Name: Western Blotting: Monstervoorbereiding naar Detectie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-14T17:27:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Leer Western blotting voor eiwitdetectie in weefselmonsters met behulp van elektroforese en antilichaam-detectie. Deze methode toont hoe hoogwaardige reagentia betrouwbare resultaten opleveren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Monstervoorbereiding De eerste stap in Western blotting is monstervoorbereiding. Ter voorbereiding monsters voor het uitvoeren van een gel cellen en weefsels moeten worden gelyseerd aan de eiwitten van belang release. <ul><li> Een handige, kant-en-klare reagens dat is veelzijdig en gemakkelijk te gebruiken voor het oplosbaar eiwit-extractie is CytoBuster of PhosphoSafe. Deze extractie buffers bevatten wasmiddelen geoptimaliseerd voor een efficiënte extractie van oplosbare eiwitten van zoogdieren en insecten cellen. De zachte, niet-ionische samenstelling van CytoBuster eiwitextractie Reagent maakt de isolatie van functioneel actieve endogene of tot expressie gebrachte eiwitten zonder de noodzaak voor secundaire behandeling, zoals sonicatie of vries / dooi. PhoshoSafe heeft het extra voordeel van met vier fosfatase-remmers. <ol><li> Pellet de cellen door lage snelheid centrifugeren (bijv. 5 min bij 2500 xg), goed uitlekken van de cel pellet. </li><li> Resuspendeer de cellen in CytoBuster eiwitextractie Reagent met behulp van 150 pi per 10 6 cellen (optimale hoeveelheid CytoBuster eiwitextractie Reagent kunnen variëren op basis van celgrootte). </li><li> Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. </li><li> Transfer naar een geschikte buis en spin voor 5 min bij 16.000 xg bij 4 ° C. </li><li> Transfer gewist supernatans (cel extract) naar een nieuwe buis en ga verder met de analyse. </li></ol></li><li> Voor gespecialiseerde eiwitextractie, raden wij u onze hoogwaardige ProteoExtract Kits. EMD heeft meer dan een dozijn kits voor mitochondriële isolatie, subcellulaire proteoom extractie, transmembraan eiwit extractie, en vele anderen. Bezoek onze Western blot landing page voor meer informatie. </li><li> EMD verkoopt ook een breed scala van protease en fosfatase-inhibitor cocktail sets. Zodra lysis optreedt, proteolyse, defosforylering en denaturatie beginnen. Deze gebeurtenissen kan worden vertraagd enorm indien uit de monsters worden bewaard op ijs of bij 4 ° C te allen tijde en passende remmers zijn toegevoegd in verse toestand aan de lysis buffer. Bezoek onze Western blot landing page voor meer informatie. </li></ul> 2. SDS-PAGE De tweede stap in Western blotting is eiwit scheiding. Eiwitten worden gescheiden op basis van moleculaire gewicht. <ul><li> U kunt uw eigen PAGE gel te maken, maar we zullen met behulp van een commercieel pre-cast gel. <ol><li> Na de voorbereiding van uw sample, bent u klaar om de proteïne concentratie te bepalen. EMD heeft twee kits om dit te laten concentratie te meten, namelijk de niet-storende Protein Assay Kit en de andere is de BCA Protein Assay Kit. </li><li> Zodra de eiwitconcentratie wordt beoordeeld zijn we klaar om onze steekproef voor te bereiden op het laden van de gel. Antilichamen meestal te herkennen een klein deel van het eiwit van belang (hierna het epitoop) en dit domein kan wonen in de 3D-conformatie van het eiwit. Om ervoor te zorgen toegang van het antilichaam aan dit deel is het noodzakelijk om ontvouwen van het eiwit. </li><li> Te denatureren, gebruik dan een laadbuffer met de anionische detergent denatureren natriumdodecylsulfaat (SDS), en kook het mengsel bij 95 tot 100 ° C gedurende 5 minuten. Een gemakkelijke en handige laden buffer te gebruiken is 4X Sample Buffer. </li></ol></li><li> Plaats de eerste rijstrook van de goed met Trail Mix Protein Marker. Deze marker heeft drie referentie-banden die u toelaten om elektroforese controleren. Wanneer de gel is gekleurd, 10 banden zijn zichtbaar, variërend 10 tot 225 kDa. </li><li> Vul de elektroforese-eenheid met stromend buffer. Voor PAGINA gels, dit is meestal 1X Tris-glycine. Voor gedetailleerde buffer recepten, bezoek de Western blotting pagina. EMD biedt hoogwaardige buffers reagentia met onze OmniPur chemische lijn. Laat de gel op 220V gedurende 1 uur. </li><li> Nadat de eiwitten hebben gescheiden, vlekken op de gel met Coomassie blauw om ervoor te zorgen de eiwitten zijn gelijkmatig en uniform gemigreerd. RAPIDstain is een ultra-gevoelige vlek, die is kant-en-gebruik. Geen ontkleuren is vereist. </li></ul> 3. Eiwit Transfer Net als