Name: Meting van bio-elektrische stroom met een Vibrating Probe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-04T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Leer hoe je niet-invasieve vibrerende sondes vervaardigt en calibreert om bio-elektrische stromen in biologische systemen te meten. Deze gevoelige techniek biedt waardevolle inzichten voor medisch onderzoek naar wondgenezing.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn dankbaar dat professor Richard Borgens, Centrum voor Onderzoek Verlamming, Purdue University, voor hulp bij het samenstellen van de vibrerende sonde systeem. Dit onderzoek werd ondersteund door NEI verlenen NIH 1R01EY019101 te MZ en BR, en deels door subsidies van het California Institute of Regeneratieve Geneeskunde RB1-01417, NSF MCB-0951199, en door een onbeperkte subsidie ​​van Onderzoek om Blindheid, UC Davis Oogheelkunde Prevent.

1. Probe Fabricage Lege sondes worden gekocht van World precisie-instrumenten (elgiloy / RVS parylene-coated micro-elektroden) (zie "Tabel van specifieke reagentia en apparatuur 'hieronder). De sonde wordt gesneden 25-30 mm achter de tip en ongeveer 5 mm van de parylene isolatie aan de afgesneden uiteinde weggeschraapt met een scalpel (# 11 blad) om een ​​goede verbinding te verzekeren. De sonde is gemonteerd in een gouden R30-aansluiting met behulp van elektrisch geleidende zilver-loaded epoxy (bijv. Rite-Lok SL65) [* zie toelichting hieronder]. De sonde is 's nachts bij kamertemperatuur bewaard om de epoxy uit te harden mogelijk te maken. Vervolgens wordt de probe top bedekt met goud en platina vervolgens, met behulp van een nano-amp voeding. De sonde wordt gespoeld in aceton en verbonden met de negatieve uitgang van een nano-amp voedingsbron. De sonde tip is bekeken onder een dissectiemicroscoop (x40) en eerste geplaatst in goud plating oplossing (kalium dicyanoaurate (0,2% w / v EEA (CN) 2 in gedestilleerd water (dH 2 O)). Een verwijzing draad is aangesloten op de positieve output en geplaatst in oplossing vult het circuit. Een stroom van 5 nA wordt toegepast voor 5 min, vervolgens verhoogd tot 20 nA totdat de punt is ongeveer de helft van de gewenste uiteindelijke grootte (ongeveer 10-15 um). De sonde is gespoeld in dH 2 O en vervolgens geplaatst in platinizing oplossing (chloorplatinazuur hydrateren; 1% w / v H2PtCl6 * 6H 2 O) plus lood (II) acetaat trihydraat (0,1% w / v Pb (CH3CO 2) 2 * 3H 2 O in dH 2 O). Een stroom van 250 nA wordt toegepast voor 5 min, daarna verhoogd tot 500 nA totdat de punt is ongeveer 80% van de gewenste uiteindelijke grootte. De stroom is verhoogd tot 1 uA en toegepast in 1 sec uitbarstingen tot de laatste tip diameter is verkregen (ongeveer 30-35 micrometer). Tot slot, de tip is gespoeld in dH 2 O. Probes kunnen opslaan voor onbepaalde tijd worden op kamertemperatuur. Als probes zijn beschadigd, de gouden R30 connectors kan worden hergebruikt. [* Opmerking: Sommige sonde systemen hebben de sonde montage direct aangesloten op de versterker om het signaal te dragen. Andere systemen hebben een aparte montage punt en het signaal connector. In het laatste geval is een korte (2-3 cm) draad met een R30-connector aan het ene uiteinde gesoldeerd aan de eerste R30-aansluiting voor het monteren van de sonde (zie figuur 2A).] 2. Probe System De sonde is verbonden aan een piëzo-elektrisch bender gemonteerd op een 3-dimensionale micro-klepstandsteller (figuur 1). Sonde trilling wordt gecontroleerd door de vibrerende sonde voeding, die maakt het ook mogelijk aanpassing van de trillingen amplitude en frequentie. De sonde voeding stuurt een verwijzing signaal naar de lock-in versterker, die ook toont de vibratie frequentie en fasehoek. Het is ook nuttig om een ​​oscilloscoop aansluiten, zodat een heeft een snelle visuele referentie van de sonde trillingen. Het signaal van de sonde gaat naar de lock-in versterker. De sonde en het te meten monster te kunnen worden bekeken met een dissectie microscoop (vergroting x6 tot x40) met glasvezel-verlichting. Tijdens de kalibratie en monster metingen moeten een referentie en een grond (aarde) draad in de oplossing (zie figuur 2B). De versterker is aangesloten op een computer via een analoog-digitaal (i / o) interface. De gegevens worden opgenomen met Whole Cell Strathclyde Elektrofysiologie Software Program (WinWCP). Lock-in versterker instellingen: Gevoeligheid [200 uV], Dynamic resolutie [normaal], Offset [op], Expand [x1], Time Constant: pre [10 s], post [0.1 s]. Als er een snellere respons nodig is, kan de pre Time Constant worden teruggebracht tot drie s. De offset-controle wordt gebruikt om de sonde te traceren te brengen naar het midden van het scherm in de buurt. Als grote respons worden verwacht, kan het spoor worden verplaatst naar boven of beneden. WCP software-instellingen: Record Duur [204,8 s], samples per kanaal [1024], Sampling interval [0.2 s], Voltage Range [+ / - 0,2 V]. Als er grote stromen worden verwacht, kan de Voltage Range worden verhoogd tot 1 V of 5 V. 3. Probe-instellingen Nieuwe sondes moeten worden getest en hun unieke frequentie en fasehoek bepaald. De nieuwe sonde wordt geplaatst in de kalibratie kamer met fysiologische zoutoplossing (Figuur 2B). De voeding is ingeschakeld en de frequentie omhoog gedraaid tot de maximale trilling wordt waargenomen. Dit is de resonantiefrequentie van de sonde. Met behulp van de sonde op deze frequentie kan instabiliteit veroorzaken en produceren ruis in de opname, zodat de sonde is 'de-getuned "door het aftrekken van 10 Hz tot de sonde werkt frequentie (meestal 150 tot 200 Hz) te geven. De vibratie amplitude wordt aangepast, zodat de sonde trilling afstand is hetzelfde als de tip diameter, zodat wanneer de sonde is een 'dubbele beeld' van de sondepunt getrild wordt gezien (zie figuur 2B). Voor het bepalen van de fasehoek, wordt de sonde geplaatst in een zoutoplossing in de kalibratie kamer en een stroom van 1,5 uA / cm 2 toegepast herhaaldelijk. De fasehoek op de lock-in versterker is aangepast tot er geen reactie. Optellen of aftrekken van 90 ° ten opzichte van dezehoek geeft de maximale respons, en deze hoek is de sonde werkt fasehoek. De frequentie en fasehoek voor elke probe worden genoteerd voor toekomstig gebruik. Tijdens