In Utero Intraventriculaire injectie en elektroporatie van de E16 Rat embryo's

Hallo, mijn naam is William Ti. Ik kom van het Arnold Creek Stein Lab. Vandaag gaan ik en anderen u de intra-uteriene injectie van E 16 rattenembryo's tonen. Hallo, mijn naam is Laura Elias.

Vandaag zal ik u laten zien hoe u de microinjectiepijpetten voorbereidt en vult voor de intraventriculaire injecties en elektroporatie die we vandaag gaan uitvoeren. Ook zal ik u laten zien hoe u de intraventriculaire injecties en elektroporatie uitvoert in rattenembryo's van E 16. In utero injecties en elektroporatie bij de rat zijn bijzonder nuttig, omdat de rat een systeem is waarin genetische manipulaties niet eenvoudig kunnen worden uitgevoerd.

Oké, er is een aantal chirurgische instrumenten die we voor deze procedure gebruiken. We gebruiken een freer, een paar Addison-pincetten — één paar met kartels en een ander paar met een klein tandje aan het uiteinde. We gebruiken een paar hemostaten.

Dit is een schaar, en vervolgens gebruiken we deze twee nietmachines. Dit is de grotere, die we gebruiken voor ratten. Dit is de kleinere, die we gebruiken voor muizen, welke een nietes van maat 7 gebruikt, en deze gebruikt een nietes van maat 9; ze zijn beide voorzien van een veer.

Voor sommige hulpmiddelen die we hier bij de operaties gebruiken, maken we gebruik van een eenvoudige glasvezellichtbron met een dubbele kop. We gebruiken een verwarmingsmat waarin warm water circuleert om de temperatuur constant te houden. Voor het werkoppervlak gebruiken we dit electroporatiesysteem van BTX.

We hebben verschillende maten peddels die we gebruiken, afhankelijk van de grootte van de embryo's. De blauwe zijde is de positieve zijde. Goed, we gaan nu onze injectiepipetten afschuinen.

En dit is zeer belangrijk, zodat uw pipet een grote genoeg opening heeft om het DNA te kunnen laden, maar ook zeer scherp is zodat het embryo niet wordt beschadigd tijdens de injectie. Als u het embryo beschadigt bij het injecteren, krijgt u een veel hogere mortaliteitsgraad. En dat is ongewenst.

Dit is een zeer belangrijke stap tijdens deze operatie. Eerst brengen we wat water aan op deze roterende afbasteen. Vervolgens nemen we, laten we eens kijken, gewoon een stokje.

Vervolgens bevestigen we de pipet die we zojuist hebben getrokken met wat tape aan deze houder. We gebruiken een van deze micromanipulatoren om de pipet vast te houden bij de schuine zijde en deze hier te laten afschuinen. We plaatsen dit geheel en gebruiken een microscoop om de punt van de pipet te visualiseren.

En we plaatsen het nu direct in het water op de eerder genoemde schuine zijde, zodat er een beetje druk ontstaat. U kunt zien dat de punt tegen de steen drukt. Laat het geheel gedurende enige tijd inslijpen, gedurende ten minste 15 minuten.

Ik laat ze soms zelfs een uur liggen. Soms worden ze echt heel scherp, maar het hangt per persoon af hoe lang ze hun pipetten afschuinen. Oké, hier hebben we, zoals je bovenaan kunt zien, een getrokken pipet die nog niet is afgeschuind.

Hoewel deze scherp is, heeft hij geen opening waardoor u uw DNA kunt laden. De onderste pipet is daarentegen schuin afgesneden, en u ziet hier deze mooie schuine opening. Hiermee kunt u het DNA laden, maar hij heeft nog steeds een scherpe punt zodat u kunt injecteren zonder schade aan te richten. Goed, we gaan nu onze injectiepipetten vullen met DNA.

Het is daarom belangrijk dat u uw DNA op een endotoxine-vrije manier voorbereidt, zodat u geen lipopolysachariden injecteert wanneer u uw DNA toedient. We nemen nu ons DNA en maken hier de parafilm klaar. Maak de parafilm gereed, verzamel uw DNA en plaats dit als een klein stipje op deze parafilm.