eiwitten met een elektrische lading kan worden opgewekt om te reizen door middel van een gel in een elektrisch veld, kan zo de eiwitten worden overgedragen in een elektrisch veld van de gel op een membraan, die ofwel PVDF of nitrocellulose. <ul><li> Vandaag zullen we doen een natte transfer. In natte overdracht, zijn de gel en membraan ingeklemd tussen spons en papier (spons / papier / gel / membraan / papier / spons) en allemaal zijn ze stevig tegen elkaar geklemd na zodat er geen luchtbellen gevormd tussen de gel en membraan. De sandwich is ondergedompeld in de overdracht buffer waarbij een elektrisch veld wordt toegepast. De negatief geladen eiwitten reizen naar de positief geladen elektrode, maar het membraan houdt hen tegen, bindt hen, en verhindert hen verder op. </li><li> Er zijn twee soorten membranen zijn beschikbaar: nitrocellulose en PVDF. Beiden werken goed. Vandaag zullen we gebruiken PVDF. PVDF-membranen vereisen weken in methanol voor een paar minuten, gevolgd door een ijskoud overdracht buffer gedurende 5 minuten. De gel moet ook equilibreren voor een paar minuten in ijskoud overdracht buffer. Niet doet, kan krimpen de gel tijdens de overdracht. </li><li> De buffer voor natte overdracht is 1X Tris-glycine met 20% methanol. Gedetailleerde buffer voorbereidingen zijn beschikbaar op onze website. </li><li> Zodra de overdracht is voltooid, is het een goed idee om eiwitten te visualiseren om nog ervoor te zorgen dat geen lucht zakken te dragen. Dit kan gemakkelijk gedaan worden met RedAlert Western Blot Stain. Deze vlek is klaar voor gebruik en ontkleuring kan eenvoudig worden gedaan met water. </li></ul> 4. Antilichamen en accessoires reagentia <ul><li> De eerste stap in het doen sonderen en antilichaam aan antigeen te blokkeren het membraan. Het blokkeren van de membraan voorkomt dat niet-specifieke binding achtergrond. </li><li> Ofwel niet-vette melk of BSA kan worden gebruikt als een blokkerende oplossing. Echter, bij het gebruik van fosfo-specifieke antilichamen, is het niet aangeraden om melk te gebruiken omdat het hoge achtergrond veroorzaken. </li><li> Merck biedt verschillende hoogwaardige het blokkeren van reagentia, waaronder SeaBlock, dat is een niet-zoogdieren blokkerende middel en BLOT QuickBlocker, die bereid is, kant-en-klare blokkerend middel. We hebben ook een hoge-kwaliteit BSA (Fraction V) beschikbaar. <ol><li> Incubeer het membraan 1 uur bij kamertemperatuur onder zacht schudden. </li><li> Was driemaal in TBST of PBST na incubatie. Een eenvoudige en handige manier om TBST of PBST te maken is om onze tabletten te gebruiken (PBS TWEEN Tablets / TBS TWEEN tabletten) </li></ol></li><li> Zodra het membraan is geblokkeerd, bent u klaar om incuberen met het primaire antilichaam. EMD is het aanbieden van een uitgebreid portfolio van uitzonderlijke antilichamen met de beste antilichaam garantie in de industrie voor meer dan 30 jaar. Vergeet niet dat bij alle EMD antilichamen, hebben we een volle 100% no-risk garantie te bieden. Aankoop van een antilichaam en het gebruiken voor een soort specificiteit of toepassing die u wenst. Als het antilichaam niet werkt naar tevredenheid, zullen wij een volledige credit te worden gebruikt op een ander product. Voor meer informatie, bezoek onze Western blotting webpagina. <ol><li> Vandaag zullen we het incuberen van onze primaire antilichaam met behulp van een oplossing van SignalBoost. SignalBoost is een geweldig product waarmee je signaal aanzienlijk worden verbeterd. Gewoon incubeer je primaire antilichaam in Oplossing 1 en incubeer gedurende 1 uur of als je normaal zou doen. Er is geen behoefte om verder blokkerende middelen toe te voegen. Als alternatief kunt u gebruik maken BSA of magere melkpoeder als een blokkerend middel. </li><li> Wassen met TBST. Wij maken TBST het gebruik van de ready-to-ontbinden TBST tablet. </li><li> Incubeer uw secundaire antilichaam met behulp van oplossing 2 van SignalBoost. Incubeer het secundaire antilichaam in het blokkeren van buffer gedurende 1 uur. Opnieuw Was het membraan meerdere malen met TBST. </li></ol></li></ul> 5. Opsporing Voor de HRP vervoegen secundaire antilichamen, wordt ECL traditioneel gebruikt. Een uitstekende ECL reagens die wij aanbieden is RapidStep. De voordelen van RapidStep zijn dat er geen vermenging van luminal of enhancer is vereist. Gewoon spuiten het membraan een paar keer en ontwikkelen met behulp van x-ray film. RapidStep biedt een lage pictogram gevoeligheid en uitzenden van licht, tot twee uur na de toevoeging van substraat.