een experiment, is het belangrijk dat deze instellingen van frequentie, amplitude en fasehoek niet worden gewijzigd, omdat dit veranderen de sonde de reactie. Voor het gemak, als de huidige stroomt 'Zuid-to-Noord', moet dit produceren een opwaartse doorbuiging (hier aangeduid als 'piek') in de opname te sporen, en de stroom 'Noord-to-Zuid' moet een neerwaartse doorbuiging show ( zie figuur 3A). Als dit de verkeerde manier, dan zal het toevoegen van 180 ° om de fasehoek oplossen door het opgooien van de antwoorden ronde. Zie Reid et al.. 1 voor gedetailleerde informatie over de theorie achter probe-functie, kalibratie, etc. Kalibratie: De reactie van de sonde naar een 'gestandaardiseerde' stroom van exact 1,5 uA / cm 2, toegepast op de sonde in een calibratie kamer, wordt gebruikt om de huidige te berekenen in de steekproef (zie figuur 2B, 3A). Voorafgaand aan monster meting, is de sonde gekalibreerd in passende oplossing, bijvoorbeeld BSS + kunsttranen Oplossing voor hoornvlies. De stroom wordt toegepast in twee richtingen: Zuid-Noord en Noord-Zuid, het produceren van een opwaartse en een neerwaartse afbuiging, respectievelijk, gelijk aan uiterlijke en innerlijke stromingen, afhankelijk van de oriëntatie van het monster. De sonde trace moet een stabiele basislijn en een laag geluidsniveau (vergelijk Fig. 3A en 3B). De sonde is gekalibreerd aan het eind van het experiment in de gebruikte oplossing ter compensatie van osmolaliteit veranderen als gevolg van verdamping. Bij het analyseren van data, kunnen metingen van de eerste helft van het experiment worden berekend op basis van het uitgangspunt kalibratiewaarden, en metingen uit de tweede helft berekend op basis van het einde kalibratie. Voorbeeld Meting: Een kamer kan worden ontworpen om vast te houden en te immobiliseren het monster. Bijvoorbeeld, Figuur 3C toont petrischalen met draad lussen voor de ogen voor het hoornvlies metingen te houden. Het schaaltje met fysiologische zoutoplossing wordt onder de microscoop ontleden en het gebied van de rente op het monster geplaatst in focus in het gezichtsveld. De sonde wordt dan geplaatst in oplossing en georiënteerd parallel aan het monster oppervlak en ook in focus dus het is op hetzelfde niveau als de punt op het monster te meten. De sonde is zo ver verplaatst is handig (bv 1-2 cm) uit de buurt van het monster, de vibratie ingeschakeld (en de computer software ingesteld om op te nemen) om een ​​stabiele (horizontaal) baseline (zie figuur 4A) vast te stellen. De sonde wordt dan verplaatst naar het meten van positie, ongeveer 50 um van het oppervlak. Toen de nieuwe ('piek') waarde stabiel is, is de sonde terug naar referentie-positie en het trace keert terug naar de uitgangswaarde. Dit kan worden herhaald op regelmatige tijdstippen te timelapse gegevens te produceren, of het monster verplaatst / gedraaid licht en herhaald op verschillende posities om ruimtelijke actuele kaartgegevens opbrengst (zie figuur 4B, 5B). Data Analyse: De gegevens zijn geanalyseerd met behulp van WinWCP (zie figuur 5A). De horizontale rode 'nul' lijn wordt verplaatst naar boven of beneden dus het is parallel aan het spoor baseline voorafgaand aan de meting piek. De verticale groene lijn te meten wordt verplaatst over naar het spoor baseline. De output te lezen in het groen aan de onderkant van de groene lijn moet worden dicht bij nul (bijvoorbeeld 0,00012). Dit aantal geeft de differnce tussen het punt waar de rode en groene lijnen elkaar kruisen, en de blauwe traceren. De rode lijn wordt dan verplaatst tot deze parallel met de top van de piek. De groene uitgang te lezen is de grootte van de piek in mV. De gegevens voor alle metingen pieken, en de kalibratie data, worden in een Microsoft Excel spreadsheet template (zie tabel 1). Relevante informatie, zoals de datum, de sonde nummer, voltage (VR), oplossing gebruikt, het meten van posities, tijdstippen, etc. kunnen ook worden ingevoerd in de spreadsheet. De huidige richting (in of uit van de steekproef: 'i / o') is opgemerkt, en naar binnen stromen krijgen ook een negatieve waarde in de 'piek' kolom. De stroom in de rechterkolom wordt berekend volgens de formule: = huidige piek * (1.5/calibration), waar 1,5 de stroom in uA / cm 2 toegepast bij kalibratie. Dus: 'unw1' = 12,45 * (1.5/56.12) = 0,33276907 uA / cm 2. 4. Geheimen tot succes Zoals in alle elektrofysiologie, de juiste aarding (aarding) van vitale apparatuur helpt om om ruis te elimineren. Dus, ten minste de micro-klepstandsteller en het chassis van de microscoop moet worden geaard, en misschien ook de lichtbron (zie figuur 1). De gebruiker kan ook een bron van statische elektriciteit, zodat aarding via een pols-band kan instabiliteit van de sonde in een aantal gevallen te voorkomen, maar is niet altijd noodzakelijk. Een kooi van Faraday is niet nodig, omdat de lock-in versterker filtert alle frequenties (bijv. 60 Hz uit elektriciteitsnet), afgezien van de frequentie van de sonde is trilt op. Een trillingsisolatie tabel is nuttig maar niet noodzakelijk. Een solide, stabiele bank of tafel werkt net zo goed. Afgezien van de basisinformatie in het Excel-spreadsheet (zie hierboven) is het nuttig om op te nemen in een lab-boek bijkomende nuttige informatie, zoals veranderingen in temperatuur, drug aanvullingen, etc. Als foto's worden gemaakt naar beneden de microscoop, let op de vergroting. Indien relevant, is het ook nuttig om een ​​schets van het monster (s) waarop positie en / of oriëntatie van probe metingen (zie figuur 6). Uitdagende stappen <ol class="lalpha"><li> Probe te maken: er moet een goede elektrische verbinding tussen de sonde en de R30 aansluiting. Als er niets gebeurt in de galvanische stadium, dan is dit waarschijnlijk de oorzaak. </li><li> Kalibratie: gebruik geschikte zout-of kweekmedium voor de sample die u zal worden gemeten. Niet over-of onder-fill de kalibratie kamer, want dit kan de respons wijzigen. Het oppervlak van de vloeistof moet vlak zijn aan de bovenkant van de kamer. </li><li> Voorbeeld metingen: Plan van te voren, hoeft bijvoorbeeld moet je een speciale kamer te houden / mount de steekproef (zie figuur 3C) maken? Bij het meten van een monster, de sonde moet worden georiënteerd met de lange as parallel