Milieuvriendelijk Induced erfelijke veranderingen in de Flax

Het algemene doel van deze procedure is het demonstreren van een methode voor het kweken van een induceerbare vlasvariëteit onder omstandigheden die leiden tot erfelijk genomisch variatie. Daarnaast worden genomische veranderingen gemonitord en wordt de groei van de geïnduceerde planten in opeenvolgende generaties waargenomen onder diverse omgevingsfactoren. Om dit te bereiken, wordt vlas gekweekt onder verschillende inducerende omstandigheden.

Vervolgens wordt blad- en Maris-stengelweefsel verzameld op verschillende tijdstippen tijdens de groei van de planten onder de diverse omgevingscondities. Daarna worden DNA en RNA geïsoleerd uit de weefselmonsters. De laatste stap van de procedure is het uitvoeren van PCR met de DNA-monsters en Q-R-T-P-C-R met het geïsoleerde RNA om genomische veranderingen en veranderingen in genexpressie te identificeren die het resultaat zijn van groei onder verschillende omgevingscondities.

Uiteindelijk kunnen resultaten worden behaald die de genomische respons op groeicondities aantonen, met de verschijning van het LIS one-insertie-element op een specifiek punt in het genoom en expressieverschillen geassocieerd met de aanwezigheid van dat element, gevisualiseerd via PCR en R-T-P-C-R uitgevoerd met nucleïnezuren geïsoleerd uit de weefsels van behandelde planten. Hallo, ik ben Chris Cull van de afdeling Biologie aan de Case Western Reserve University. Ik ben Cory Johnson van het Cull Lab.

En ik ben Tiffany Moss, ook van het Cull-lab. En ik ben Marshall Lucas, een undergraduate in het zomerprogramma voor undergraduate onderzoek bij het Cull-lab.

Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om veranderingen in het genoom en de genexpressie te bestuderen die voortvloeien uit variaties in de groeinomgeving. Laten we beginnen. Om vlas te kweken onder inducerende omstandigheden, begint u met het vullen van potten van vijf inch met grond en het stevig aandrukken ervan.

Plant vervolgens drie vlaszaadjes per pot op een diepte van een kwart inch. Bedek ze vervolgens met aarde voor de niet-inducerende controlecondities. Bewater de planten met 100 milliliters van een Miracle-Gro-oplossing met een sterkte van 1/10.

Behandel de planten onder hoge nutriëntencondities met 100 milliliters van volledige sterkte Miracle grow. Breng dit tot slot aan.

Geef alleen kraanwater aan de planten met een laag nutrientengehalte. Kweek de planten tijdens de zomer onder natuurlijk licht terwijl ze groeien. Bewater alle planten twee keer per dag gedurende vijf minuten met een automatisch sproEISysteem.

Pas de groeicondities eenmaal per week toe op de planten. Verzamel de bladeren en de stengels met wekelijkse intervallen. Er worden zes bladeren verzameld voor DNA-extractie en drie stengels zijn nodig voor RNA-extractie. Plaats het plantmateriaal na verzameling in een cryovial, vries het snel in met vloeibare stikstof en bewaar de monsters bij -80 °C tot aan de extractie.

De drie genotypen groeien met verschillende relatieve snelheden, afhankelijk van de omstandigheden. Onder controlecondities groeit de ingedutte vlasvariëteit storm of de PL-lijn het best. Verschillende lijnen zijn afgeleid van deze ouder, waarbij een grote of L-variëteit krachtiger is dan de kleine of S-variëteit.

Echter, bij een laag nutriëntengehalte groeit S beter dan zowel L als pl. En onder omstandigheden met een hoog nutriëntengehalte groeit L beter dan pl, dat slechts iets beter groeit dan S. Een vergelijking tussen elk van de lijnen die onder de drie verschillende behandelingen zijn gekweekt, onthult dat PL het best groeit onder controleomstandigheden. L groeit het best onder omstandigheden met een hoog nutriëntengehalte, en S groeit vergelijkbaar onder zowel omstandigheden met een hoog nutriëntengehalte als controleomstandigheden.

Deze gegevens tonen aan dat de drie lijnen kunnen worden onderscheiden op basis van hun groei onder de drie omgevingen. Terwijl PL en L beter groeien onder specifieke omgevingen, groeit S ongeveer hetzelfde in alle drie de condities. S is niet in staat om te profiteren van verbeterde voedingsomstandigheden, maar is beter in staat om te groeien onder omstandigheden met zeer lage voedingswaarden.

