Western Blotting: Monstervoorbereiding naar Detectie

Het algemene doel van deze procedure is om de gemakkelijke uitvoering van een Western blot aan te tonen met behulp van geschikte producten. Na de bereiding van het monster worden de eiwitten gescheiden op basis van grootte en vervolgens overgebracht naar een vaste fase. De eiwitten worden vervolgens beproefd met antilichamen en gedetecteerd met behulp van geschikte protocollen en hoogwaardige, kosteneffectieve reagentia, waardoor verbeterde Western blotting resultaten worden geproduceerd.

Hallo, ik ben Jesse Luhan, r en d-wetenschapper bij EMD Chemicals in San Diego, Californië. EMD is een dochteronderneming van Merck, KGAA in Darmstadt, Duitsland. Vandaag laten we u een Western blotting-procedure zien.

Dus laten we beginnen. De eerste stap in Western blotting is de bereiding van het monster. Begin met het bereiden van het monster door de cellen te pelleten met behulp van centrifugatie met lage snelheid, zoals vijf minuten bij 2.500 keer de zwaartekracht.

Na centrifugatie worden de celpellets uitgelopen. Hersuspendeer de cellen in cyto buster eiwitextractiereagens met 150 microliters per 10 tot de zes cellen. Incubeer het monster gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.

Spin vervolgens het monster gedurende vijf minuten bij 16.000 keer de zwaartekracht bij vier graden Celsius na centrifugatie. Breng de opgeruimde SNA over naar een nieuwe buis en ga door met analyse. Nadat de eiwitconcentratie van het monster is beoordeeld, bereidt u het monster voor voor het laden van de gel om het eiwit te denatureren.

Gebruik een monsterbuffer met een onische denaturerende detergent zoals natriumdoylsulfaat of SDS. Kook het mengsel gedurende vijf minuten bij 95 tot 100 graden Celsius. Met behulp van een commercieel verkrijgbaar voorgegoten gel kunnen eiwitten snel worden gescheiden op basis van moleculair gewicht.

Vul de elektroforese-eenheid met lopende buffer, die kan worden gemaakt van reagentia die worden aangeboden via de Omni PU chemische lijn. Laad de eerste baan van het wel met trail mix eiwitmarker. Deze marker heeft drie referentiebanden die toelating voor bewaking tijdens elektroforese mogelijk maken.

Zodra de gel is gekleurd, zijn 10 banden zichtbaar, variërend van 10 tot 225 kilo Daltons. Laad het gedenatureerde monster in de resterende putjes. Laat de gel een uur lang draaien op 220 volt.

Zodra de eiwitten zijn gescheiden, wordt de gel gekleurd met kumasi blauw om ervoor te zorgen dat de eiwitten gelijkmatig en uniform zijn gemigreerd met behulp van snelle kleurstof en ultragevoelige kleurstof, die klaar is voor gebruik zonder DS.Kleuren is vereist, net zoals eiwitten met een elektrische lading kunnen worden geïnduceerd om door een gel in een elektrisch veld te reizen, zodat de eiwitten in een elektrisch veld kunnen worden overgebracht van de gel naar een membraan zoals NITROCELLULOSE of PVDF. Bij gebruik van PVDF-membranen, week het membraan een paar minuten in methanol, gevolgd door een gelijkmaking in ijskoud overdrachtsbuffer gedurende vijf minuten. Week ook de gel een paar minuten in ijskoud overdrachtsbuffer E-evenwicht voorkomt krimp van de gel tijdens overdracht.

Voor een natte overdracht, assembleert u een sandwich van de gel en het membraan tussen spons en papier. Klem vervolgens de assemblage stevig samen na controle dat er geen luchtbellen zijn gevormd tussen de gel en het membraan. Dompel de sandwich onder in overdrachtsbuffer en breng een elektrisch veld aan.

De negatief geladen eiwitten zullen naar de positief geladen elektrode reizen. Het membraan stopt ze dan, bindt ze en voorkomt dat ze verdergaan. Zodra de overdracht voltooid is, visualiseer de eiwitten om gelijkmatige overdracht te waarborgen zonder luchtzakken.

Dit kan eenvoudig worden gedaan met rode waarschuwings Western blot kleurstof. Deze kleurstof is klaar voor gebruik en het ontkleuren kan eenvoudig met water worden gedaan. Dit is de gel zodra deze is ontkleurt door te wassen in water voordat het membraan kan worden bewezen met antilichaam, het membraan wordt geblokkeerd.

Om niet-specifieke binding te voorkomen, blokkeer het membraan met hoogwaardige blokkeerreagentia. Om een verhoogde achtergrond te voorkomen door het in blokkeeroplossing te incuberen gedurende één uur bij kamertemperatuur onder zachte agitatie, was vervolgens het membraan drie keer in TBST of PBST na incubatie. Deze buffers kunnen eenvoudig en gemakkelijk worden gemaakt met behulp van respectievelijk TBS tween-tabletten en PBS tween-tabletten.

Zodra het membraan is geblokkeerd en gewassen, kan het worden geïncubeerd met het primaire antilichaam. Breng het primaire antilichaam aan met behulp van oplossing, een van signaalboost, die het signaal aanzienlijk kan versterken. Bereid het primaire antilichaam in oplossing één voor en incubeer het membraan gedurende één uur.

Er is geen noodzaak om na incubatie verdere blokkeermiddelen toe te voegen. Was het membraan met TBST. Incubeer vervolgens het membraan met het secundaire antilichaam verdund in oplossing twee van signaalboost gedurende één uur.

Was ten slotte het membraan nog een paar keer met TBST voor HRP geconjugeerd. Secundaire antilichamendetectie door verbeterde chemiluminescentie of ECL wordt hier traditioneel gebruikt. De ECL-reagens snelle stap wordt gebruikt omdat het geen menging van luminol of versterker vereist.

Spuit eenvoudig het membraan een paar keer, incubeer gedurende twee minuten en ontwikkel het met behulp van röntgenfilm. Rapid Step biedt lage picogram gevoeligheid evenals lichtere missie gedurende maximaal twee uur na de toevoeging van substraat. Trail mix-eiwitmarkers maakt eiwittracking mogelijk tijdens elektroforese in vergelijking met standaard Western blot-protocollen.

Signaal Boost zorgt voor een groter dynamisch bereik en gevoeligheid. Ten slotte kan superieure gevoeligheid worden verkregen door Rapid Step te gebruiken in plaats van traditionele ECL-reagentia. We hebben u net laten zien hoe u Western blinding efficiënt en kosteneffectief kunt uitvoeren met een uitgebreid assortiment producten.

Onthoud dat de kwaliteit van uw resultaten afhangt van de kwaliteit van uw reagentia. Dat is het. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.