Geautomatiseerde Sholl Analyse van Gedigitaliseerde Neuronale morfologie op meerdere schalen

Deze video demonstreert een procedure om de morfologie van dendrieten en axonen, gezamenlijk neurieten genoemd, te analyseren met behulp van een semi-geautomatiseerd programma om lokale veranderingen waar te nemen. Eerst wordt Neuron J-software gebruikt om eight-bit TIFF-afbeeldingen van neuronen te traceren om de positie van neurietsegmenten te identificeren. Vervolgens wordt Neuron Studio-software gebruikt om structurele informatie over de connectiviteit tussen neurieten te definiëren.

Ten slotte wordt het bonfire MATLAB-programma uitgevoerd om morfologische gegevens uit de cellen te extraheren, inclusief sholl-analyse, evenals het aantal vertakkingspunten van neurieten en neurietuiteinden. De resultaten tonen lokale veranderingen in de neurietmorfologie op basis van de uitvoering van sholl-analyse op subregio's van de neurietboom. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals handmatige sholl-analyse, is dat het programma semi-geautomatiseerd is, wat de efficiëntie van de analyse aanzienlijk verhoogt en auditing van de gegevens mogelijk maakt, zodat de nauwkeurigheid van de analyse kan worden geverifieerd.

De procedure wordt gedemonstreerd door Hirsch AWA, een undergraduate student die deze zomer in het Firestein-lab werkt. Om het Bonfire-programma te gebruiken voor de analyse van de morfologische kenmerken van de neurieten in een 8-bit tiff, moeten er afbeeldingen van individuele neuronen worden verkregen nadat het Bonfire-programma is gedownload. De programma-instellingen moeten worden aangepast op basis van de beeldresolutie van de afbeeldingen die u wilt analyseren; vervang in het gedeelte voor de Bonfire-parameters van het Bonfire-programma de huidige waarde voor de variabele pixels-conversie door de waarde van de beeldresolutie van uw afbeeldingen.

Om de data met bonfire te kunnen analyseren, moeten de bestanden in een specifieke structuur worden georganiseerd, bestaande uit een hoofdmap, een bonfire-map met de bonfire MATLAB M-bestanden, submappen voor elke verschillende conditie en de celafbeeldingsbestanden binnen de respectievelijke conditiemappen. Begin met het voorbereiden van de afbeelding voor het traceren. Voor dit experiment worden alleen de dendrieten getraceerd om veranderingen in de dendritische morfologie te analyseren. Begin met het voorbereiden van de afbeelding voor het traceren.

Open de afbeelding door op de open-knop in de neuron J-werkbalk te klikken en selecteer de afbeelding die u wilt traceren. Pas nu de grootte van de afbeelding aan door op de maximize-knop te klikken om de helderheid en het contrast van de afbeelding aan te passen, zodat u alle neurieten kunt visualiseren; selecteer 'image' in de neuron J-werkbalk en kies vervolgens 'adjust brightness contrast'. Selecteer om te beginnen met traceren de knop 'add traces' in de neuron J-werkbalk. Traceer de omtrek van het cellichaam.

Select vervolgens de knop label tracings op de neuron J-werkbalk en selecteer N one uit het dropdownmenu van de tracing ID, selecteer type zero six in het venster met de neuron J-attributen en selecteer Okay. Om te beginnen met het traceren van de neurieten, selecteert u de knop add traces op de neuron J-werkbalk en voegt u een trace toe langs elke neurietvertakking van belang. Het is bij voorkeur dat de segmenten die u tekent stoppen bij elk vertakkingspunt, waarbij elke dochtervertakking vanaf dat punt als een nieuwe trace begint.

Selecteer de knop 'save tracings' op de Neuron J-werkbalk en sla de zojuist gemaakte tracing op in dezelfde map als het originele afbeeldingsbestand. Exporteer vervolgens de trace-bestanden en de trace-identificatiebestanden vanuit Neuron J. Selecteer de knop 'export trace' op de Neuron J-werkbalk. Selecteer nu de optie 'tab delimited text files separate file for each tracings' in het exportdialoogvenster van Neuron J en selecteer 'okay'; laat Neuron J de bestandsnamen en de opslaglocatie bepalen.

Selecteer de knop measure tracings op de neuron J-werkbalk, selecteer vervolgens de optie display tracings measurements in het neuron J-meetvenster en selecteer run in het neuron J-tracingsvenster. Selecteer daarna save as en sla het bestand op. De bestandsnaam moet exact overeenkomen met de naam van het oorspronkelijke afbeeldingsbestand, gevolgd door _info, en mag geen bestandsextensie van drie letters bevatten. Controleer of uw computer niet automatisch een XLS-bestandsextensie toevoegt.

Als dat het geval is, moet de bestandsextensie handmatig worden verwijderd. Reorganiseer eerst de mappen met bonfire load door MATLAB te openen en op de knop met de drie puntjes rechtsboven in het opdrachtvenster te klikken. Selecteer de bonfire-map in uw hoofdmap in het venster voor het zoeken naar mappen, typ bonfire load in het opdrachtvenster en druk op enter.

Selecteer in het venster 'Kies map' de map met de conditie die u wilt analyseren en selecteer OK. De mapstructuur wordt nu georganiseerd door submappen voor cellen aan te maken die alle gegevens voor elke individuele cel bevatten. Typ nu om bestanden van het type filename_premium.swc aan te maken bonfire_NDF2swc in het opdrachtvenster en druk op enter.