aan het monster oppervlak, zodat de sonde de richting van de trilling (en dus de richting van de huidige gemeten) loodrecht staat op het monster oppervlak (bijvoorbeeld, zie figuur 4B ). Het monster kan en / of gedraaid voor metingen op verschillende posities worden verplaatst. Het is belangrijk om een ​​consistente afstand tussen de sonde en het monster oppervlak te behouden bij het meten. De gemeten stroom is evenredig met de afstand van het monster oppervlak, als de sonde beweegt weg van het monster oppervlak, zakt de stroom door de inverse kwadraat wet. Dat wil zeggen, bij het meten van een stroom wordt gegenereerd op het monster oppervlak, ontdekt de stroom is omgekeerd evenredig met het kwadraat van de afstand van het oppervlak. Een oculairgraticule kan worden gebruikt om de afstand tussen de sonde en het monster oppervlak te beoordelen. </li></ol> Het oplossen van problemen <ul><li> Probleem: geen reactie kalibratie. Oplossing: Controleer of zout is contact op te nemen beide elektroden. Controleer de accu in de constante stroom kalibrator. </li><li> Probleem: kleine respons. Oplossing: schone sonde in dH 2 O en / of aceton. Check-fase hoek. </li><li> Probleem: ruis of onstabiele basislijn (zie figuur 3B). Oplossing: Controleer de aarding draden. </li><li> Probleem: trace springt het scherm. Oplossing: niet toegestaan ​​sonde om te proeven aan te raken. </li></ul> 5. Representatieve resultaten Figuur 3A toont een goed voorbeeld van een kalibratie-trace. Let op de stabiele (horizontaal) baseline, een laag geluidsniveau en een grote respons. Ter vergelijking, Figuur 3B toont een luidruchtige trace met instabiele baseline. De huidige metingen op verschillende posities op een muis hoornvlies wond zijn weergegeven in figuur 4B. Het bovenste paneel toont de sonde posities, het middelste paneel toont de sonde sporen zoals opgenomen op de computer en het onderste paneel is een grafiek van de stromen aan de verschillende posities, met een profiel van de huidige wond. Figuur 5B toont metingen op een muis huid wond gemaakt op regelmatige tijdstippen om gegevens op de wond huidige tijd-cursus te produceren. <img src="/files/ftp_upload/2358/2358fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Vibrating probe-systeem. Zie de tekst voor een gedetailleerde beschrijving. Blauwe tekst beschrijft de functie van de aansluitdraden. Groene symbolen tonen aarding punten. <img src="/files/ftp_upload/2358/2358fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. A. Probe montage. De sonde is gelijmd in een gouden R30 connector met zilver-loaded epoxy, voorafgaand aan electroporating. In sommige systemen, is een tweede connector met een korte draad om het signaal te dragen gesoldeerd op. Schaalbalk 3 mm. De platina bal is niet op schaal. B. Probe kalibratie. De constante stroom kalibrator (links) van toepassing is een stroom van 1,5 uA / cm 2 om de sonde in de kalibratie kamer (rechts). Linksonder: close-up van een sonde. Wanneer de sonde in trilling wordt gebracht (rechts onder), is de amplitude aangepast, zodat een dubbel beeld van de tip wordt gezien. Schaalbalk 100 urn. <img src="/files/ftp_upload/2358/2358fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. A. Sonde kalibratie op te sporen. Voorbeeld van een goede callibrage te traceren, met stabiele baseline, een laag geluidsniveau en een grote respons. Stroom die Zuid-to-Noord geeft een opwaartse doorbuiging en de stroom die Noord-to-Zuid levert een neerwaartse afbuiging. B. Een instabiele, luidruchtige sonde te traceren. C. Chambers gemaakt voor het monteren van de muis (links) of rat (rechts) ogen voor hoornvlies metingen. Schaalbalk 5mm. <img src="/files/ftp_upload/2358/2358fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Bewijs meting voorbeelden. A. Een stabiele basislijn is opgericht met de sonde in referentiepositie 1-2 van het monster. Als de sonde wordt verplaatst naar het meten van positie in de buurt van het monster, detecteert eenhuidige en het spoor afbuigt naar boven (buiten de huidige). B. Metingen op verschillende posities in een muis hoornvlies zou doen. Probe is georiënteerd evenwijdig aan het oppervlak, zodat trillingen loodrecht. Opwaartse pieken vertonen naar buiten stromen. Maximale stroom is gezien op de wondranden (posities B &amp; F). Het schema van de sonde wordt getoond bij het meten van positie F (rechts wondrand). Schaalbalk 300 um. <img src="/files/ftp_upload/2358/2358fig5.jpg" alt="Figuur 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5. A. Het analyseren van probe sporen. Bovenste paneel: de rode nullijn wordt verplaatst naar boven of beneden dus het is parallel met het trace baseline, dan is de groene lijn te meten wordt verplaatst over naar de baseline, zodat de output te lezen in het groen ligt dicht bij nul (0,00012). Onderste paneel: de rode lijn wordt dan verplaatst tot deze parallel met de bovenkant van het spoor piek, en de uitgang te lezen geeft de grootte van de piek in mV (12.45). Stroom wordt berekend uit dit met behulp van de kalibratie gegevens (zie tabel 1). B. Mouse huid wond timelapse gegevens. De huidige voordat verwonden wordt getoond op het moment nul (rood symbool). Metingen werden uitgevoerd op dezelfde positie op een muis huid wond op regelmatige tijdstippen na verwonding. Na de eerste voorbijgaande naar binnen stromen (onder nul), de huidige omgekeerd en de uiterlijke stroom (positieve) steeg langzaam en vlakten. <img src="/files/ftp_upload/2358/2358fig6.jpg" alt="Figuur 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 6"> Figuur 6. Lab-boek schetsen laten zien sonde meet-posities. A. Rat hersenen; rode stippen geven het meten van posities en probe symbolen weer te geven probe oriëntatie. B. Rat hoornvlies wond; rode stippen geven het meten van posities en pijlen geven de richting van de huidige gemeten. <img src="/files/ftp_upload/2358/2358tab1.jpg" alt="Tabel 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabel 1"> Tabel 1. Voorbeeld van een Excel-spreadsheet voor het opslaan en kwantificeren sonde gegevens. pN2_cal1 = start calibratie, cal + en cal-= calibratie waarden in mV; VR = spanningsbereik, piek = monster metingen in mV, i / o = stroom van de huidige (in of uit van het monster).

