Name: Snelle PCR thermocycling met Microscale Thermal Convectie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Leer snelle PCR-thermocycling met microscale thermische convectie voor DNA-versterking. Deze methode gebruikt natuurlijke convectie om reagentia tussen temperatuurzones te transporteren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We dankbaar danken T. Ragucci, B. Watkins, S. Wong, en B. Wallek op Lynntech, Inc voor technische bijstand en vele nuttige discussies. Dit werk werd ondersteund door de Amerikaanse National Science Foundation (NSF) onder te verlenen cbet-0933688.

1. Basisontwerp van de Convectieve Thermocycler <ol><li> We hebben geconstrueerd een eenvoudige convectieve thermocycling apparaat dat bestaat uit verwisselbare plastic reactiekamer "cartridges" die zijn ingeklemd tussen twee aluminium platen, waarvan temperaturen worden onafhankelijk gecontroleerd 7 (figuur 2). </li><li> Cilindrische reactor putten worden ingebed door het bewerken arrays van gaten in polycarbonaat blokken, met verschillende combinaties van gat diameter en plastic plaatdikte gebruikt om de gewenste aspect ratio (hoogte / diameter = h / d) te bereiken. Twee verschillende reactor geometrieën worden beschouwd als in de hier gepresenteerde resultaten: h / d = 9: h = 15,9 mm, d = 1,75 mm, 38,2 pL volume; h / d = 3: h = 6,02 mm, d = 1,98 mm, 18,5 uL volume. </li><li> De onderkant van de reactor wordt verwarmd met behulp van een aluminium blok met een cartridge heaters gekoppeld aan een microprocesser gedreven temperatuurregelaar. </li><li> De temperatuur op de bovenste van de reactor oppervlak wordt geregeld met behulp van een aluminium blok aangesloten op een recirculerende water bad. </li><li> Het geheel wordt samen geklemd met behulp van nylon schroeven van thermische geleiding tussen de conflicterende aluminium blokken te beperken. </li></ol> 2. Voorbereiding en laden van de PCR-reactiemengsel <ol><li> Een typische 100 pi reactiemengsel bevat 10 pi van 10x bufferoplossing, 6 ul 25 mM MgCl2, 10 pi van dNTPs (2 mM elk), 41,2 pi van DI water, 10 ul van β-actine probe, 10 pi van β -actine forward primer, 10 ul van β-actine reverse primer, 2 pi van het menselijk genoom template-DNA (10 ng / pi) en 0,8 pi van KOD DNA-polymerase (2,5 eenheden / pi). </li><li> Voor het laden reagentia, afdichting van de onderkant van de PCR kamer met behulp van een dunne plaat van aluminium tape. </li><li> Spoel de reactor putten met een 10 mg / ml waterige oplossing van bovine serum albumine, gevolgd door Rain-X Anti-Fog. </li><li> Pipetteer reagentia in de reactor putten met lange gel-loading pipetpunten en sluit de bovenkant met FEP Teflon tape. </li></ol> 3. Het uitvoeren van de reactie in de convectieve Thermocycler <ol><li> Voor het begin van de reactie, verwarm zowel aluminium blokken om de gewenste bovenste en onderste oppervlakte temperaturen. </li><li> Sandwich de plastic reactor geladen met PCR-reagentia tussen het aluminium verwarmings-blokken, en snel samen klem de montage met behulp van nylon schroeven. </li><li> Nadat de reactie is verlopen voor de gewenste tijd, het uitschakelen van de verwarming en plaats de onderste (warm) oppervlak van het apparaat op de top van een gekoelde metalen blok snel afkoelen en stop de convectieve stromen. </li><li> Verwijder de plastic reactor en pipet de producten uit de putten (met behulp van de lange laad-gel tips) voor verdere analyse. </li></ol> 4. Het uitvoeren van gelelektroforese Analyse <ol><li> Bereid een 2 gew% agarosegel door het verwarmen van 10 g agarose met 500 ml 1x buffer op een hete plaat roeren totdat de oplossing helder wordt. </li><li> Laad de agarose gel in de casting lade en plaats de kam. Laat de gel voor ~ 30 minuten. </li><li> Verwijder de kam en voeg 1x TAE buffer totdat de gel is ondergedompeld. </li><li> Fluorescerend gekleurde DNA-monsters bevatten 2 pl 100x SYBR