Daarna neem ik gewoonlijk voor elke 10 µL van mijn DNA, dat ik meestal gebruik in een concentratie van ongeveer 1,5 tot 1,7 µg per µL, ongeveer 1 µL van deze Fast Green-kleurstof. Dit is bedoeld om ons te helpen bij het lokaliseren van de injectie en om er zeker van te zijn dat we succesvol in het ventrikel hebben geïnjecteerd.

Daarna meng ik deze fast green-kleurstof met mijn DNA. Vervolgens neemt u de injectie-elektrode en vullen we de pipet door aan de zuiger te trekken. U kunt hier zien dat, indien de pipet correct is en een voldoende grote opening heeft, het DNA vrij gemakkelijk geladen zou moeten worden.

Soms moet u de zuiger simpelweg heen en weer bewegen om te helpen bij het correct opzuigen. Vervolgens kunt u de pipet op deze manier vullen. Nu is het DNA volledig in deze pipet opgenomen en is het klaar voor injectie.

Oké, ik ga het dier nu anesthetiseren. Hiervoor gebruiken we deze dec capi-conussen. Ik rol de rand ervan een beetje terug om hem makkelijker vast te kunnen houden.

Laten we beginnen. Normaal gesproken plaats ik het gewoon op de rand van de kooi om een mooi klein tunneltje te maken waar hij in kan gaan, zoals zo. Oké, dit dier lijkt onder narcose te zijn.

We gaan nu een teenknijp-test uitvoeren om dit te bevestigen; pak simpelweg de teen vast en knijp er stevig in. Niet te hard. U wilt het dier niet verwonden, maar alleen controleren of het in narcose is.

En dit dier is nu zeker onder narcose. Ik ga daarom haar buik scheren. Ik wil de tepels vermijden, zodat u de uiteinden daarvan niet per ongeluk afknipt.

Ik denk dat het erg pijnlijk zou kunnen zijn voor het dier. Daarom wordt het dier geschoren. Nu ga ik het in de zuiveringskast plaatsen.

We gaan haar schoonmaken en de procedure starten. Oké, we hebben bevestigd dat dit dier opnieuw onder narcose is en we zijn klaar om haar eerst schoon te maken. Ik wil nu een beetje oogzalf aanbrengen in elk oog, puur om te voorkomen dat haar ogen uitdrogen.

Vervolgens zullen we afwisselend wassen met alcohol-prepschijfjes en jodiumschijfjes. Dit doen we drie keer, drie afwisselende veegbeurten. We moeten zeer voorzichtig te werk gaan om te voorkomen dat de embryo's beschadigd raken tijdens deze handeling.

U veegt dus gewoon recht naar beneden, gewoon recht naar achteren. Dit is stap één. Ik moet haar eerst goed natmaken, zodat ik de veegbewegingen kan maken. Goed.

Dat zijn er twee en dat zijn er drie. Oké, we hebben deze afdekking geplaatst om te helpen bij de sterilisatie en nu ga ik het dier openen. Laten we gaan snijden.

Goed, het eerste wat ik moet doen is de steriele handschoenen aantrekken. We trekken steriele handschoenen aan en we zijn klaar om hier te openen. Bevestig altijd eerst of het dier nog steeds onder narcose is.

Ik voer nu opnieuw een teenknijp uit en we zullen dit gedurende de procedure blijven doen. Gewoonlijk knijp ik eerst een klein beetje van het weefsel vast. Ik maak een snelle incisie, pak het aan de bovenkant vast en snijd naar beneden, pak de andere pincet en houd het weefsel uit elkaar.

Neem vervolgens de gewenste spier en snijd precies op de middenlijn, zodat u geen vaten of zenuwen raakt. Pas op dat u niet per ongeluk iets anders vastpakt. Het lijkt erop dat we hier een mooie opbrengst hebben.