<ol><li>Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+measurement+of+bioelectric+currents+with+a+vibrating+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Non-invasive measurement of bioelectric currents with a vibrating probe.</a> Nat. Protoc. 2, 661-9282 (2007).</li>
<li>Reid, B., Song, B., McCaig, C. D., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+in+rat+cornea%3A+the+role+of+electric+currents%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Wound healing in rat cornea: the role of electric currents.</a> FASEB J. 19, 379-386 (2005).</li>
<li>Lois, N., Reid, B., Song, B., Zhao, M., Forrester, J. V., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric+currents+and+lens+regeneration+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Electric currents and lens regeneration in the rat.</a> Exp. Eye Res. 90, 316-323 (2010).</li>
<li>Wang, E., Reid, B., Lois, N., Forrester, J. V., McCaig, C. D., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+inhibition+of+lens+epithelial+cell+proliferation%3A+an+additional+factor+in+secondary+cataract%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Electrical inhibition of lens epithelial cell proliferation: an additional factor in secondary cataract.</a> FASEB J. 19, 842-844 (2005).</li>
<li>Guo, A., Song, B., Reid, B., Gu, Y., Forrester, J. V., Jahoda, C., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+physiological+electric+fields+on+migration+of+human+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Derm%22%5BJournal%5D)">Effects of physiological electric fields on migration of human dermal fibroblasts.</a> J. Invest. Derm. , (2010).</li>
<li>Reid, B., Song, B., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric+currents+in+Xenopus+tadpole+tail+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Electric currents in Xenopus tadpole tail regeneration.</a> Dev. Biol. 335, 198-207 (2009).</li>
<li>Zhao, M., Song, B., Pu, J., Wada, T., Reid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+signals+control+wound+healing+through+phosphatidylinositol-3-OH+kinase-%CE%B3%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Electrical signals control wound healing through phosphatidylinositol-3-OH kinase-γ.</a> 442, 457-460 (2006).</li>
<li>Reid, B., EO, G. raue-H. ernandez, Mannis, M. J., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+endogenous+electric+currents+in+human+corneal+wounds+-+a+novel+approach+of+bioelectric+stimulation+without+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Modulating endogenous electric currents in human corneal wounds - a novel approach of bioelectric stimulation without electrodes.</a> Cornea. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultrasensitive+vibrating+probe+for+measuring+steady+extracellular+currents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">An ultrasensitive vibrating probe for measuring steady extracellular currents.</a> J. Cell Biol. 63, 614-628 (1974).</li>
<li>Hotary, K. B., Nuccitelli, R., Robinson, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computerized+2-dimensional+vibrating+probe+for+mapping+extracellular+current+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">A computerized 2-dimensional vibrating probe for mapping extracellular current patterns.</a> J. Neurosci. Meth. 43, 55-67 (1992).</li>
<li>Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+ion+currents+and+DC+electric+fields+in+multicellular+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectromagnetics+Supplement%22%5BJournal%5D)">Endogenous ion currents and DC electric fields in multicellular animal tissues.</a> Bioelectromagnetics Supplement. 1, 147-157 (1992).</li>
<li>Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioelectric+mechanisms+in+regeneration%3A+Unique+aspects+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Bioelectric mechanisms in regeneration: Unique aspects and future perspectives.</a> Seminars in Cell Dev. Biol. 20, 543-556 (2009).</li>
<li>Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric+fields+in+wound+healing+-+An+overriding+signal+that+directs+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Electric fields in wound healing - An overriding signal that directs cell migration.</a> Seminars in Cell Dev. Biol. 20, 674-682 (2009).</li>
</ol>

