Bouwen aan een betere Mosquito: Het identificeren van de genen Enabling malaria en knokkelkoorts verzet in A. gambiae en A. aegypti muggen

Ik ben George Dimopoulos. Ik ben assistent-professor bij de Johns Hopkins School of Public Health, afdeling Moleculaire Microbiologie en Immunologie aan het Malaria Research Institute. Mijn onderzoeksgroep werkt aan de mug en Gambia die malaria overbrengen, en we bestuderen de moleculaire biologie van de mug met een specifieke interesse in het aangeboren immuunsysteem van de mug dat betrokken is bij het doden van malariaparasieten.

We willen begrijpen hoe dit immuunsysteem functioneert en welke genen en moleculen belangrijk zijn voor het doden van de parasiet. We geloven dat we, door de biologie van dit systeem te begrijpen, deze kennis in de toekomst kunnen gebruiken om strategieën voor de bestrijding van malaria te ontwikkelen. Malaria is een van de ernstigste ziekten ter wereld.

Het is eigenlijk altijd al aanwezig geweest bij de mensheid, en het is jammer dat we er nog steeds mee te maken hebben. Malaria infecteert elk jaar 400 miljoen mensen en doodt 2 miljoen mensen, voornamelijk in de regio van Sub-Sahara Afrika, maar we vinden het ook in andere ontwikkelingslanden in Zuid-Amerika en Azië. Malaria wordt veroorzaakt door een protozoaire parasiet van het genus Plasmodium, en er zijn vier Plasmodium-soorten die menselijke malaria kunnen veroorzaken.

De belangrijkste daarvan is Plasmodium falciparum. Plasmodium falciparum wordt hoofdzakelijk overgedragen door muggen behorend tot het genus Anopheles, waarbij de belangrijkste vectormuggen voor de transmissie van malaria in Sub-Sahara Afrika behoren tot het Ous Gambia Species Complex; zij komen voornamelijk voor in de Sub-Sahara regio van Afrika. Het denguevirus is een flavivirus en wordt hoofdzakelijk overgedragen door de mug Aedes aegypti.

De geografische verspreiding ervan is vrijwel gelijk aan die van malaria. Het komt voor in de Amerika's, in Zuidoost-Azië en in Afrika. Het denguevirus veroorzaakt hemorragische koorts.

Ongeveer 2,5 miljard mensen lopen risico op besmetting met het denguevirus, en het virus veroorzaakt jaarlijks bij miljoenen mensen hemorragische koorts. Dengue-hemorragische koorts is in de afgelopen 10 jaar uitgegroeid tot een van de ernstigste door vectoren overdraagbare ziekten. De malariaparasiet heeft een complexe levenscyclus, zowel in de muggenvector die de overdracht tussen menselijke gastheren verzorgt, als in de menselijke gastheer zelf.

Mijn onderzoeksgroep bestudeert de biologie van malariaoverdracht in de mug. Wanneer een mug een geïnfecteerde bloedmaaltijd opneemt, worden ook de Plasmodium falciparum-parasieten ingenomen. De gametocyten van de parasiet versmelten in de middendarm en produceren een oocyst ongeveer 18 tot 35 uur na de inname van het bloed.

Deze ookineten moeten hier het darmepitheel van de mug binnendringen. De meeste ookineten worden in dit stadium gedood door het immuunsysteem van de mug, en dit is waar wij ons in onze studies op concentreren; dit is tevens een confocale microscopie-opname van de ookineten. De ookineten die erin slagen om door de middendarm te dringen, zullen hier aan de basale zijde een cyste vormen, en binnen deze cyste zullen duizenden parasieten in het sporozoïetstadium zich ontwikkelen. Deze sporozoïten zullen dan, ongeveer 15 dagen nadat de mug de bloedmaaltijd heeft genomen, migreren naar de speekselklieren, en vanuit de speekselklieren kunnen de sporozoïten worden overgedragen op een nieuwe gastheer. Het immuunsysteem van de mug is ook betrokken bij het doden van sporozoïten in dit stadium, wanneer ze worden vrijgegeven in de hemocoel van de mug.

Het genoom van de mug is onlangs in 2002 gesequenced, wat ons in staat heeft gesteld om nieuwe moleculair-biologische en genomische instrumenten te ontwikkelen om de genexpressie van alle muggen, ongeveer 14.000 genen onder verschillende infectieomstandigheden, te bestuderen op zogenaamde microarrays. Deze microarray hier, die we een paar jaar geleden hebben ontwikkeld, bevat het volledige transcriptoom van de mug, alle muggen-genen die op dat moment bekend waren, evenals de genen van de plasmodium-parasiet. Hierdoor kunnen we de activiteit van genen in zowel de mug als de parasiet gelijktijdig tijdens de infectie analyseren.