<ol><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R., R, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+proteins+from+gels+to+diazobenzyloxymethyl-paper+and+detection+with+antisera%3A+a+method+for+studying+antibody+specificity+and+antigen+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (7), 3116-3120 (1979).</li>
<li>Burnette, W. N. 'W. estern <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((blotting%27%3A+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate+polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).</li>
<li>Ambroz, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+quantification+accuracy+for+Western+blots+Image+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Improving quantification accuracy for Western blots Image Analysis.</a> , (2006).</li>
<li>Quan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species-mediated+endoplasmic+reticulum+stress+and+mitochondrial+dysfunction+contribute+to+cirsimartitin-induced+apoptosis+in+human+gallbladder+carcinoma+GBC-SD+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett+Article%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species-mediated endoplasmic reticulum stress and mitochondrial dysfunction contribute to cirsimartitin-induced apoptosis in human gallbladder carcinoma GBC-SD cells.</a> Cancer Lett Article. , Forthcoming (2010).</li>
<li>O'Malley, D. ervia <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+colonic+corticotrophin-releasing+factor+receptors+in+the+maternally+separated+rat+model+of+irritable+bowel+syndrome%3A+Differential+effects+of+acute+psychological+and+physical+stressors%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Alterations in colonic corticotrophin-releasing factor receptors in the maternally separated rat model of irritable bowel syndrome: Differential effects of acute psychological and physical stressors.</a> Peptides. 31 (4), 662-670 (2010).</li>
</ol>

