen 1. De voorbereiding van plasmide DNA-constructen De details van DNA-plasmide constructen werden beschreven in Jala et al.. (2005) 18. 2. Transfectie van de Mens BLT1-RFP en β-arrestine-GFP in de RBL-2H3 cellen <ol><li> Handhaving van de Rat basofiele Leukomia (RBL-2H3) Cellen (60 tot 70% confluentie) bij 37 ° C in een vochtige atmosfeer van 95% lucht, 5% CO 2 als monolaagculturen in groei media (DMEM aangevuld met 15% FBS, 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine) in T75 flessen. </li><li> Maak de cellen van de schotel / kolven door gebruik te maken van 6 ml trypsine-EDTA (0,05% trypsine, 0,53 mM EDTA) en het incuberen gedurende 5 min bij 37 ° C in een vochtige atmosfeer van 95% lucht, 5% CO 2. Schud de kolven in de mate van onthechting van de cellen te controleren. </li><li> Voeg 6 mL van de groei media om fles met 6 ml trypsine-EDTA en het verzamelen van de cellen door ze te mengen met en neer te pipetteren meerdere keren. Breng de cellen in 15 ml Falcon buizen. </li><li> Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en neem 4 x 10 6 cellen in 15 ml centrifugebuis en centrifugeer bij 480 g rpm gedurende 3 min en resuspendeer in 200 ul van transfectie media (DMEM, 20% FBS, 50 mM HEPES). Als u van plan bent 3 transfecties uit te voeren, dus de voorbereiding van de cellen en tranfection media door het verhogen van het aantal cellen en het volume van de transfectie medium. </li><li> Bereid de plasmiden worden getransfecteerd in de concentraties van ten minste 1,5 g / pi. Wij bereiden de DNA-plasmide met behulp van QIAGEN Maxi-DNA-plasmide kit. Voeg de individuele of beide plasmide DNA's die coderen voor menselijke BLT1-RFP (25 ug) en β-arrestin1-GFP (15 ug) tot steriele elektroforese cuvetten, (Bio-Rad # 16552088), die 0,4 cm afstand tussen de elektroden heeft. </li><li> Neem 200 pi van de bovenstaande geresuspendeerd cellen en plaats ze in cuvetten die ofwel hBLT1-RFP of β-arrestin1-GFP of beide samen en meng ze met 1 ml steriele pipet. </li><li> Laat de bovenstaande cuvetten bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. </li><li> Electroporate de cellen in Gene Puiser II met spanning 250 V en 500 uF capaciteit. </li><li> Na elektroporatie laten de cellen blijven bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. </li><li> Neem 1 ml van de reguliere groeimedium en meng dit met geëlektroporeerde cellen in de cuvetten. </li><li> Verdeel 300 pi van dit mengsel in 35 mm weefsel met glazen bodem cultuur gerechten (Fluoro schotel, World precisie-instrumenten) met 2 ml van de regelmatige groei media en incubeer 1 uur bij 37 ° C in een vochtige atmosfeer van 95% lucht, 5% CO 2. Laat de cellen zich te houden aan bodem van de schaal. </li><li> Vervang de media na een uur incubatie met regelmatige groei media en laat ze groeien bij 37 ° C in een vochtige atmosfeer van 95% lucht, 5% CO 2 incubator voor 18-24 uur. </li></ol> 3. Live cell imaging Overname van afbeeldingen <ol><li> Na 18 tot 24 uur, was de cellen 2 of 3 keer met 2 ml warm fenolrood gratis RPMI dat 10 mM HEPES, pH 7,55 (direct Voeg 2 ml warm media plaat en zuigen media. Herhaal de 2 of 3 keer). Voeg 1,8 ml warm fenolrood gratis RPMI dat 10 mM HEPES. </li><li> Plaats 30 mm glas dekglaasje bodem cultuur platen met RBL-2H3 cellen, getransfecteerd met hBLT1-RFP en β-arrestin1-GFP op het verwarmde microscoop fase (37 ° C). </li><li> Verzamel de cel beelden op 600x vergroting van 60 X objectieve Nikon Plan Apo 60X/1.4 numerieke apertuur olie-immersie lens (beschikbaar in onze microscoop systeem). </li><li> Doe een olie druppel op de 60 x objectief lens en de focus van de cellen met reguliere helderveld doorgelaten licht door het aanraken van de onderkant van de plaat. </li><li> Voor het bewaken van de fluorescentie van getransfecteerde eiwitten, overschakelen van helder veld (doorvallend licht) tot fluorescentie-filter (RFP filter, als je wilt receptor of GFP te zien, als je wilt β-arrestin1 zien). </li><li> Kies de heldere en gezonde cel, die hBLT1-RFP drukt op het celoppervlak met RFP filter en vast te leggen de afbeelding. </li><li> Dan verschuiving naar GFP filter en zorg ervoor dat β-arrestine-GFP, uitgedrukt in het cytoplasma en vast te leggen de afbeelding. Dan pseudo kleur zowel de afbeeldingen, voor het vastleggen van de tijd live cell beelden vervallen om ervoor te zorgen dat bloeden door middel van de fluorescentie niet plaatsvindt tussen de RFP en GFP te nemen. </li><li> Zodra de keuze van uw cel gemaakt, de parameters in te stellen op basis van uw doel met behulp van software (Metamorph Software in dit geval). </li><li> In de huidige demonstratie, zijn