Zodra we de genen hebben geïdentificeerd die worden geactiveerd wanneer de mug besmet is met plasmodiumparasieten, moeten we testen of deze genen betrokken zijn bij het doden van de parasiet. Dit doen we via een methode die RNA-interferentie-gensilencing wordt genoemd. In essentie injecteren we RNA voor de genen die we willen targeten; dit dubbelstrengs RNA zal de mRNA's van de doelgenen in de mug afbreken, waardoor deze genen geen eiwit meer produceren. Vervolgens infecteren we de mug met een parasiet.

Wanneer we nu een bepaald gen in de mug hebben uitgeschakeld of geïnactiveerd, en de parasiet na deze silencing een hogere infectiegraad kan vestigen dan normaal in de niet-behandelde muggen, zou dat suggereren dat dit gen op een bepaalde manier wordt gebruikt om malariaparasieten te doden. Dit is feitelijk de belangrijkste methode die we gebruiken om te testen of genen betrokken zijn bij het doden van parasieten in de mug.

De meeste plasmodium-parasieten worden in de mug gedood, en we hebben sterke aanwijzingen dat het aangeboren immuunsysteem van de mugen hier hoofdzakelijk verantwoordelijk voor is. Ons laboratorium en de laboratoria van onze samenwerkingspartners hebben verschillende genen geïdentificeerd die hieraan betrokken zijn. Er bestaan ook genetisch geselecteerde muggenstammen die geen malaria overdragen omdat zij alle parasieten in de middarm doden via mechanismen van de aangeboren immuunafweer.

Het lijkt erop dat de mug over een verscheidenheid aan verschillende componenten en mechanismen beschikt om de parasiet te bestrijden, en de grootste uitdaging op dit moment is om te begrijpen hoe deze functies werken en hoe we deze kunnen manipuleren om resistente muggen te ontwikkelen. De GTI-mug maakt gebruik van andere mechanismen om de denguevirusinfectie te beheersen dan de mechanismen die *Anopheles gambiae* gebruikt bij een gecontroleerde odontiuminfectie. De aegypti-mug beschikt, net als alle eukaryoten, over een RNA-afhankelijk afweermechanisme dat RNA-interferentie wordt genoemd.

Het is in essentie een afweermechanisme dat in staat is om het RNA van het virus te targeten voor afbraak, en op deze manier beschermt het zichzelf tegen virusinfectie. We proberen dit afweermechanisme te begrijpen en te achterhalen hoe we dit kunnen manipuleren om muggen te genereren die resistent zijn tegen het virus. In de afgelopen 10 jaar heeft de moleculaire biologie enkele zeer ingrijpende vooruitgang geboekt, voornamelijk methodologische verbeteringen die ons onderzoek enorm hebben versneld.

Een van de belangrijkste vorderingen zijn de sequencingtechnologieën die high-throughput sequencing van volledige genomen mogelijk hebben gemaakt. Dankzij deze technologieën zijn de genomen van de ous Gambia en de A, deze gyp-mug nu volledig gesequenced. Hierdoor kunnen we genen die betrokken zijn bij het beheersen van infecties veel eenvoudiger identificeren dan voorheen.

Andere zeer belangrijke vorderingen in het veld van de functionele genomica zijn de high-throughput genexpressieanalyse met behulp van de microarray. Microarrays zijn kleine glazen objectglazen waarop duizenden DNA-fragmenten zijn geïmmobiliseerd, en we kunnen deze zogenaamde DNA-chips gebruiken om de genexpressie van een zeer groot aantal genen te monitoren. Een andere zeer belangrijke vordering in het veld is de methodologie van RNA-interferentie voor gensilencing, waardoor we genen in de mug kunnen targeten en inactiveren, en zo een zogenaamde reverse genetische benadering kunnen gebruiken om de genfunctie te bestuderen en te bepalen hoe onze genen van belang zijn bij het doden van de parasiet.