Select in het venster 'Map zoeken' dezelfde conditiemap die zojuist is gereorganiseerd met bonfire load, en klik op OK. Dit maakt in elke celmap voor de gekozen conditie een WC-bestand aan. Elke celmap zal vijf bestanden bevatten.

De originele TIF-afbeelding, het NDF-bestand, de underscore-informatie, het trace-identificatiebestand, een TXT-bestand en een swc-bestand. Voordat u Neuron Studio gebruikt, raden we u aan u vertrouwd te maken met de functies en sneltoetsen van het programma. Er is een uitstekende online gebruikershandleiding beschikbaar, en kennis van de sneltoetsen zal u veel tijd besparen.

Open als eerste het programma Neuron Studio en selecteer 'Bestand openen' in de werkbalk van Neuron Studio; zoek het TIF-beeld van het neuron dat u wilt bewerken en open dit. Selecteer 'Run settings' en voer in elk van de drie vakken een waarde in.

Selecteer in het venster voor voxelgrootte de optie 'file import s wc'. Selecteer het juiste s WC-bestand dat overeenkomt met het bestand waarmee u wilt werken. Het afbeeldingsbestand wordt nu overgelegd met het trace-beeld.

Het cellichaam moet worden bedekt met een rode cirkel om neurieten te koppelen. Gebruik de neuriet-tool om knooppunten te verbinden, zodat elk vertakkingspunt dat door gele knooppunten wordt weergegeven, slechts twee takken kan vormen. Alle traceringen moeten continu verbonden zijn met het cellichaam.

Om gegevens uit Neuron Studio te exporteren, selecteert u bestand, sla neurieten op, en sla deze op onder de standaardnaam om de swc-bestanden te controleren op fouten via bonfire trace. Typ dit in het opdrachtvenster en druk op enter. Selecteer in het venster 'map zoeken' de conditiemap die de zojuist verwerkte gegevens bevat en selecteer oké om eventuele fouten in de afbeeldingen in de map te controleren.

Het programma genereert afbeeldingen waarop de locatie van de fout wordt weergegeven om morfologische gegevens uit de dot S WC-bestanden te extraheren. Typ bonfire in het opdrachtvenster en druk op enter. Selecteer in het venster 'Map zoeken' de conditiemap die u wilt analyseren en selecteer oké voor elk van de betreffende neuronen.

De bonfire-analyse genereert een grafiek van de neuronale morfologie samen met de schouderringen die bij de analyse zijn gebruikt. Daarnaast genereert het bonfire-commando het MAT-bestand dat alle morfologische informatie bevat die uit de analyse is voortgekomen. Om de voorlopige grafieken van het datatype van de bonfire-resultaten in het MATLAB-opdrachtvenster te bekijken, selecteert u in het venster 'Map zoeken' de conditiemap van de gewenste conditie en klikt u op OK.

Het venster voor het zoeken naar mappen zal tijdelijk sluiten en opnieuw openen, waardoor extra condities kunnen worden geselecteerd. Zodra de condities zijn geselecteerd, selecteert u annuleren om het selectieproces te verlaten. Bonfire geeft samenvattende grafieken weer, inclusief de gegevens uit de geselecteerde conditiemappen; om de morfologische gegevens naar Excel te exporteren, typt u bonfire Export in het MATLAB-opdrachtvenster.

Selecteer in het venster 'Map zoeken' de conditiemap die de gegevens bevat die u wilt exporteren en klik op OK. Bonfire Export maakt Excel-bestanden van de morfologische gegevens en plaatst deze in de geselecteerde conditiemap. We laten u nu een voorbeeld zien van de gegevens die door het Bonfire-programma zijn gegenereerd voor een dataset met twee condities.

Dit zijn voorbeeldbeelden van beide condities in omgekeerde kleuren. Aan deze beelden kan worden gezien dat conditie één meer dendrieten bevat dan conditie twee. Dit fenomeen kan ook worden waargenomen in een verscheidenheid aan grafieken die door het bonfire-programma worden gegenereerd.

Omdat het bonfire-programma de analyse uitvoert op subregio's van de dendrieten, kunnen de toegenomen dendrieten in conditie één gemakkelijk worden geïdentificeerd; het uitzetten van de Sholl-curve van de totale dendritische boom laat zien dat er voor neuronen in conditie één meer dendrieten distaal van het cellichaam aanwezig zijn. Het uitzetten van het gemiddelde aantal vertakkingspunten en eindpunten per cel laat zien dat conditie één zowel meer vertakkingspunten als meer eindpunten bevat dan conditie twee. Het gemiddelde aantal uitlopers per cel wordt getoond voor primaire, secundaire, tertiaire of hogere orde dendrieten. Er zijn meer tertiaire en hogere orde dendrieten voor conditie één; het uitzetten van het gemiddelde aantal uitlopers per cel voor wortel-, intermediaire en terminale dendrieten laat zien dat conditie één meer intermediaire of terminale uitlopers heeft dan conditie twee.

Hier worden de shoal-analysecurves voor segmentidentiteit getoond, waarbij de segmenten zijn gegroepeerd als primair, secundair, of tertiair of hoger. De toename in tertiaire dendrieten vindt distaal van het cellichaam plaats voor neuronen van conditie één. De shoal-analysecurves voor segmentidentiteit worden getoond waarbij de segmenten zijn gegroepeerd als wortelsegmenten, intermediaire segmenten of terminale segmenten.

De toename van zowel de intermediaire als de terminale dendrieten in conditie één vindt distaal van het cellichaam plaats. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in het uitvoeren van een shoal-analyse met het bonfire-programma om lokale veranderingen in de neuromorfologie te observeren.