zestien bits beelden verworven met de wasra binning ingesteld op 1 X in combinatie met een 60 X objectief Nikon Plan Apo 60X/1.4 numerieke apertuur olie-immersie lens. </li><li> Verzamel de fluorescentie beelden voor RFP en GFP fluorochromen gelijktijdig op 30 sec tijdsinterval (als de translocatie / interacties zijn te snel, kan men minder tijd interval) van deze met behulp van filter wielen aangestuurd door Metamorph software. </li><li> De belichting tijden ingesteld op 1000 msec voor de RFP en GFP. (Stel de specifieke blootstelling tijd op basis van de fluorescentie-intensiteit van de RFP en GFP). </li><li> Eerste het verzamelen van de beelden voor 1 min zonder toevoeging van ligand, die dient als 0 tijdstip. </li><li> Voeg de 200 pi van ligand (uit voorraad van 10 uM tot een uiteindelijke concentratie van 1 uM) na 1 minuut zonder verstoring van de plaat / of mobiele stand. </li><li> De fluorescentie beelden zijn verzameld voor 60 min na het toevoegen van het ligand en opgeslagen als TIFF-afbeeldingen met toenemende volgorde van de bestandsnamen. </li><li> Al deze bestanden kunnen worden gemaakt als stapel-bestanden met individuele / gecombineerd fluorescentie beelden met tijdstempels het gebruik van de software. </li></ol> Proces van beelden en kwantificering van de fluorescentie van eiwitten en lokalisatie <ol><li> Het verwerven van de beelden met gewone media (geen cellen) met een RFP en GFP fluorescerende filters en deze opslaan als achtergrond beelden. Gebruik deze beelden af ​​te trekken van feitelijke gegevens bovenstaande foto's verkregen. </li><li> Individueel voor te bereiden de stapel van afbeeldingen voor RFP en GFP beelden. </li><li> Selecteer / definiëren van de verschillende regio's (oppervlakte vs cytosole) om de fluorescentie-intensiteit van RFP en GFP (BLT1 en β-arrestine translocatie) te meten </li><li> Plot de hoeveelheid fluorescentie-intensiteiten als de functie van de tijd. Deze grafiek zal de informatie verstrekken over de kinetiek van de translocatie van bepaald molecuul. </li></ol> Representatieve resultaten A. Meten leukotrieen B 4 Directed dendritische cel-migratie De methode beschreven in dit protocol werd gebruikt om de dendritische cel migratie naar leukotrieen B 4 (figuur 1 en de bijgevoegde video 1) 21 vast te stellen. We kunnen toepassen vergelijkbare methode als de chemotactische vermogen van cellen te bepalen om een ​​bepaalde ligand in levende cellen. <img src="/files/ftp_upload/2315/2315fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Mouse beenmerg afgeleide dendritische cel migratie naar 100 nM LTB 4. Video 1. Live cel migratie van BMDCs naar LTB 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2315/Jala%20and%20Boddulrui_Video1.AVI">Klik hier om de video te zien</a> . B. Het meten van GPCR (BLT1) en cytosolisch eiwit (β-arrestine) interacties, Translocatie in levende cellen Na voltooiing van deze procedure, kan men de volgende informatie op in GPCR signalering evenementen. <ol class="lroman"><li> De lokalisatie van GPCR-en cytosolische eiwitten en kern (figuur 2). </li><li> Ligand geïnduceerde interactie van het oppervlak GPCR (BLT1 in dit geval) met cytosolisch eiwit (β-arrestine in dit geval) (afb. 3). </li><li> Kinetiek van receptor internalisatie en β-arrestine translocatie tot membraan, gevolgd door internalisering samen met receptoren (figuur 4) (Jala et al.. 2005) 18. </li><li> Men kan bepalen van de ligand-receptor afhankelijke activatie status in levende cellen (bevestigd video 2) en bepaal kritische motieven of processen die betrokken zijn bij de receptor activering (Jala et al.. 2005) 18. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2315/2315fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Expressie van BLT1-RFP (A), β-arrestin-GFP (B), pNuc-CFP (C) in RBL-2H3 cellen. Kleur gecombineerd afbeelding getoond in paneel D. <img src="/files/ftp_upload/2315/2315fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Ligand geïnduceerde translocatie van receptor en de β-arrestine. Lijn scan van tl-intensiteiten in de cellen worden weergegeven. <img src="/files/ftp_upload/2315/2315fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Kinetiek van receptor internalisatie en β-arrestine translocatie na toevoeging van 1 uM LTB 4. De fluorescentie-intensiteiten werden gemeten als functie van de tijd op membraan en cytosolische locaties van de cel. Video 2 Live beeldvorming van cellen die BLT1-RFP en β-arrestine-GFP op de toevoeging van een uM LTB 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2315/Jala%20and%20Bodduluri_Video2.AVI">Klik hier om video te bekijken</a>