Beschrijven we een low cost, basic, maar zeer gevoelige vibrerende sonde systeem voor het meten van niet-invasieve elektrische stroom in een verscheidenheid van biologische systemen. Eventuele wijzigingen <ol><li> Als platinum / iridium elektroden (Wereld precisie-instrumenten; cat # PTM23B20) zijn in plaats van roestvrij staal gebruikt, dan is de goudlaag stadium kan worden geëlimineerd. </li></ol> Toepassingen We hebben de vibrerende sonde...

<table><tbody><tr><td>Eligoy-roestvrijstalen elektrode</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>SSM33A70</td><td>76 mm, 7 M&amp;#937;, 1-2&amp;#x03BC;m tip</td></tr><tr><td>Gouden R30-connector</td><td>www.vectorelect.com</td><td>R30</td><td>Herbruikbaar</td></tr><tr><td>Zilverhoudende epoxy</td><td>3M</td><td>SL65</td><td>Meng 1 deel hars met 1 deel harder</td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>Olympus Corporation</td><td>SZ40</td><td>Vergroting x6 tot x40</td></tr><tr><td>Kaliumdicyanoauraat (KAu(CN)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>379867</td><td>WAARSCHUWING: Toxisch</td></tr><tr><td>Chloroplatinzuurhydraat (H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PtCl&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt; x 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>520896</td><td>WAARSCHUWING: Toxisch</td></tr><tr><td>Lood(II)acetaattrihydraat (Pb(CH&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; x 3H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>185191</td><td>WAARSCHUWING: Toxisch</td></tr><tr><td>Nano-Amp stroombron</td><td>Zelfgebouwd</td><td>-</td><td>Voeding door zes 1,5 V (AAA) batterijen</td></tr><tr><td>3-dimensionele micropositioneerder</td><td>Line Tool Co.</td><td>Model H</td><td></td></tr><tr><td>Lock-in versterker</td><td>Stanford Research Systems</td><td>SR530</td><td></td></tr><tr><td>Digitale I/O-interface</td><td>National Instruments</td><td>PCI-6220</td><td></td></tr><tr><td>Afgeschermd connectorblok met BNC-verbindingen</td><td>National Instruments</td><td>BNC-2110</td><td></td></tr><tr><td>Strathclyde Electrophysiology Software</td><td>University of Strathclyde Institute of Pharmacy and Biomedical Sciences, UK</td><td>WinWCP V4.1.5</td><td>Gratis download via: &lt;a href=&quot;http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm">http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Kalibratiekamer</td><td>Zelfgebouwd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Constante stroomkalibrator</td><td>Vibrating Probe Company</td><td></td><td>Voeding door één 9 V (PP3) batterij</td></tr></tbody></table>

