Real-time beeldvorming van leukotriënen B ₄ Mediated Cel Migratie en BLT1 Interacties met β-arrestine

Leukotrieën B4 is een pro-inflammatoir molecuul dat zijn werking uitoefent via de G-eiwitgekoppelde receptoren BLT1 en BLT2 op diverse inflammatoire cellen. De LTB4-BLT1-route is cruciaal gebleken bij verschillende inflammatoire aandoeningen, waaronder astma, artritis en atherosclerose. G-eiwitgekoppelde receptoren, of GPCR's, mediëren de transductie van extracellulaire signalen die leiden tot intracellulaire responsen zoals chemotaxis, intracellulaire calciumvrijgave en genregulatie.

Binding van extracellulaire liganden induceert een reeks conformationele veranderingen die leiden tot de activatie van heterotrimere G-proteïnen. G-proteïnen moduleren vervolgens de niveaus van second messengers, zoals cyclisch adenosinemonofosfaat, adenosinetrifosfaat en diacylglycerol. Om leukoteen B4-gemedieerde celmigratie in real-time te monitoren, worden uit het beenmerg afgeleide dendritische cellen (BMDC's) afgebeeld terwijl de ligand via een gecontroleerde stroom vanuit een micropipet wordt toegediend. Time-lapse imaging wordt uitgevoerd om de migratie te beoordelen.

Met behulp van deze live-cell real-time imagingtechnieken heeft ons laboratorium ontdekt dat de leukotrieën B4-receptor BT1 functioneel tot expressie komt op dendritische cellen. We hebben ook fosforylering en bèta-arrestine-afhankelijke mechanismen van internalisatie van BT1 geïdentificeerd. Dr. Jla, een assistent-professor in ons laboratorium die veel van deze technieken heeft ontwikkeld, zal zowel de migratie van levende cellen als de receptorinternalisatie demonstreren. Om uit het beenmerg afgeleide dendritische cellen (B MDCs) voor celmigratie-assays voor te bereiden, plaatst u 0,5 miljoen cellen in RPMI 1640-kweekmedium met FPS, recombinant G-M-C-S-F en recombinant FLT3 in een glazen schaaltje van 35 mm met een glazen bodem.

Incubeer de cellen na het uitplaten gedurende 16 uur bij 37 °C en 5% koolstofdioxide. Voeg na 16 uur drie milliliter PBS toe en aspireer dit vervolgens. Herhaal deze wasstap nog minstens twee keer; voeg na de laatste aspiratie twee milliliter PBS toe aan de plaat.

De cellen zijn nu klaar voor het experiment en moeten op 37 °C worden bewaard. Tot die tijd bestaat het beeldvormingssysteem dat wordt gebruikt voor de experimenten in deze video uit een A-T-E-F-M epi-fluorescentiesysteem gekoppeld aan een Nikon eclipse TE 300 omgekeerde microscoop, uitgerust met een verwarmde tafel en een gekoelde SNAP hq digitale zwart-wit CCD-camera.

De excitatie- en emissiegolflengten worden geregeld met filterwielen en via een Lambda 10 dash two filterwielcontroller. De hardwarebesturing en de beeldacquisitie worden aangestuurd door metamorph-software. Twee micromanipulatoren zijn bevestigd aan de microscooptafel om de pipetten vast te houden, welke ofwel kunnen worden vervaardigd volgens de instructies in de bijbehorende tekst of kunnen worden aangeschaft.

Overbreng 1,5 milliliters van een 100 nanomolaire voorraad van het pro-inflammatoire ligand leukotrieen B4 of LTB4 in een 1,5 milliliter centrifugebuis. Vul de micropipet opnieuw door de tip van de micropipet in de oplossing te plaatsen en de oplossing binnen te laten lopen; deze methode van laden voorkomt de vorming van luchtbellen aan het uiteinde van de micropipet. Vul vervolgens een tuberculinespuit van één kubieke centimeter, voorzien van een microfill-naald, met één milliliter LTB4.

Gebruik dit vervolgens om een micropipet langzaam van bovenaf te vullen en bevestig de slang aan de gevulde LTB-micropipet. Verbind de micropipet en de slang vervolgens met een naald van 21 gauge en 1,5 inch, die is bevestigd aan een spuit van 1 mL die eveneens met ligand is gevuld. Bevestig nu de met ligand gevulde micropipet voorzichtig aan een van de micromanipulatoren op de microscooptafel om live-cell imaging uit te voeren van dendritische cellen afgeleid uit het beenmerg.