<ol><li>Wess, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-protein-coupled+receptors%3A+molecular+mechanisms+involved+in+receptor+activation+and+selectivity+of+G-protein+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">G-protein-coupled receptors: molecular mechanisms involved in receptor activation and selectivity of G-protein recognition.</a> FASEB J. 11, 346-354 (1997).</li>
<li>Gether, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+molecular+mechanisms+involved+in+activation+of+G+protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Uncovering molecular mechanisms involved in activation of G protein-coupled receptors.</a> Endocr Rev. 21, 90-113 (2000).</li>
<li>Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seven-transmembrane+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Seven-transmembrane receptors.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).</li>
<li>Lefkowitz, R. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((protein-coupled+receptors.+III.+New+roles+for+receptor+kinases+and+beta-arrestins+in+receptor+signaling+and+desensitization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">protein-coupled receptors. III. New roles for receptor kinases and beta-arrestins in receptor signaling and desensitization.</a> J Biol Chem. 273, 18677-18680 (1998).</li>
<li>Shenoy, S. K., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifaceted+roles+of+beta-arrestins+in+the+regulation+of+seven-membrane-spanning+receptor+trafficking+and+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Multifaceted roles of beta-arrestins in the regulation of seven-membrane-spanning receptor trafficking and signalling.</a> Biochem J. 375, 503-515 (2003).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-arrest%09or%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Beta-arrest	or.</a> Nature. 383, 447-450 (1996).</li>
<li>Serhan, C. N., Haeggstrom, J. Z., Leslie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+mediator+networks+in+cell+signaling%3A+update+and+impact+of+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Lipid mediator networks in cell signaling: update and impact of cytokines.</a> Faseb J. 10, 1147-1158 (1996).</li>
<li>Tager, A. M., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLT1+and+BLT2%3A+the+leukotriene+B%284%29+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Prostaglandins+Leukot+Essent+Fatty+Acids%22%5BJournal%5D)">BLT1 and BLT2: the leukotriene B(4) receptors.</a> Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 69, 123-134 (2003).</li>
<li>Toda, A., Yokomizo, T., Shimizu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukotriene+B4+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Prostaglandins+Other+Lipid+Mediat%22%5BJournal%5D)">Leukotriene B4 receptors.</a> Prostaglandins Other Lipid Mediat. 68-69, 575-585 (2002).</li>
<li>Haribabu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+leukotriene+B%284%29+receptor+in+mice+reveals+its+role+in+inflammation+and+platelet-activating+factor-induced+anaphylaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the leukotriene B(4) receptor in mice reveals its role in inflammation and platelet-activating factor-induced anaphylaxis.</a> J Exp Med. 192, 433-438 (2000).</li>
<li>Subbarao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+leukotriene+B4+receptors+in+the+development+of+atherosclerosis%3A+potential+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of leukotriene B4 receptors in the development of atherosclerosis: potential mechanisms.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 369-375 (2004).</li>
<li>Jala, V. R., Haribabu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukotrienes+and+atherosclerosis%3A+new+roles+for+old+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Leukotrienes and atherosclerosis: new roles for old mediators.</a> Trends Immunol. 25, 315-322 (2004).</li>
<li>Heller, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+atherogenesis+in+BLT1-deficient+mice+reveals+a+role+for+LTB4+and+BLT1+in+smooth+muscle+cell+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Inhibition of atherogenesis in BLT1-deficient mice reveals a role for LTB4 and BLT1 in smooth muscle cell recruitment.</a> Circulation. 112, 578-586 (2005).</li>
<li>Miyahara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+leukotriene+B4+receptor+1+in+allergen-induced+airway+hyperresponsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Requirement for leukotriene B4 receptor 1 in allergen-induced airway hyperresponsiveness.</a> Am J Respir Crit Care Med. 172, 161-167 (2005).</li>
<li>Terawaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+leukotriene+B4+receptor+1+confers+resistance+to+airway+hyperresponsiveness+and+Th2-type+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Absence of leukotriene B4 receptor 1 confers resistance to airway hyperresponsiveness and Th2-type immune responses.</a> J Immunol. 175, 4217-4225 (2005).</li>
<li>Shao, W. H., Del Prete, A., Bock, C. B., Haribabu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+leukotriene+B4+receptors+BLT1+and+BLT2%3A+a+critical+role+for+BLT1+in+collagen-induced+arthritis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of leukotriene B4 receptors BLT1 and BLT2: a critical role for BLT1 in collagen-induced arthritis in mice.</a> J Immunol. 176, 6254-6261 (2006).</li>
<li>Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+requirement+for+the+leukotriene+B4+receptor+BLT1+for+neutrophil+recruitment+in+inflammatory+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis.</a> J Exp Med. 203, 829-835 (2006).</li>
<li>Jala, V. R., Shao, W. H., Haribabu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation-independent+beta-arrestin+translocation+and+internalization+of+leukotriene+B4+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation-independent beta-arrestin translocation and internalization of leukotriene B4 receptors.</a> J Biol Chem. 280, 4880-4887 (2005).</li>
<li>Jala, V. R., Haribabu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+analysis+of+G+protein-coupled+receptor+signaling+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Real-time analysis of G protein-coupled receptor signaling in live cells.</a> Methods Mol Biol. 332, 159-165 (2006).</li>
<li>Del Prete, A., A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+dendritic+cell+migration+and+adaptive+immune+response+by+leukotriene+B4+receptors%3A+a+role+for+LTB4+in+up-regulation+of+CCR7+expression+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Regulation of dendritic cell migration and adaptive immune response by leukotriene B4 receptors: a role for LTB4 in up-regulation of CCR7 expression and function.</a> Blood. 109, 626-631 (2007).</li>
<li>Salogni, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activin+A+induces+dendritic+cell+migration+through+the+polarized+release+of+CXC+chemokine+ligands+12+and+14%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Activin A induces dendritic cell migration through the polarized release of CXC chemokine ligands 12 and 14.</a> Blood. 113, 5848-5856 (2009).</li>
<li>Boudreau, J., Koshy, S., Cummings, D., Wan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+myeloid+dendritic+cells+from+bone+marrow+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
</ol>

