Analyse van de pluripotente stamcellen door gebruik te maken van vriescoupes Embryoid Bodies
December 8th, 2010
Pluripotente stamcellen in suspensie te groeien differentiëren in embryoid organen (EBS). Hier laten we zien hoe een hoge kwaliteit EB vriescoupes handig voor het bestuderen van cellulaire en moleculaire aspecten van de embryogenese te verkrijgen, met behoud van hun organisatie als aggregaten.
Deel Een, Inleiding. Hallo, mijn naam is Rafael. Ik ben een postdoc in het lab van Professor Stevens Hans aan de Federale Universiteit van Rio de Janeiro in Brazilië.
Hallo, mijn naam is Ismail. Ik ben een onderzoeksassistent, ook professor. In deze video laten we zien hoe je heldere secties van Android-lichamen kunt voorbereiden.
Dus laten we beginnen. Deel twee, materialen en apparatuur. Voor deze procedure hebben we een inbeddingsmedium nodig voor bevroren specimens.
4% Paraformaldehyde-oplossing voor fixatie van de cellen, sucrose-oplossingen voor cryo-bescherming. Een naald met een licht gebogen punt, een stereomicroscoop voor betere visualisatie van de EBS en een shaker. Deel drie.
Hier worden de menselijke embryolichamen gekweekt in niet-aderente kweekplaten. Met behulp van een pipet groeperen we alle embryolichamen zo dicht mogelijk bij elkaar om ze over te brengen naar een conische buis van 15 milliliter. De EBS worden zorgvuldig geoogst en overgebracht naar de buis.
Het is belangrijk om alle EBS te verzamelen, omdat er niet veel materiaal is. Nadat de EBS zijn afgelopen, wordt het kweekmedium voorzichtig weggegooid. U zou de pellet op de bodem van de buis moeten kunnen zien. Nu kunnen we doorgaan naar de fixatieprocedure.
EBS worden gefixeerd in 4% Paraformaldehyde-oplossing in PBS of fosfaatgebufferde zoutoplossing. Het is belangrijk om de pellet op te schorsen met PFA-oplossing. EBS worden vervolgens gedurende 30 minuten in fixatie-oplossing gefixeerd.
Na fixatie wordt de PFA-oplossing voorzichtig verwijderd. Zorg ervoor dat EBS niet opnieuw worden opgeschort en vervangen door een 10% sucrose-oplossing in PBS om de cryo-bescherming van de ebs te starten, het materiaal wordt 30 minuten in deze oplossing bewaard. Vervolgens verwijderen we voorzichtig de 10% sucrose-oplossing en schorsen de EBS opnieuw op in een 20% sucrose-oplossing.
Nogmaals, EBS worden 30 minuten in deze oplossing bewaard. Ten slotte wordt de 20% sucrose-oplossing verwijderd en vervangen door een 30% sucrose-oplossing in PBS waar het nog 30 minuten wordt bewaard. Nu kunnen we doorgaan met de oriëntatie en blokkering van ebs.
In ons lab gebruiken we lege capsule-schalen als mallen. Voor het blokkeren van ebs is het belangrijk om de binnenwanden van de tip te bedekken met sucrose-oplossing voordat we de ebs verzamelen. Nu kunnen we de EBS voorzichtig verzamelen en wachten tot ze naar de bodem van de tip decanten.
Vervolgens worden de EBS in het midden van de blok geplaatst. Dit zou de uiteindelijke positie van EBS binnenin het blok moeten zijn. Met behulp van een stereomicroscoop en een fijne punt verzamelen en ontladen we zoveel mogelijk sucrose-oplossing.
Altijd voorzichtig om de ebs niet te verzamelen. Met behulp van een naald met een licht gebogen punt worden alle EBS in het midden van het blok gepositioneerd. Ten slotte wordt de resterende sucrose-oplossing verzameld met stukjes filterpapier.
De specifieke locatie van EBS binnenin het blok is erg belangrijk voor het verkrijgen van goede kwaliteitssneden. Hier is een voorbeeld van een slechte EB-positionering binnenin de schaal. Na positionering van EBS en verwijdering van sucrose-oplossing, wordt de schaal gevuld met OCT beginnend vanaf de randen, terwijl altijd wordt gezorgd voor het vermijden van Resus-suspensie ebs.
De resterende luchtbellen worden verwijderd met behulp van een pipet en de schalen worden gedurende 15 minuten geschud. Na agitatie wordt de OCT-blok in droog ijs bevroren.
Op dit punt kunt u het blok verpakt in aluminiumfolie bewaren bij minus 80 graden Celsius voor verdere analyse of doorgaan naar de cryostaat. Deel vier, snijden. Om de cryo-secties te maken, heeft u een wegwerp- of permanent mes, OCT en poly L-lysine voorbehandelde glazen platen nodig. De OCT-blok wordt uit de vriezer gehaald en in de cryostaat bewaard totdat deze minus 20 graden Celsius bereikt.