Haal na toevoeging van LTB four ligand de uitgeplaatte onrijpe b MDCs uit de incubator en plaats deze op de verwarmde tafel van de microscoop. Breng de cellen in beeld met een 60 x olie-immersielens. Zoek een gebied waar de cellen niet te dicht op elkaar liggen, zodat de migratie correct gevolgd kan worden.

Verwijder het deksel van de fluoro-schaal. Laat vervolgens met de grove handmatige manipulator de pipet met ligand voorzichtig zakken en breng deze met de hydraulische fijne micromanipulator in directe nabijheid van de cellen.

Stel de focus van de pipet in. Oefen een kleine hoeveelheid druk uit met de spuit om de langzame afgifte van LTB four ligand vanuit de tip te initiëren; het ligand moet zich langzaam door diffusie in het medium verspreiden. Stel vervolgens, met behulp van de Metamorph-software, de parameters voor beeldacquisitie in om gedurende twee uur elke 15 seconden een brightfield-beeld vast te leggen.

Blijf elke vijf minuten monitoren op progressie van de migratie naar het ligand. De in dit protocol beschreven methode werd gebruikt om de migratie van dendritische cellen naar leukotrieen B4 te bepalen. Hier werd de migratie van uit muisbeenmerg afgeleide dendritische cellen naar 100.

Deze time-lapse-beeldvormingsvideo toont de migratie van levende B MDCs naar LTB4. Vergelijkbare methoden kunnen worden toegepast om de chemotactische respons van vele celtypen op een verscheidenheid aan chemoattractanten te bepalen. Dit type beeldvorming kan, in combinatie met fluorescerende eiwit-tagmoleculen, worden gebruikt om bewegingen en interacties van moleculen in realtime in levende cellen te volgen.

Hier demonstreren we de interacties van de fluorescent gelabelde leukotriene B4-receptor 1 met bèta-arrestine in real-time. RBL-2H3 is een rat basofiele leukemie-cellijn geïsoleerd van Wister-ratten, die verkregen kan worden via ATCC. Deze cellen brengen weinig chemokinereceptoren tot expressie, maar beschikken over de cellulaire componenten om chemokinestuurde signaleringspaden te mediëren.

Om de ligand-geïnduceerde internalisatie van BT one in real-time te beoordelen, worden RBL twee H drie-cellen getransfecteerd met BT one RFP en beta arrest in GFP. Tijdens time-lapse imaging wordt ligand aan de plaat toegevoegd. Veranderingen in de lokalisatie van deze eiwitten kunnen worden beoordeeld via beeldanalyse.

Om de internalisatie van G PCR R in real-time te bestuderen, transfecteer B LT one RFP en beta-arrestine GFP in RBL twee H drie cellen volgens de instructies in de bijbehorende tekst. Draag vervolgens 300 µL van het mengsel van geëlektroporeerde cellen en regulier groeimedium over naar 35 mm fluoroschaaltjes die 2 mL regulier groeimedium bevatten. Plaats de cellen bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 95% lucht en 5% CO2 om ze te laten hechten aan de bodem van het schaaltje.

Vervang na één uur het transfectiemedium door regulier groeimedium en plaats de cellen voor nog eens 18 tot 24 uur terug in de incubator. Was na de incubatie de cellen twee of drie keer door twee milliliter warm fenolroodvrij RPMI bevatten 10 millimol HEPES direct aan de plaat toe te voegen en het medium af te zuigen. Voeg vervolgens opnieuw 1,8 milliliter toe.

Plaats vervolgens de kweekschaal op de verwarmde microscooptafel. Leg beelden vast bij een 600 x vergroting met behulp van een 60 x olie-immersielens. Schakel daarna over naar het juiste fluorescentiefilter.

Kies een gezonde cel die HBL BT one RFP op het celoppervlak tot expressie brengt en leg hier het beeld vast. Schakel met het RFP-filter over naar het GFP-filter, controleer of beta arrest en GFP in het cytoplasma tot expressie komen en leg het beeld vast. Bekijk vervolgens de samengevoegde pseudogekleurde beelden om te controleren op fluorescentie-bleed-through die als gevolg van mist kan optreden.

Er vindt geen targeting van de receptoren plaats tussen RFP en GFP. Voer vervolgens hier de parameters voor time-lapse imaging in. 16-bit beelden worden verworven met de camera-instelling op one by one.

De rode en groene fluorescentiebeelden worden opeenvolgend vastgelegd met RFP- en GFP-fluorochroomfilters via een R-F-P-G-F-P beam splitter. Stel de software zo in dat er gedurende één uur beelden worden vastgelegd met intervallen van 32 seconden. Stel de belichtingstijden van de camera zo in dat vergelijkbare dynamische bereiken worden verkregen.