Live-cell imaging is een krachtig hulpmiddel om de functie en de interacties van specifieke eiwitten zoals die in real-time aan te tonen. De methoden die in dit handschrift tonen duidelijk aan dat LTB 4 kan een snelle migratie van dendritische cellen te induceren. Deze methoden niet alleen de aspecten van de LTB 4 functie om diverse soorten cellen uit te breiden, ze laten soortgelijke methoden worden toegepast op een verscheidenheid van andere chemokinen en het testen van hun werkzaamheid als chemo...

<table><tbody><tr><td>Rat basofiele leukemiecellijn (RBL-2H3) of HEK293-cellen.</td><td>ATCC</td><td>CRL-2256</td><td></td></tr><tr><td>Delbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s Medium (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>Fenolroodvrij RPMI of DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11835-030</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal runderserum</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine (10000 U/mL)</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine, 0,05% (1X) met EDTA 4Na, vloeibaar</td><td>Invitrogen</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Invitrogen</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>35 mm steriele glazen dekglasbodem Fluoro-schalen (0,17 mm dik) (WillCo-dish)</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>Steriele Gene Pulser cuvet (0,4 cm elektrodeafstand) (Bio-Rad)</td><td>Bio-Rad</td><td>16552088</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser II electroporator</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TE-FM Epi-Fluorescentiesysteem gekoppeld aan Nikon Inverted Microscope Eclipse TE300</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metamorph software</td><td>Universal Imaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Verticale micropipet-puller</td><td>Narishige International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-Forge M-900</td><td>Narishige International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydraulische micromanipulator MO-188NE</td><td>Narishige International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grove handmatige manipulator, MN-188NE</td><td>Narishige International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;cDNA-constructen:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cDNA van G-proteïnegekoppelde receptor getagd met rood fluorescent eiwit aan de C-terminus (hBLT1-RFP)</td><td>Jala et al 2005</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cDNA van cytosolisch eiwit getagd met GFP (&amp;#946;-arrestine1-GFP in de huidige studie).</td><td>Jala et al 2005</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