Voeg voor DNA-extractie buffer AP1 van de Qiagen DNEasy Plant DNA Prep Kit toe aan zes bladeren met steriel zand in een microcentrifugebuis en maal het weefsel met een microvijzel totdat er geen klonten meer zichtbaar zijn. Zet de extractie voort door de instructies van de kit te volgen. Om te beginnen met de RNA-extractie, breng drie stengels van maris plus enkele omliggende bladeren over van een cryobewaarbuis naar een microcentrifugebuis. Voeg steriel zand toe aan de buis en maal het weefsel met een microvijzel tot het fijn is gemalen.

Vortex het monster 15 seconden om de lysis te bevorderen en centrifugeer vervolgens één minuut bij 13.000 RPM om zand en eventuele resten te verzamelen. Voeg de SNAT toe aan de spincolumn en ga verder met de RNA-preparatie volgens de instructies van de fabrikant. Zodra het RNA uit het weefsel is geëxtraheerd, brengt u 10 XDNA-buffer aan in de reactie, in een volume van één tiende van het RNA-monstervolume.

Voeg 30 units DNase toe en incubeer de reactie bij 37 °C gedurende 30 minuten, gevolgd door 70 °C gedurende vijf minuten. Voer de reverse transcriptie uit met de Applied Biosystems RNA-to-cDNA kit. Volgens de instructies van de fabrikant wordt de reactie geïncubeerd bij 37 °C gedurende één uur en vervolgens bij 95 °C gedurende vijf minuten.

Voer ten slotte een run uit van vijf microliters van het cDNA op een 1,5% agarosegel om de opbrengst te bepalen. Zodra het cDNA van de vlasplant is geprepareerd, wordt dit gebruikt voor qPCR. Voer de qPCR uit met behulp van een ABI StepOne-systeem.

Voer alle assays in drievoud uit voor elke run en gebruik het housekeeping-gen Acton als kopienaantalcontrole voor het voorbereiden van de qPCR-reacties. Voeg één µL van het juiste primerpaar toe aan elke buis. Verdun het CD NA tot de juiste concentratie en voeg negen µL toe aan elke buis.

Voeg tot slot 10 µL van de two x cyberg green PCR master mix toe aan elke buis. Stel vervolgens het amplificatieprogramma in volgens de amplificatieprocedure. Bereken de relatieve expressieniveaus op basis van het cyclusgetal voor de drempelwaarde, dat wordt bepaald door de standaardparameters in de step one software en wordt bevestigd door inspectie van de amplificatiecurven.

PCR-amplificatie van het DNA, geïsoleerd uit bladeren op verschillende posities langs de stengel, demonstreert de verschijning van een enkelvoudige kopie van een 5,7 kilobase DNA-fragment, aangeduid als line insertion sequence, of LIS one, wanneer de planten onder inducerende omstandigheden worden gekweekt. LIS one verschijnt wanneer PL wordt gekweekt onder inducerende omstandigheden met een laag nutriëntengehalte en wordt uiteindelijk homozygoot. Hier werden bladmonsters één tot en met zes met wekelijkse intervallen geïsoleerd, waarbij monster één het vroegst na het zaaien was; vervolgens werd het DNA uit de monsters geëxtraheerd.

PCR-amplificatie onthult de aanwezigheid van beide termini van LAS one in alle monsters, behalve in het eerste. Dit komt overeen met het verdwijnen van de unins geïnserteerde site en het gebrek aan bewijs hiervoor bij de vijfde blad-QPCR. Resultaten tonen aan dat de aanwezigheid van LAS one of andere genomische veranderingen geassocieerd met de inductie de expressie van genen in de directe nabijheid van a S one beïnvloedt.

De zes hier getoonde genen vertonen allemaal een differentiële expressie in PL en S; vier van de genen hebben een hogere expressie in pl, dat geen LIS één heeft. Omgekeerd hebben twee genen een hogere expressie in S, dat wel LIS één heeft. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe induceerbare vlaslijnen kunnen worden gekweekt. Zo verandert het genoom als reactie op de groeimgeving en de groeikenmerken van opeenvolgende generaties.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de groeiomstandigheden gereproduceerd moeten worden voor een reproduceerbare inductie van veranderingen. Dat is alles. Ik weet dat velen van u sceptisch zijn over dit fenomeen, maar nu kunt u de waarnemingen zelf reproduceren.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.