Voor de fluorescentie-intensiteit van RFP en GFP. Neem gedurende één minuut beelden op, vervolgens op t=0. Voeg de 200 µL van het ligand direct aan de plaat toe zonder deze te verstoren.

Ga door met het verzamelen van fluorescentiebeelden gedurende 60 minuten. Na toevoeging van het ligand worden de beelden tijdens de acquisitie automatisch opgeslagen als TIFF-afbeeldingen met opeenvolgende bestandsnamen. De bestanden kunnen vervolgens met behulp van de software worden bekeken als individuele of gecombineerde beelden.

Nadat alle celbeelden zijn verkregen, worden tenslotte beelden gemaakt van puur medium zonder cellen met dezelfde instellingen. Sla deze bestanden op voor gebruik als achtergrondbeelden bij de analyse van de beelden. Gebruik de functie voor beeldsubtractie in Metamorph om de achtergrond van de hierboven verkregen werkelijke databeelden te verwijderen.

Hiermee wordt rekening gehouden met eventuele achtergrondruis of autofluorescentie van het medium. Ga vervolgens in het bestandmenu naar de optie 'final generated stack file' en open de individuele stacks met afbeeldingen. Selecteer daarna onder regiometingen de optie 'eclipse region trace region' en teken de regio's van belang; selecteer de oppervlakte- en cytosolische regio's om de fluorescentie-intensiteit van RFP en GFP te meten, die overeenkomen met de translocatie van BLT1 en bèta-arrestine.

Gebruik de optie voor loggegevens, die automatisch koppelt met Excel, om de fluorescentie-intensiteiten als functie van de tijd weer te geven. Deze grafiek geeft informatie over de kinetiek van de translocatie van een bepaald molecuul. De beeldanalyse kan de lokalisatie van G PCR R en cytosolische eiwitten en de nucleus onthullen.

Hier is de expressie van BT one RFP op het oppervlak van een RBL two H three-cel te zien. Deze afbeelding toont beta rest en GFP-lokalisatie in het cytosol van dezelfde cel, en hier is p nuke CFP zichtbaar in de nucleus. De hier getoonde gecombineerde kleurenopname geeft de verschillende cellulaire lokalisatie van elk fluorochroom aan; ligand-geïnduceerde interactie van oppervlakte-GPCR's met cytosolische eiwitten kan hier ook worden beoordeeld.

Ligand-geïnduceerde translocatie van de BLT1-receptor en bèta-arrestine. Deze video toont live-imaging van een cel die BLT1-RFP en bèta-arrestine-GFP tot expressie brengt. Na toevoeging van 1 µM LTB4 kan de kwantificering van de translocatiepatronen worden gemonitord met Metamorph-software.

Een lijnenscan van fluorescentie-intensiteiten in een representatieve cel wordt getoond bij T is gelijk aan nul. BT1 RFP is zichtbaar bij het membraan en bèta-arrestine in GFP is zichtbaar in het cytosol. Na toevoeging van het ligand wordt overlap van de RFP- en GFP-lijnen waargenomen, wat wijst op colocalisatie van de receptor en het bèta-arrestine.

Daarnaast kan hier de kinetiek van eiwitbeweging worden bepaald. De kinetiek van receptorinternalisatie en beta-arrestine-translocatie werd onderzocht na toevoeging van 1 µM LTB4.

De fluorescentie-intensiteiten werden gemeten als functie van de tijd op membraan- en cytosolische locaties van de cel. Toevoeging van LTB4-ligand aan B LT1-RFP en beta-arrestine-1-GFP getransfecteerde RRB2 H3-cellen leidt tot translocatie van beta-arrestine-1-GFP van het cytosol naar het membraan, wat zichtbaar is als de vorming van een gele ring binnen één minuut. Bij interactie met beta-arrestine-1-GFP vormt BT1-RFP een receptor-beta-arrestine-1-GFP-complex en transloceert dit door het cytosol in de vorm van endosomen, wat duidelijk wordt door het verschijnen van gele puncta binnen vijf minuten. Met behulp van deze methoden kunnen de ligand-afhankelijke receptoractivatiestatus en kritische motieven of processen die betrokken zijn bij de receptoractivatie worden bepaald.

Het belangrijkste bij het experiment is om de buffer in de plaat nauwgezet in de gaten te houden tijdens de uitvoering. Dit aangezien het experiment na de start langer dan een uur duurt. Deze techniek is ontwikkeld voor onderzoekers op het gebied van chemokines en receptoren om celmigratie en receptor-ligandinteracties in diverse zoogdierceltypen te bestuderen.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u real-time imaging-experimenten opzet met chemokines en hun receptoren, en hun interacties met cytosolische eiwitten zoals beta-arrestines.