real-time beeldvorming van leukotriënen b 4 mediated cel migratie en blt1 interacties met β-arrestine

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR&#39;s) behoren tot de zeven transmembraan eiwit familie en bemiddelen van de transductie van extracellulaire signalen naar intracellulaire reacties. GPCRs controle diverse biologische functies, zoals chemotaxis, intracellulaire calcium release, genregulatie in een ligand afhankelijke manier via heterotrimere G-eiwitten 1-2. Ligand binding leidt tot een reeks van conformationele veranderingen die leiden tot de activering van heterotrimere G-eiwitten die het niveau van de second messengers zoals cyclische adenosine monofosfaat (cAMP), inositol trifosfaat (IP3) en diacyl glycerol (DG) moduleren. Gelijktijdig met de activering van de receptor ligand binding brengt ook een reeks van gebeurtenissen aan de receptor signalering via desensitisatie, beslaglegging en / of internalisatie verminderen. De desensibilisatie proces van GPCR&#39;s gebeurt via receptor fosforylatie door G-eiwit receptor kinases (GRKs) en de daaropvolgende binding van β-arrestins 3. β-arrestins zijn cytosolische eiwitten en verplaatsen naar membraan op GPCR activering, te binden aan gefosforyleerd receptoren (de meeste gevallen) is er door het faciliteren van receptor internalisatie 4-6. Leukotrieen B 4 (LTB 4) is een pro-inflammatoire lipide molecuul afgeleid van arachidonzuur route en bemiddelt haar acties via GPCR&#39;s, LTB 4-receptor 1 (BLT1, een hoge affiniteit receptor) en LTB 4-receptor 2 (BLT2, een lage affiniteit receptor ) 7-9. De LTB 4-BLT1 traject is gebleken om kritisch te zijn in verschillende inflammatoire ziekten, waaronder, astma, artritis en atherosclerose 10-17. De huidige paper beschrijft de methoden ontwikkeld om LTB 4-geïnduceerde migratie van leukocyten en de interacties van BLT1 met β-arrestine en receptor translocatie in levende cellen met behulp van microscopische beeldvorming 18-19 te controleren. Beenmerg afgeleide dendritische cellen uit C57BL / 6 muizen werden geïsoleerd en gekweekt zoals eerder beschreven 20-21. Deze cellen werden getest in live cell imaging methoden om de LTB 4 geïnduceerde cel migratie aan te tonen. De menselijke BLT1 werd getagd met rood fluorescerend eiwit (BLT1-RFP) op C-terminus en β-arrestin1 getagd met groen fluorescerend eiwit (β-arr-GFP) en de beide plasmiden getransfecteerd in Rat basofiele Leukomia (RBL-2H3) cellijnen 18-19. De kinetiek van interactie tussen deze eiwitten en lokalisatie werden gemonitord met behulp van live-cell microscopie video. De methoden in de huidige papieren beschrijven het gebruik van microscopische technieken om de functionele reacties van G-eiwit gekoppelde receptoren in levende cellen te onderzoeken. De huidige paper beschrijft ook het gebruik van Metamorph software om de fluorescentie-intensiteiten te kwantificeren de kinetiek van de receptor en cytosolisch eiwit interacties te bepalen.