De auteurs Anna Eslami en Jesse Lujan zijn in dienst van Merck Chemicals Inc dat de reagentia en instrumenten die gebruikt worden in dit artikel oplevert.

In deze video presentatie hebben we gewezen op de belangrijke stappen in Western blotting die monstervoorbereiding, SDS-PAGE, membraan blokkeren / sonderen met antilichamen, en detectie. Voor elke stap van het proces, moet een goede protocollen en geschikte reagentia worden gebruikt om de resultaten van hoge kwaliteit te bereiken.

<table><tbody><tr><td>CytoBuster&amp;#8482; Reagens voor eiwitextractie</td><td>EMD Millipore</td><td>71009</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/cytobuster&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/cytobuster&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/cytobuster&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/cytobuster&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>PhosphoSafe&amp;#8482; Extractiereagens</td><td>EMD Millipore</td><td>71296</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/phosphosafe&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/phosphosafe&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/phosphosafe&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/phosphosafe&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Eiwitassay zonder interferentie&amp;#8482; Kit</td><td>EMD Millipore</td><td>488250</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/noninterfering&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/noninterfering&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/noninterfering&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/noninterfering&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>BCA-eiwitassaykit </td><td>EMD Millipore</td><td>71285</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/BCA&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/BCA&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/BCA&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/BCA&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>4X SDS-monsterbuffer </td><td>EMD Millipore</td><td>70607</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/4XSDS&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/4XSDS&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/4XSDS&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/4XSDS&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Trail Mix&amp;#8482; Eiwitmarkers</td><td>EMD Millipore</td><td>70980</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/trailmix&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/trailmix&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/trailmix&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/trailmix&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Proteïne&amp;#8211;extract&amp;#8482; Eiwitextractie-kits</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/prote&amp;#8211;extract&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/prote&amp;#8211;extract&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/prote&amp;#8211;extract&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/prote&amp;#8211;extract&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>OmniPur&amp;#174; Producten</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/omnipur&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/omnipur&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RAPIDstain&amp;#8482; Reagens</td><td>EMD Millipore</td><td>553215</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/rapidstain&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/rapidstain&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/rapidstain&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/rapidstain&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RedAlert&amp;#8482; 10X Western Blot-kleurstof</td><td>EMD Millipore</td><td>71078</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/redalert&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/redalert&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/redalert&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/redalert&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>SeaBlock&amp;#8482; Reagens, zalmplasma</td><td>EMD Millipore</td><td>558300</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/seablock&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/seablock&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/seablock&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/seablock&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>BLOT-QuickBlocker-reagens</td><td>EMD Millipore</td><td>WB57</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/quickblocker&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/quickblocker&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/quickblocker&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/quickblocker&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Albumine, runderserum, fractie V</td><td>EMD Millipore</td><td>12660</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/bovineserum&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/bovineserum&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/bovineserum&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/bovineserum&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>PBS-TWEEN&amp;#174; Tabletten</td><td>EMD Millipore</td><td>524653</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/PBST&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/PBST&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/PBST&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/PBST&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>TBS-TWEEN&amp;#174; Tabletten</td><td>EMD Millipore</td><td>524753</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/TBST&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/TBST&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/TBST&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/TBST&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>SignalBoost&amp;#8482; Immunoreactie-versterkingskit</td><td>EMD Millipore</td><td>407207</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/signalboost&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/signalboost&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/signalboost&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/signalboost&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RapidStep&amp;#8482; ECL-reagens</td><td>EMD Millipore</td><td>345818</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/rapidstep&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/rapidstep&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/rapidstep&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/rapidstep&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

western blotting: monstervoorbereiding naar detectie

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is een analytische techniek die gebruikt wordt om specifieke eiwitten te detecteren in een monster van weefsel homogenaat of het uittreksel. Het maakt gebruik van gelelektroforese om native of gedenatureerde proteïnen scheiden door de lengte van de polypeptide (denaturerende omstandigheden) of door de 3-D structuur van het eiwit (native / niet-denaturerende omstandigheden). De eiwitten worden vervolgens overgebracht naar een membraan (meestal nitrocellulose of PVDF), waar ze worden gepeild (gedetecteerd) met behulp van antilichamen die specifiek zijn voor de doelgroep eiwit.