De muggen waarop wij en onze samenwerkingspartners de meeste van deze studies hebben uitgevoerd, zijn afkomstig van muggenkolonies die al 30 jaar onder laboratoriumomstandigheden worden gehouden. Deze muggen zijn overduidelijk behoorlijk gedifferentieerd ten opzichte van de muggen die we in de natuur vinden. Muggen in de natuur staan onder een voortdurende selectieve druk van verschillende microben en andere parameters die in het veld sterk variëren in vergelijking met de vrij stabiele omstandigheden die we in het laboratorium hebben.

Men zou kunnen aanvoeren dat onze studies waarschijnlijk veel informatiever zouden zijn als ze direct op veldmuggen zouden worden uitgevoerd. Helaas is dat niet zo eenvoudig te realiseren. Zoals vermeld beschikken we niet over de nodige infrastructuur in het veld en bovendien is het zeer ingewikkeld om muggen uit het veld te verzamelen en daaruit kolonies te ontwikkelen.

Daarom zijn de beste biologische modellen die we tegenwoordig hebben de laboratoriummodellen, maar we zullen op een bepaald moment uiteraard het veld in moeten gaan om de belangrijkste bevindingen die voortvloeien uit onze ontdekkingen met onze laboratoriummuggen te verifiëren en te bevestigen. We weten dat de afweersystemen van de muggen betrokken zijn bij het doden van de menselijke pathogenen die deze insecten overbrengen. Als we nu kunnen begrijpen hoe dit doden plaatsvindt, welke genen daarbij betrokken zijn en welke mechanismen een rol spelen, zouden we deze potentieel kunnen manipuleren en die manipulatie kunnen gebruiken om genetisch gemodificeerde muggen te ontwikkelen die niet in staat zijn de pathogeen over te brengen.

Zodra we dergelijke genetisch gemodificeerde muggen hebben ontwikkeld, kunnen we gaan nadenken over hoe we deze daadwerkelijk in het veld kunnen introduceren en ze tot een dominante soort kunnen maken ten opzichte van de vatbare muggen. Een strategie die breed is besproken om dit te bereiken, is in essentie het verspreiden van resistente genen in natuurlijke populaties—genen die de muggen resistent maken tegen de pathogenen—en dit moet worden gerealiseerd via zogenaamde genetic drive-mechanismen. Veel onderzoek is tegenwoordig gericht op de ontwikkeling van dergelijke genetic drive-mechanismen.

Er zijn uiteraard veel ethische overwegingen die men moet meewegen bij het vrijlaten van elk type genetisch gemodificeerd organisme in de natuur. Het is belangrijk om te onthouden dat genetische modificatie in het veld voortdurend op natuurlijke wijze voorkomt. Gezien de drie mutaties is er weinig reden om aan te nemen dat we zouden eindigen met een mug die beter in staat is om een pathogeen over te dragen of die over andere ongewenste eigenschappen beschikt.

Het ergste dat zou kunnen gebeuren is dat het pathogeen op een gegeven moment resistentie ontwikkelt tegen deze transgene mug, en we zouden uiteraard uitgebreid veldonderzoek en laboratoriumtesten moeten uitvoeren voordat we überhaupt zouden overwegen om een genetisch gemodificeerde mug in het veld uit te zetten. We zouden mensen ook moeten informeren over deze gecontroleerde strategieën en ervoor moeten zorgen dat iedereen zich comfortabel voelt bij en instemt met dit type strategie. Er zijn nog veel hindernissen te overwinnen om een strategie voor ziektebestrijding te realiseren die gebaseerd is op het blokkeren van het pathogeen in de muskietenvector.

Sommige van deze obstakels hebben betrekking op technische kwesties, experimentele problemen die we moeten oplossen. Eén obstakel is bijvoorbeeld de ontwikkeling van gene drive-mechanismen, mechanismen die deze resistente genen efficiënt in populaties zouden kunnen verspreiden. Het wetenschappelijke veld van de biologie van ziektevectoren heeft de afgelopen 10 tot 15 jaar een enorme vooruitgang doorgemaakt, voornamelijk door het besef dat het begrip van de biologie van de interactie tussen insecten en pathogenen ons daadwerkelijk kan helpen bij het ontwikkelen van beheersingsstrategieën.

Deze erkenning leidde tot een toename van de financiering voor onderzoek in dit vakgebied. Het is van essentieel belang dat deze financiering en betrokkenheid worden voortgezet, zodat we het behaalde momentum kunnen vasthouden en onze missie kunnen voltooien door de biologie van de interactie tussen vector en pathogeen te begrijpen en te onderzoeken hoe we deze biologie kunnen gebruiken om strategieën voor ziektebestrijding te ontwikkelen.