Dit document beschrijft de methodologie om de chemotactische respons van leukocyten aan specifieke liganden bepalen en interacties tussen de receptoren op het celoppervlak en cytosolische eiwitten met behulp van live-cell imaging technieken.

Real-time beeldvorming van leukotriënen B 4 Mediated Cel Migratie en BLT1 Interacties met β-arrestine

G-eiwitgekoppelde receptoren (GPCR's) behoren tot de familie van zeven transmembraaneiwitten en mediëren de transductie van extracellulaire signalen naar ...

Leukotrieën B4 is een pro-inflammatoir molecuul dat zijn werking uitoefent via de G-eiwitgekoppelde receptoren BLT1 en BLT2 op diverse inflammatoire cellen. De LTB4-BLT1-route is cruciaal gebleken bij verschillende inflammatoire aandoeningen, waaronder astma, artritis en atherosclerose. G-eiwitgekoppelde receptoren, of GPCR's, mediëren de transductie van extracellulaire signalen die leiden tot intracellulaire responsen zoals chemotaxis, intracellulaire calciumvrijgave en genregulatie.Binding van extracellulaire liganden induceert een reeks conformationele veranderingen die leiden tot de activatie van heterotrimere G-proteïnen. G-proteïnen moduleren vervolgens de niveaus van second messengers, zoals cyclisch adenosinemonofosfaat, adenosinetrifosfaat en diacylglycerol. Om leukoteen B4-gemedieerde celmigratie in real-time te monitoren, worden uit het beenmerg afgeleide dendritische cellen (BMDC's) afgebeeld terwijl de ligand via een gecontroleerde stroom vanuit een micropipet wordt toegediend. Time-lapse imaging wordt uitgevoerd om de migratie te beoordelen.Met behulp van deze live-cell real-time imagingtechnieken heeft ons laboratorium ontdekt dat de leukotrieën B4-receptor BT1 funct

real-time-imaging-leukotriene-b4-mediated-cell-migration-blt1

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

We beschrijven hier een niet-invasieve twee-foton (2P) microscopie aanpak om te studeren leukocyten homing in de muis voetzool. We bespreken de technische aspecten van onze weefsels beeldvorming voorbereiding en loopt de lezer door een typisch experiment van de eerste set tot en met uitvoering en het verzamelen van gegevens.

Niet-invasieve beeldvorming van Leukocyte Homing en migratie In vivo</em

Dit is een methode om leukocyt adhesie te visualiseren aan het endotheel in geoogste drukvaten. De techniek maakt het bestuderen van vasculaire adhesie onder afschuiving stroom met verschillende intraluminale druk tot 200 mmHg aldus de pathofysiologische omstandigheden van hoge bloeddruk na te bootsen-ing.

Imaging Leukocyt Hechting aan het vasculair endotheel bij High intraluminale druk

Beschrijven we een protocol van helderveld intravitale microscopie voor het meten van dynamische neutrofiel-endotheliale cel interacties tijdens neutrofielen werving in reactie op de bron van een neutrofiel chemoattractant in vivo. Neutrofiele intraluminale kruipen, transendotheliale migratie en chemotaxis in de muis cremaster spierweefsel worden gevisualiseerd met een time-vervallen video fotografie en gevolgd met ImageJ.