Western blotting is een analytische techniek die gebruikt wordt om specifieke eiwitten te detecteren in een monster van weefsel homogenaat of het uittreksel.

Western Blotting: Monstervoorbereiding naar Detectie

Western blotting is een analytische techniek die wordt gebruikt om specifieke eiwitten aan te tonen in een gegeven monster van weefselhomogenaat of extract. Er wordt gebruikgemaakt van gel ...

Het algemene doel van deze procedure is om de eenvoud van het uitvoeren van een Western blot aan te tonen bij gebruik van geschikte producten. Na de monstervoorbereiding worden eiwitten gescheiden op basis van grootte en vervolgens overgebracht naar een vaste fase. De eiwitten worden daarna gesondeerd met antilichamen en gedetecteerd; het gebruik van juiste protocollen en hoogwaardige, kosteneffectieve reagentia leidt tot verbeterde resultaten bij Western blotting.Hallo, ik ben Jesse Luhan, r&amp;d-wetenschapper bij EMD Chemicals in San Diego, Californië. EMD is een filiaal van Merck, KGAA in Darmstadt, Duitsland. Vandaag gaan we u een western blotting-procedure laten zien.Laten we beginnen. De eerste stap bij western blotting is de monstervoorbereiding. Start de monstervoorbereiding door de cellen te pelletteren middels centrifugatie bij een lage snelheid, zoals vijf minuten bij 2.500 ×g.Giet na centrifugatie de celpellets af. Resuspendeer de cellen grondig in cyto buster proteïne-extractiereagens met 150 µL per 10⁶ cellen. Incubeer het monster vijf minuten bij kamertemperatuur.Centrifuge het monster vervolgens gedurende vijf minuten bij 16.000 ×g bij vier °C. Draag het geklaarde SNA over naar een nieuwe buis en ga verder met de analyse. Nadat de eiwitconcentratie van het monster is bepaald, wordt het monster voorbehandeld voor het laden op de gel om het eiwit te denatureren.Gebruik een monsterbuffer die een ionisch denaturerend detergent bevat, zoals natriumlaurylsulfaat of SDS. Kook het mengsel vijf minuten lang bij 95 tot 100 °C. Met behulp van een commercieel verkrijgbare precast gel kunnen eiwitten snel worden gescheiden op basis van molecuulgewicht.Vul de elektroforese-eenheid met running buffer, die kan worden bereid met reagentia uit de Omni PU chemische lijn. Laad de eerste baan van de put met trail mix proteïnemarker. Deze marker heeft drie referentiebanden die monitoring tijdens de elektroforese mogelijk maken.Zodra de gel is gekleurd, zijn er 10 banden zichtbaar, variërend van 10 tot 225 kilo Daltons. Laad het gedenatureerde monster in de overige putjes. Laat de gel één uur lang lopen bij 220 volt.Zodra de eiwitten gescheiden zijn, wordt de gel gekleurd met kumasi blue om te controleren of de eiwitten gelijkmatig en uniform zijn gemigreerd, waarbij gebruik wordt gemaakt van rapid stain en ultrasensitive stain, die klaar zijn voor gebruik zonder DS. Kleuring is noodzakelijk omdat eiwitten met een elektrische lading kunnen worden bewogen door een gel in een elektrisch veld, waardoor de eiwitten in een elektrisch veld van de gel naar een membraan zoals nitrocellulose of PVDF kunnen worden overgebracht. Week bij gebruik van PVDF-membranen het membraan enkele minuten in methanol, gevolgd door een equilibratie in ijskoude transferbuffer gedurende vijf minuten. Week ook de gel enkele minuten in ijskoude transferbuffer; deze equilibratie voorkomt krimp van de gel tijdens de transfer.Zet voor een natte transfer een sandwich