meting van bio-elektrische stroom met een vibrating probe

Measurement of Bioelectric Current with a Vibrating Probe

Elektrische velden, opgewekt door actief transport van ionen, zijn aanwezig in veel biologische systemen en dienen vaak belangrijke functies in weefsels en organen. Ze bijvoorbeeld een belangrijke rol spelen in het sturen van celmigratie tijdens de genezing van de wond. Hier beschrijven we de productie en het gebruik van de ultragevoelige trillende sondes voor het meten van extracellulaire elektrische stromen. De sonde is een geïsoleerde, geslepen metalen draad met een kleine platina-zwarte punt (30-35 micrometer), die ionische stromen kunnen in de uA / cm 2 range op te sporen in fysiologische zoutoplossing. De sonde wordt in trilling gebracht bij ongeveer 200 Hz door een piëzo-elektrische bender. In de aanwezigheid van een ionische stroom, de sonde detecteert een spanningsverschil tussen de uitersten van zijn beweging. Een lock-in versterker filtert externe ruis door het blokkeren van op de frequentie van de sonde van de trillingen. De gegevens worden opgeslagen op de computer. De sonde is gekalibreerd aan het begin en einde van de experimenten in de juiste zoutoplossing, met behulp van een kamer waarin een stroom is van toepassing van precies 1,5 uA / cm 2. We beschrijven hoe de sondes te maken, stelt u het systeem en te kalibreren. We tonen ook aan de techniek van het hoornvlies meet-, en tonen enkele representatieve resultaten van verschillende monsters (hoornvlies, huid, hersenen).

De productie, de kalibratie en het gebruik van niet-invasieve vibrerende sondes naar bio-elektrische stroom te meten in de verschillende biologische systemen wordt beschreven.

Meting van bio-elektrische stroom met een Vibrating Probe

Elektrische velden, gegenereerd door het actieve transport van ionen, zijn aanwezig in veel biologische systemen en vervullen vaak belangrijke functies in weefsels en organen. ...