Tracking neutrofielen intraluminale Crawling, transendotheliale migratie en chemotaxis in weefsel door intravitale Video Microscopie

Leukocyten steken de endotheelcellen monolaag met behulp van de paracellulaire of de transcellulaire route. We ontwikkelden een eenvoudige test om te volgen de verdeling van endogene junctionele VE-cadherine en PECAM-1 tijdens de migratie van leukocyten onder fysiologische stroom te maken tussen de twee transmigratie routes.

Real-time beeldvorming van endotheelcellen-cel Junctions Tijdens Neutrophil Transmigration onder fysiologische Flow

Deze vereenvoudigde toepassing van intravitale microscopie van mesenterische aderen bij muizen kan worden gebruikt in verschillende ontstekingsmodellen om leukocyten-endotheel en bloedplaatjes-leukemie-interacties te observeren.

Intravitale Microscopie van leukocyten-endotheel en bloedplaatjes-leukocyten Interactions in mesenteriale Veins in Muizen

We beschrijven een protocol om het gedrag van neutrofielen en monocyten in mesenteriale aderen onder stabiele en inflammatoire omstandigheden te monitoren met behulp van intravitale confocale microscopie op geanesthetiseerde muizen.

Beeldvorming van neutrofielen en monocyten in Mesenteriale Veins door Intravitale Microscopie op verdoofd muizen in Real Time

Hier presenteren we een protocol om de afbeelding cellen die groen fluorescerend eiwit-tag soort angiotensine 1a receptoren tijdens endocytose geïnitieerd door angiotensine II behandeling. Deze techniek omvat labeling lysosomen met een tweede fluorescerende marker, en vervolgens met behulp van software om de co-lokalisatie van receptor en lysosomen te analyseren in drie dimensies in de tijd.

Live-cell imaging en 3D analyse van angiotensine receptor type 1a Trafficking in getransfecteerde humane embryonale niercellen middels confocale microscopie

Leukocyten interactie gretig met vasculaire cellen en trombocyten na vaartuig muur letsel of tijdens ontsteking. Hier beschrijven we een eenvoudig laminaire flow gebaseerde assay karakteriseren de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de interacties tussen leukocyten en hun cellulaire partners.

Laminaire stroming gebaseerde testen te onderzoeken Leukocyte aanwerving op gekweekte vasculaire cellen en aanhangend bloedplaatjes

De hier ingevoerde protocol kunnen karakterisering van de homing longcapaciteit van primaire menselijke lymfocyten in vivo inflammatoire voorwaarden. Pulmonaire infiltratie van adoptively overgedragen menselijke immune cellen in een muismodel van allergische ontsteking kan worden beeld en gekwantificeerd door licht vel fluorescentie microscopie van chemisch gewiste longweefsel.

Geavanceerde Imaging van longkanker Homing menselijke lymfocyten in een experimenteel In Vivo Model van allergische ontsteking op basis van licht vel microscopie

In dit protocol wordt een biomimetische microfluïde assay, die een fysiologisch relevante microvasculaire omgeving kan reproduceren en de gehele leukocytenadhesie / migratiecascade kan reproduceren, gebruikt om leukocyten-endotheelcelinteracties bij ontstekingsziekten te bestuderen.

Een microfysiologisch systeem om leukocyten-endotheelcelinteractie tijdens ontsteking te bestuderen

In vivo beeldvorming van de gewrichten is een waardevolle techniek om het migratiegedrag van leukocyten en moleculaire dynamiek binnen de ontstoken gewrichten te ontdekken. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor in vivo beeldvorming van de gewrichten met behulp van een muismodel van type II collageen-geïnduceerde artritis (CIA).

In Vivo Beeldvorming onthult het migratiegedrag van leukocyten binnen de gewrichten

Leer real-time beeldvorming van leukocytenmigratie naar leukotrieen B4 met behulp van levende celtechnieken. Deze methode onthult receptorinteracties met β-arrestine voor inflammatoire ziekteonderzoek.

Real-time beeldvorming van leukotriënen B₄ Mediated Cel Migratie en BLT1 Interacties met β-arrestine

Meer video's verkennen