Het blok wordt vervolgens op de standaard geplaatst en uitgelijnd parallel aan de rand van het mes. EB-monsters zijn veel kleiner dan de meeste andere weefselmonsters, dus het is erg belangrijk om ervoor te zorgen dat het hele oppervlak van het blok tegelijkertijd het mes raakt, waardoor verlies van materiaal wordt geminimaliseerd. Nadat het is gepositioneerd, wordt het blok gesneden in sneden van 10 micrometer, en deze worden direct op de glazen platen verzameld.
De platen kunnen worden bewaard, bij voorkeur bij minus 70 graden Celsius, of op dezelfde dag worden gebruikt. Het materiaal kan worden gekleurd voor immunohistochemie of immunofluorescentie. Conclusie. De hier beschreven methode biedt een redelijk goedkope en eenvoudig te volgen protocol om dunne cryo-secties van embryolichamen te verkrijgen die zijn ontwikkeld uit zowel humane H negen als muis US P een stamcellijnen.
De resulterende cryo-secties kunnen worden gebruikt in een breed scala aan procedures om eiwitexpressie of EB-morfologie te analyseren.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel demonstreert het proces van het verkrijgen van hoogwaardige cryosecties van embryoïde lichamen (EB's) afgeleid van pluripotente stamcellen gekweekt in suspensie. Deze cryosecties zijn essentieel voor het bestuderen van de cellulaire en moleculaire aspecten van embryogenese met behoud van de organisatie van EB's.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Stamceldonderszoek
- Embryogenese
- Cellulaire Differentiatie
Achtergrond
- Pluripotente stamcellen kunnen zich differentiëren in verschillende celtypen.
- Embryoïde lichamen zijn aggregaten die vroege embryonale ontwikkeling nabootsen.
- Het bestuderen van EB's helpt bij het begrijpen van de mechanismen van embryogenese.
- Hoogwaardige cryosecties zijn cruciaal voor gedetailleerde analyse.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te bieden voor het bereiden van cryosecties van EB's.
- Om het bestuderen van cellulaire en moleculaire processen tijdens differentiatie te faciliteren.
- Om de structurele organisatie van EB's in de analyse te behouden.
Gebruikte methoden
- Bereiding van pluripotente stamcellen in suspensiecultuur.
- Inductie van differentiatie in embryoïde lichamen.
- Cryosectietechnieken om hoogwaardige monsters te verkrijgen.
- Analyse van cellulaire en moleculaire kenmerken van EB's.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle bereiding van cryosecties van EB's.
- Behoud van EB-organisatie in cryosecties.
- Verbeterde mogelijkheid om embryogenese op cellulair niveau te bestuderen.
- Aangetoonde methode kan worden toegepast in verschillende onderzoekscontexten.
Conclusies
- De methode maakt gedetailleerde analyse van EB's mogelijk.
- Hoogwaardige cryosecties zijn waardevol voor embryonale studies.
- Deze aanpak kan de begrip van stamceldifferentiatie bevorderen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
High-quality cryosectioning of embryoid bodies (EBs) derived from pluripotent stem cells enables precise spatial analysis of differentiation markers and tissue organization, supporting early discovery and target validation in regenerative medicine and developmental biology. This capability enhances predictive confidence in stem cell-based models and informs risk-adjusted decisions at key inflection points in the discovery pipeline. Reliable EB cryosections facilitate cross-functional data integration for portfolio advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of pluripotency and lineage-specific marker expression within three-dimensional EB structures.
- Supports biological de-risking by clarifying differentiation pathways and cellular heterogeneity.
- Provides spatial context for functional target validation in stem cell-derived systems.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of standardized EB cryosections for reproducible immunofluorescence and in situ hybridization assays.
- Enables quantitative assessment of protein and RNA distribution across EB sections.
- Supports assay scalability and platform reuse for compound screening in stem cell models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro differentiation with in vivo developmental processes for disease-relevant modeling.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by preserving EB architecture and marker localization.
- Provides mechanistic insights that inform translational biomarker strategies.
Pipeline & Workflow Integration
This cryosectioning method integrates into the discovery continuum from early stem cell differentiation studies through assay development and preclinical model validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on pluripotency and lineage commitment within EBs.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for marker expression and tissue organization.
- Analytics: Enables spatially resolved measurements for comparative analysis of differentiation conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro findings with in vivo developmental relevance when supported by marker expression patterns.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow for EB analysis applicable across multiple stem cell lines and differentiation protocols.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in stem cell differentiation and target validation.
- Operational Value: Standardizes EB sectioning for reproducible downstream analyses.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing robust spatial and molecular data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of stem cell-based discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryosectioning and handling of delicate three-dimensional cell aggregates.
- Needs access to cryostats, embedding media, and imaging infrastructure for downstream analysis.
- Demands cross-team standardization of EB preparation and sectioning protocols.
- Adaptable to various pluripotent stem cell lines and differentiation models with attention to EB size and morphology.
- Dependent on careful orientation and embedding to ensure high-quality, interpretable sections.