Deze video demonstreert een procedure voor het maken en gebruiken van vibrerende probes die worden ingezet om bio-elektrische stroom in biologische monsters te meten. Eerst worden de probes gefabriceerd door blanco probes van roestvrij staal te nemen en de punten hiervan te vergulden via elektroplating. Vervolgens worden de instellingen van de platinum probe, zoals frequentie en faselhoek, bepaald en wordt de probe gekalibreerd.Vervolgens kunnen metingen worden verricht aan het betreffende monster, waarbij gegevens worden verkregen die het karakter onthullen van bio-elektrische stromen die worden gegenereerd door en rondom het biologische monster vloeien. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat deze non-invasief is, zeer gevoelig is en een hoge signaal-ruisverhouding heeft. Deze methode kan belangrijke vragen in het medische veld beantwoorden, zoals de wijze waarop elektrische velden in wonden cellen stimuleren om wondgenezing te bevorderen.Om te beginnen met het vervaardigen van trillende probes voor het meten van bio-elektrische stromen, worden blanco probes aangeschaft bij World Precision Instruments. Snijd eerst de probe 25 tot 30 millimeter achter de punt af en gebruik een scalpel nummer 11 om ongeveer vijf millimeter van de paryleen-isolatie aan het afgesneden uiteinde weg te schrapen om een goede verbinding te garanderen. Monteer de probe vervolgens met elektrisch geleidende, met zilver beladen epoxy in een gouden R 30-connector.Bewaar de probe overnight bij kamertemperatuur zodat de epoxy de volgende dag kan uitharden. Bedek de tip van de probe met goud en vervolgens met platina. Spoel hiervoor eerst de tip van de probe af met aceton en verbind deze met de negatieve uitgang van een nano amp stroombron.Plaats de probe nu onder een dissectiemicroscoop en dompel deze onder in een verguldingsoplossing. Een referentiedraad die is aangesloten op de positieve uitgang en in de oplossing is geplaatst, maakt het circuit compleet. Breng gedurende vijf minuten een stroom van 5 nA toe, en verhoog de stroom vervolgens naar 20 nA totdat de punt ongeveer de helft van de gewenste uiteindelijke grootte heeft bereikt.Spoel nu de punt van de probe af met gedestilleerd water en plaats deze vervolgens in de izing-oplossing. Breng gedurende vijf minuten een stroom van 250 nano amps toe, en verhoog de stroom daarna naar 500 nano amps totdat de punt ongeveer 80% van de gewenste uiteindelijke grootte heeft bereikt. Verhoog de stroom naar één micro amp en breng de stroom toe in pulsen van één seconde totdat de uiteindelijke diameter van de punt van 30 tot 35 micrometers is bereikt.Spoel ten slotte de tip af; de gedestilleerde waterprobes kunnen onbeperkt bij kamertemperatuur worden bewaard. Laten we nu het geproduceerde probesysteem bekijken: bevestig de probe aan een piezo-elektrische buiger. De probe is gemonteerd op een driedimensionale micropositioneerder.De vibratie wordt geregeld door de voeding van de trilsonde, waarmee ook de vibratie, amplitude en frequentie kunnen worden ingesteld. De voeding van de sonde stuurt een referentiesignaal naar de lock-in versterker, waarop tevens de vibratiefrequentie en de fasehoek worden weergegeven. De versterker is via een analoog-digitale interface verbonden met een computer.De gegevens worden geregistreerd met de whole-cell programma-instellingen van de Strat Clyde Electrophysiology-software voor de lock-in versterker; de instellingen voor de elektrofysiologie-software zijn te vinden in het geschreven gedeelte van dit protocol. Laten we nu bekijken hoe de nieuwe probe moet worden geïnstalleerd. Nieuwe probes moeten worden getest om hun unieke frequentie en fasehoek te bepalen.Plaats de nieuwe probe en de referentie- en aardingsdraden in de kalibratiekamer met fysiologische zoutoplossing. Schakel de voeding in en verhoog de frequentie totdat de maximale vibratie wordt waargenomen. Dit is de resonantiefrequentie van de probe.Het gebruik van de probe op deze resonantiefrequentie kan leiden tot instabiliteit en ruis in de opname. Daarom wordt de probe ontstemd door 10 hertz af te trekken om de werkfrequentie van de probe te bepalen. Stel de vibratieamplitude zo in dat de vibratieafstand van de probe gelijk is aan de diameter van de tip.Op deze manier is er, wanneer de probe wordt gevibreerd, een dubbel beeld van de probespits zichtbaar. Om de fasehoek te bepalen, plaatst u de probe in fysiologische zoutoplossing in de kalibratiekamer en brengt u een stroom aan van 1,5 microamps per centimeter squared. Pas de fasehoek op de lock-in versterker herhaaldelijk aan totdat er geen respons meer is.Het optellen of aftrekken van 90 graden geeft de maximale respons, en deze hoek is de werkfasehoek van de probe. Tijdens een experiment is het belangrijk dat deze instellingen van frequentie, fase, hoek en amplitude niet worden gewijzigd, aangezien dit de respons van de probe beïnvloedt. Gemakkelijk genoeg zal een stroom die van zuid naar noord stroomt, een opwaartse uitslag produceren.Terwijl een stroom die van noord naar zuid vloeit, een neerwaartse afbuiging zou moeten vertonen. De respons van de probe op een gestandaardiseerde stroom van exact 1,5 microamps per centimeter squared, aangebracht op de probe in een kalibratiekamer, wordt gebruikt om de stroom in het monster te berekenen voorafgaand aan de monstermeting; kalibreer de probe in een geschikte oplossing en kalibreer de probe vervolgens aan het einde van het experiment in de gebruikte oplossing om osmolaliteitsveranderingen door verdamping te compenseren. Bij de data-analyse kunnen metingen uit de eerste helft van het experiment worden berekend met de beginwaarden van de kalibratie, en metingen uit de tweede helft worden berekend met de eindkalibratie.Bij het meten van monsters wordt een kamer gebruikt die is ontworpen om het monster vast te houden en te mobiliseren. Voor hoornvliesmetingen worden bijvoorbeeld Petrischalen met draadlussen gebruikt om de ogen te fixeren. Om een monster te meten, plaatst u de schaal met fysiologische zoutoplossing onder de dissectiemicroscoop en brengt u het relevante gebied van het monster in het gezichtsveld.Plaats vervolgens de probe in de oplossing, parallel georiënteerd ten opzichte van het sample-oppervlak en in focus, zodat deze zich op hetzelfde niveau bevindt als het te meten punt op het sample. Beweeg de probe ongeveer één centimeter weg van het sample en schakel de vibratie in terwijl er via de computersoftware wordt geregistreerd om een stabiele nullijn vast te stellen. Beweeg de probe vervolgens naar de meetpositie, op ongeveer 50 µm van het oppervlak.Wanneer de nieuwe piekwaarde stabiel is, verplaatst u de probe terug naar de referentiepositie, waarna het signaal terugkeert naar de basislijn. Dit kan op regelmatige tijdstippen worden herhaald om time-lapse-gegevens te genereren, of het monster kan licht worden verschoven om metingen op verschillende posities uit te voeren. De gegevens van de TE ruimtelijke stroommapping tonen nu enkele representatieve resultaten.Dit huidige profiel van een cornea-wond vertoont maximale stroomstromen aan de wondrand. De time-lapse-gegevens tonen het tijdsverloop van de stroomverandering bij de huidwond. Het rode punt geeft de stroom aan vóór het verwonden en na het verwonden.Er is een voorbijgaande binnenwaartse stroom die vervolgens omkeert en een buitenwaartse stroom wordt; metingen in de rattenhersenen tonen buitenwaartse stromen bij de bulbus olfactorius en binnenwaartse stromen bij het laterale ventrikel. Hier wordt de ruimtelijke mapping van de stroom bij een hoornvlieswond na deze procedure getoond. Andere methoden, zoals selectieve micro-elektroden, kunnen worden gebruikt om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals welke ES verantwoordelijk zijn voor het geleiden van de elektrische stroom na de ontwikkeling ervan.Deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoekers in het veld van medisch onderzoek om wondgenezing, embryo-ontwikkeling en ruggenmergletsel te bestuderen.

measurement-of-bioelectric-current-with-a-vibrating-probe

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Extern elektrisch veld induceert een spanning op het membraan van een cel, de zogenoemde geïnduceerde membraan spanning (ΔΦ). Door het gebruik van de potentiometrische kleurstof di-8-ANEPPS, is het mogelijk om de ΔΦ niet-invasief te meten. Deze video toont het protocol voor het meten van ΔΦ met behulp van di-8-ANEPPS.