Ik wil ervoor zorgen dat het goed gesmeerd blijft zodat het niet uitdroogt. En ik doe nog een controle om er zeker van te zijn dat alles in orde is, en het lijkt erop dat dat zo is. Voor Laura positioneer ik deze altijd; wat ik gewoonlijk doe, of wat ik altijd doe, is de kop zo positioneren dat de kop van het embryo zich aan de rechterkant van de moeder-rat bevindt, simpelweg voor de uniformiteit.

En dus begin ik nu. Hier kunnen we het embryo zien. We kunnen de staart en de achterste lens hier zien, en de kop verderop hier.

Hier kijken we naar de kop van dit embryo. De middellijn is hier te zien als deze donkere lijn. De linkerhemisfeer en de rechterhemisfeer zijn zichtbaar, evenals de rhombencephalon.

Ik ga nu de linkerhemisfeer targeten voor de injectie. Pipetteer, trek een beetje op en injecteer de kleurstof. Nu is te zien dat het zich verspreidt in het linker laterale ventrikel.

En dat ziet eruit als een geslaagde injectie. Goed, we zien nu dat de ventrikels mooi gevuld zijn. De kleurstof is daadwerkelijk van de linker- naar de rechterventrikel gepasseerd.

We hebben nu D en DNA in beide ventrikels. Op dit punt ga ik de electroporatie-elektroden pakken en deze over het brein plaatsen, met een positieve elektrode aan de linkerzijde. Op deze manier zal het DNA binnendringen in de progenitoren en de corticale wand van het linkerhemisfeer.

En nu schakel ik de stroom in. Wanneer we de elektrische stroom beginnen door te laten, ziet u wat schuim ontstaan aan het negatieve uiteinde van de elektrode. Dit is een bevestiging dat de contacten correct zijn gemaakt.

Nu we deze embryo's hebben geëlektroporeerd, zal ik ze terugplaatsen en de incisie hechten. Ik geef haar nu 10 ml antibiotisch chirurgisch hechtmateriaal. Ik gebruik bij voorkeur bloksteken.

Daarna gaan we de huid hechten met de huidnietmachine. Oké? Oké. Ik heb haar een dosis buprenorfine toegediend om ervoor te zorgen dat ze geen pijn ervaart wanneer ze uit het narcosemiddel komt. Nu plaats ik haar in de incubator om haar warm te houden terwijl ze bijkomt, zodat we kunnen voorkomen dat ze hypothermie ontwikkelt.

Oké, we hebben zojuist gedemonstreerd hoe u in utero intraventriculaire injecties en electroporatie uitvoert. Bij de rat kunt u verschillende zaken injecteren. U kunt simpelweg een virus, waaronder lentivirus of retrovirus, direct in de ventrikel injecteren.

En in dit geval hoef je geen elektroporatie uit te voeren, omdat het virus in de cellen zal integreren. Als je plasmiden, DNA-plasmiden, injecteert zoals we vandaag hebben gedaan, moet je wel elektroporatie uitvoeren om de plasmiden in de cellen van de ventrikelwand te krijgen. Je kunt deze vectoren dus voor verschillende mogelijkheden gebruiken.

U kunt ze simpelweg gebruiken om de cellen te volgen en GFP tot expressie te brengen, waardoor u deze progenitoren kunt zien delen en migreren. U kunt deze vectoren ook gebruiken om de cellen te manipuleren. Zo kunt u S-H-R-N-A hairpin-structuren tot expressie brengen en daarmee specifieke genen knock-downen.

U kunt ook specifieke genen overexpresseren en op deze manier de cellen manipuleren die u heeft geëlectroporeerd of geïnfecteerd met het virus. Dit kan een zeer krachtige techniek zijn om de rol van specifieke eiwitten te bestuderen in het proces waarin u geïnteresseerd bent. Dit is specifiek erg belangrijk voor studies bij de rat, omdat genetische manipulaties bij een rat niet zo eenvoudig kunnen worden uitgevoerd als bij een muis.