samen van de gel en het membraan tussen spons en papier. Klem de assemblage vervolgens stevig vast, nadat is gecontroleerd of er geen luchtbellen tussen de gel en het membraan zijn ontstaan. Dompel de sandwich onder in transferbuffer en leg een elektrisch veld aan.De negatief geladen eiwitten zullen naar de positief geladen elektrode migreren. Het membraan stopt hen vervolgens, bindt hen en voorkomt dat zij verder gaan. Zodra de transfer voltooid is, worden de eiwitten gevisualiseerd om een gelijkmatige transfer zonder luchtbellen te bevestigen.Dit kan eenvoudig worden gedaan met red alert Western blot-kleuring. Deze kleuring is direct klaar voor gebruik en het ontkleuren kan eenvoudig met water worden uitgevoerd. Dit is de gel nadat deze is ontkleurd door te wassen in water; voordat het membraan met antilichamen kan worden aangetoond, wordt het membraan geblokkeerd.Om aspecifieke binding te voorkomen, dient het membraan te worden geblokkeerd met hoogwaardige blokkeringsreagentia. Om een verhoogde achtergrond te vermijden, wordt het membraan gedurende één uur bij kamertemperatuur onder zachte agitatie geïncubeerd in een blokkeringsoplossing, waarna het membraan na incubatie drie keer wordt gewassen in TBST of PBST. Deze buffers kunnen eenvoudig en gemakkelijk worden bereid met behulp van respectievelijk TBS tween-tabletten en PBS tween-tabletten.Zodra het membraan is geblokkeerd en gewassen, kan het worden geïncubeerd met het primaire antilichaam. Breng het primaire antilichaam aan met behulp van oplossing één van signal boost, waardoor het signaal aanzienlijk kan worden versterkt. Bereid het primaire antilichaam voor in oplossing één en incubeer het membraan gedurende één uur.Het is niet nodig om na de incubatie verdere blokkeringsmiddelen toe te voegen. Was de membraan met TBST. Incubeer de membraan vervolgens gedurende één uur met het secundaire antilichaam, verdund in oplossing twee van signal boost.Was ten slotte het membraan nogmaals meerdere keren met TBST voor de HRP-conjugatie. Voor de detectie van secundaire antilichamen wordt hier traditioneel verbeterde chemiluminescentie of ECL gebruikt. Het ECL-reagens 'rapid step' wordt gebruikt, aangezien dit geen menging van luminol of enhancer vereist.Spray het membraan simpelweg een paar keer, incubeer gedurende twee minuten en ontwikkel het met röntgenfilm. Rapid Step biedt een gevoeligheid in het lage picogrambereik en een lichtere emissie tot twee uur na de toevoeging van het substraat. Trail mix proteïnemarkers maken proteïne-tracking tijdens elektroforese mogelijk in vergelijking met standaard Western blot-protocollen.Signal Boost maakt een groter dynamisch bereik en een hogere gevoeligheid mogelijk. Tot slot kan een superieure gevoeligheid worden bereikt door Rapid step te gebruiken in plaats van traditionele ECL-reagentia. We hebben u zojuist laten zien hoe u Western blotting efficiënt en kosteneffectief kunt uitvoeren met een uitgebreid assortiment aan producten.Onthoud dat de kwaliteit van uw resultaten afhankelijk is van de kwaliteit van uw reagentia. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

western-blotting-sample-preparation-to-detection

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze technische artikel beschrijft een standaard western-blot procedure met behulp van de commercieel verkrijgbare NuPAGE elektroforese Mini-Gel systeem van Invitrogen.