Het meten van de Induced Membraan Voltage met Di-8-ANEPPS

De elektrode-weefsel interface van neurale opname elektroden kan worden gekarakteriseerd met elektrische impedantie spectroscopie (EIS) en cyclische voltammetrie (CV). Toepassing van de spanning verandert de voorspanmiddelen elektrochemische eigenschappen van de elektrode weefsel interface kunnen verbeteren opnamemogelijkheid. Voltage biasing, EIS, CV, en neurale opnames zijn complementair.

Voltage Biasing, cyclische voltammetrie, en elektrische Impedantie Spectroscopie voor neurale interfaces

Dit protocol beoordelingen elektrische cel-substraat Impedantie Sensing, een werkwijze voor registreren en analyseren van de impedantie spectrum van hechtende cellen voor de kwantificering van celhechting, proliferatie, motiliteit en cellulaire reacties op farmacologische en toxische stimuli. Detectie van endotheliale permeabiliteit en beoordeling van cel-cel en cel-substraat contacten benadrukt.

Electric Cell-substraat Impedantie Sensing voor de kwantificering van endotheelproliferatie, barrièrefunctie en Motility

Transporters in celmembranen maken differentiële segregatie van ionen over celmembranen of cellagen mogelijk en spelen een cruciale rol tijdens weefselfysiologie, herstel en pathologie. We beschrijven de ion-selectieve zelfrefererende micro-elektrode die de meting van specifieke ionfluxen bij enkele cellen en weefsels in vivo mogelijk maakt.

Meting van de extracellulaire Ion Flux gebruik van de Ion-selectieve Zelf referencing micro-elektrode Techniek

Neuronale kweken zijn een goed model voor het bestuderen van de opkomende hersenstimulatie technieken via hun effect op enkele neuronen of een populatie van neuronen. Hier voorgesteld zijn verschillende methoden voor het stimuleren van neuronale kweken patroon door een elektrisch veld rechtstreeks bad elektroden geproduceerd of geïnduceerd door een in de tijd variërend magnetisch veld.

Externe excitatie van neuronen Met behulp van elektrische en magnetische velden in een-en twee-dimensionale culturen

Een protocol voor het meten van de elektrische geleiding van levende micro-organismen biofilms fysiologisch relevante voorwaarden wordt gepresenteerd.

Karakterisering van elektronentransport via levende Biofilms

Hier laten we zien hoe je een goedkope volt-Amperemeter opzetten met programmeerbare uitgangsfrequentie die kan worden gebruikt met in de handel verkrijgbare Chopstick-elektroden voor transepitheliale/endotheliale elektrische weerstand metingen.

Een eenvoudige benadering om TEER metingen uit te voeren met behulp van een zelfgemaakte volt-Amperemeter met programmeerbare uitgangsfrequentie

Twee recente technologieën - tatoeage en textiel - hebben veelbelovende resultaten laten zien in cutane sensing. Hier presenteren we de fabricage- en evaluatiemethoden van tatoeage- en textielelektroden voor cutane elektrofysiologische detectie. Deze elektronische interfaces van geleidende polymeren presteren beter dan de bestaande normen op het gebied van comfort en gevoeligheid.

Conforme draagbare elektroden: van fabricage tot elektrofysiologische beoordeling

Dit artikel beschrijft hoe in vivo (met behulp van oppervlakte- en naaldelektrodearrays) en ex vivo (met behulp van een diëlektrische cel) elektrische impedantiemyografie op de gastrocnemiusspier van knaagdieren kan worden uitgevoerd. Het zal de techniek demonstreren bij zowel muizen als ratten en de beschikbare modificaties (d.w.z. zwaarlijvige dieren, pups) beschrijven.

In vivo en ex vivo elektrische impedantiemyografie uitvoeren bij knaagdieren

In deze studie laten we zien hoe we de aanwezigheid van vloeistofoverbelasting kunnen evalueren door middel van bio-elektrische impedantievectoriale analyse (BIVA) en de impedantieratio gemeten met tetrapolaire multifrequentieapparatuur bij patiënten die zijn opgenomen op de afdeling spoedeisende hulp. BIVA en impedantieratio zijn betrouwbare en nuttige hulpmiddelen om slechte resultaten te voorspellen.

Evaluatie van vloeistofoverbelasting door bio-elektrische impedantie vectoriële analyse

Hier presenteren we een protocol om een uniek tweelaags microfluïdisch apparaat te fabriceren om de elektromechanische regulatie van de homeostase van epitheelweefsel te bestuderen. Het apparaat past statische fysiologische elektrische stromen toe die loodrecht op het weefselvlak staan, wat van invloed is op de adhesie, proliferatie en extrusie van cellen tot cel. Beeldvorming van levende cellen en mechanische stressmetingen onthullen mechanismen van deze processen.

Onthullende elektromechanische controle van weefselhomeostase met behulp van een tweelaags microfluïdisch apparaat

Leer hoe je niet-invasieve vibrerende sondes vervaardigt en calibreert om bio-elektrische stromen in biologische systemen te meten. Deze gevoelige techniek biedt waardevolle inzichten voor medisch onderzoek naar wondgenezing.

Meting van bio-elektrische stroom met een Vibrating Probe

Meer video's verkennen