Western blotting Met behulp van de Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels

Immunoblotting (western blotting) is een snelle en gevoelige test voor de detectie en karakterisering van eiwitten die werkt door het benutten van de specificiteit die inherent zijn aan antigeen-antilichaam erkenning. Deze video bevat protocollen voor de scheiding van eiwitten, blotting eiwitten op membranen, immunoprobing, en visualisatie met behulp van chromogene of chemiluminescent substraten.

Immunoblot analyse

This video demonstrates a quantitative dot blot, or QDB, technique for the absolute quantification of proteins of interest in a tissue sample. The proteins in the sample are immobilized on the nitrocellulose membrane inside the wells of a QDB plate. Utilizing target protein-specific antibodies labeled with a peroxidase enzyme, a chemiluminescent substrate is oxidized to produce light, which is measured to determine the protein concentration of the sample.

Quantitative Dot Blot to Estimate Target Proteins in a Tissue Lysate

The video demonstrates a total protein normalization-based western blotting technique for quantifying the target protein expression in a sample. By utilizing the total protein staining of the sample, a ratiometric analysis is performed to determine the relative expression level of the target protein.

Quantitative Western Blotting to Estimate Protein Expression Levels

This video describes the chemiluminescence-based western blotting of immunoprecipitated lysates. The technique helps determine protein processing and activation. The chemiluminescent signal detected is proportional to the level of protein processing during its activation.

Chemiluminescent Western Blot Assay for Protein Processing

Dit protocol verkent de nieuwste ontwikkelingen in het uitvoeren van Western blot analyses. Deze nieuwe modificaties maken gebruik van een Bis-Tris gel systeem met een 35 min elektroforese looptijd, een 7 minuten droge blotting transfersysteem en infrarood fluorescerend eiwit en beeldvorming dat hogere resolutie, kwaliteit, gevoeligheid en verbeterde nauwkeurigheid van Western gegevens genereert.

De snelste West in de stad: Een eigentijdse variant op de klassieke Western Blot analyse

De vooruitgang van westerse blotting met behulp van fluorescentie heeft de detectie van subtiele veranderingen in eiwitexpressie mogelijk gemaakt, waardoor kwantitatieve analyses mogelijk zijn. Hier beschrijven we een robuuste methodologie voor de detectie van een reeks eiwitten in verschillende soorten en weefselsoorten. Er wordt ook een strategie geboden om veelvoorkomende technische problemen te overwinnen.

A Guide to Modern Kwantitatieve TL Western Blotting met Troubleshooting Strategies

Deze methode beschrijft een robuuste en reproduceerbare aanpak voor het vergelijken van eiwitniveaus in verschillende weefsels en bij verschillende ontwikkelings timepoints met behulp van een kwantitatieve westelijke bevlekkende standaardbenadering.

Robuuste vergelijking van eiwitniveaus over weefsels en in de gehele ontwikkeling met behulp van gestandaardiseerde kwantitatieve westelijke bevlekken

Deze video toont de voorbereiding van een ultra-dunne matrix / analyt laag voor het analyseren van peptiden en eiwitten door Matrix-assisted laser desorptie ionisatie massaspectrometrie (MALDI-MS).

MALDI Monstervoorbereiding: de Ultra Thin Layer methode

Archiefbeelden formaline gefixeerde en in paraffine ingebedde (FFPE) klinische monsters zijn waardevol materiaal voor onderzoek naar ziekten. Hier laten we zien een monstervoorbereiding workflow waardoor diepgaande proteomics analyse van gemicrodissecteerde FFPE weefsel.

Proteomics Monstervoorbereiding van formaline gefixeerde en in paraffine ingebed weefsel

Leer Western blotting voor eiwitdetectie in weefselmonsters met behulp van elektroforese en antilichaam-detectie. Deze methode toont hoe hoogwaardige reagentia betrouwbare resultaten opleveren.

Western Blotting: Monstervoorbereiding naar Detectie

Meer video's verkennen