Green I-oplossing, 2 pl DNA-monster, 2 pl 6x Oranje laden Dye, en 4 ul TAE buffer. </li><li> Voeg de DNA-monsters in de putten en lopen de scheiding op 60 V gedurende 1 uur met een 100 bp DNA ladder sizing marker. </li><li> Verwijder de gel en fotograferen onder UV-licht om het resultaat te verkrijgen. </li></ol> 5. Representatieve resultaten: Optimaal ontwerp van convectieve thermocyclers impliceert het kiezen van de juiste reactor geometrie die een bloedsomloop stroom in staat is het transport van reagentia door de sleutel temperaturen die betrokken zijn bij het PCR-proces zal genereren. De geometrische parameters die kunnen worden gevarieerd in de cilindrische reactoren het hier om gaat zijn de hoogte (h) en diameter (d), of equivalent van de aspect ratio (h / d). We hebben onderzocht de 3-D stroming velden in convectieve PCR reactoren over een scala aan verschillende beeldverhoudingen gebruik van computational fluid dynamics (CFD), en vond dat onverwacht complexe patronen kunnen ontstaan. Nog belangrijker is, heeft onze analyse ontdekt een subset van deze complexe stroom velden die aanzienlijk versnellen de reactie 12. Deze geometrische effecten kunnen duidelijk worden gezien door het vergelijken van de stroom velden in reactoren bij hoge en lage aspect ratio's. In de hoge aspect ratio geval (h / d = 9; een lange, magere cilinder) zijn vloeibare elementen advectie langs trajecten tracing paden die in wezen zijn gesloten lussen, en ze zijn opgesloten in om dezelfde paden te volgen gedurende lange perioden van tijd (Figuur 3a). Bijgevolg is er weinig gelegenheid voor uitwisseling tussen flage trajecten die reagentia bloot te stellen aan de optimale volgorde van thermische omstandigheden voor PCR (schommelend tussen de gloeien en denatureren uitersten aan boven-en onderkant van de reactor oppervlakken) en het veel grotere geheel van de resterende trajecten die niet bijdragen aan versterking (dichter heeft in het midden van de reactor). De stroom veld is veel anders op een kleinere aspect ratio (h / d = 3; een korter, breder cilinder), steeds meer chaotisch in die zin dat het vloeibare element trajecten niet langer gesloten paden (figuur 3b) te volgen. Dus, hoewel reagentia worden onderworpen aan een meer complexe temperatuur profiel, vloeistof-elementen zijn in staat om een ​​veel breder scala van trajecten te onderzoeken, zodat meer van het reagens volume heeft een kans om optimale thermische profielen ervaring. Deze resultaten suggereren dat counterintuitively terwijl de individuele trajecten doorstroming op h / d = 9 mei om gunstiger te zijn voor PCR worden weergegeven door het produceren van de temperatuur profielen die "look" vergelijkbaar met die gebruikt in een conventionele thermocycler, de chaotische aard van de stroming op h / d = 3 domineert uiteindelijk op een mondiale schaal door het bevorderen van intensievere uitwisseling, zodat de reagentia niet bekneld raken in ongunstige trajecten voor zeer lang. Om deze hypothese te testen en te bepalen welke reactor geometrie was gunstiger voor PCR, gebruikten we beiden aan PCR replicatie van een 295 bp doelwit worden geassocieerd met het β-actine-gen van een menselijk genomisch DNA template uit te voeren. Opmerkelijk is dat we regelmatig bereikt versterking van de juiste doelgroep product in slechts 10 minuten bij h / d = 3 (figuur 4a), terwijl dezelfde reactie vereist ten minste 20 minuten voor detecteerbare producten werden waargenomen bij h / d = 9 (figuur 4b) . De specificiteit van de reactie is ook veel groter is bij h / d = 3 waar een enkele PCR-product is verkregen, terwijl meerdere niet-specifieke producten zijn gegenereerd op h / d = 9, waar de stroming veld vallen vloeistof elementen in ongunstige thermische trajecten voor langere tijd. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Thermische convectie in een cilindrische kamer, waarvan boven-en onderkant zijn gehandhaafd op verschillende vaste temperaturen. Als de temperatuur aan de onderkant is hoger dan aan de top, is een verticale dichtheidsgradiënt die binnen de ingesloten vloeistof die in staat is om het genereren van een bloedsomloop stromingspatroon. Met de juiste keuze van geometrische parameters (hoogte h en diameter d), kan de convectieve stromingsveld worden aangewend om PCR thermocycling bedienen wanneer de boven-en onderkant zijn manintained de buurt van gloeien en denaturering temperaturen, respectievelijk (zwaartekracht verticaal naar beneden). <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. (A) Belangrijke onderdelen van een convectieve stroming PCR thermocyler. Een reactor cartridge bestaat uit een polycarbonaat blok met een reeks van cilindervormige kamers. Het blok is ingeklemd tussen een top plaat ontworpen om te worden aangesloten op een circulerend waterbad en een bodemplaat waarin embedded kachels. (B) De PCR-reagentia worden geladen en verzegeld in de reactor cartridge, waarna het apparaat is gemonteerd om de reactie uit te voeren. Na voltooiing kan de procucts gemakkelijk worden gepipetteerd uit voor verdere analyse. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Computational simulaties van de 3-D convectieve stroming velden die in cilindervormige reactoren met temperaturen van 53 en 96 ° C opgelegd aan de boven-en onderkant, respectievelijk. Resultaten zijn weergegeven in beeldverhoudingen van (a) h / d = 9 (38,2 pi reactor volume) en (b) h / d = 3 (18,5 pi reactor volume). Een vertegenwoordiger traject, gevolgd door een vloeistof element reis door de 3D stromingsveld wordt getoond aan de linkerkant, samen met top-en zijaanzicht projecties van het pad, de bijbehorende perceel van temperatuur versus tijd na een vloeistof element wordt getoond aan de rechterkant. De thermische profiel op h / d = 9 lijkt dicht bij die van een conventionele thermocycler, maar de chaotische stroom veld h / d = 3 is counterintuitively gunstiger voor PCR. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. DNA-replicatie resultaten die zijn verkregen in de reactor geometrieën weergegeven in figuur 3 (boven-en onderzijde werden gehouden op 53 en 96 ° C, respectievelijk). (A) PCR is sterk versneld op h / d = 3, zoals duidelijk door sterke producten zichtbaar na slechts 10 minuten van de reactie tijd (M: 100 bp ladder, lanen 1-4: producten van parallelle reacties in 4 verschillende cilindervormige kamers). (B h / d = 9 vereist ten minste 20 minuten voor zichtbare producten in acht worden genomen, en meerdere bands zijn duidelijk aangeeft replicatie van niet-specifieke doel-DNA in aanvulling op de gewenste product (M: 100 bp ladder, lanen 1-2: producten van parallel reacties in 2 verschillende cilindervormige kamers).

<ol><li>Spitzack, K. D., Ugaz, V. M. Microfluidic Techniques: Reviews and Protocols. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpitzack%2C+KD+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Minteer, S. D. , Humana Press. Vol. 321 (2005).</li>
<li>Krishnan, M., Ugaz, V. M., Burns, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+in+a+Rayleigh-B%C3%A9nard+convection+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">PCR in a Rayleigh-Bénard convection cell.</a> Science. 298, 793-793 (2002).</li>
<li>Braun, D., Goddard, N. L., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exponential+DNA+replication+by+laminar+convection%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Exponential DNA replication by laminar convection.</a> Physical Review Letters. 91, 158103-158103 (2003).</li>
<li>Chen, Z., Qian, S., Abrams, W. R., Malamud, D., Bau, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermosiphon-based+PCR+reactor%3A+experiment+and+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Thermosiphon-based PCR reactor: experiment and modeling.</a> Analytical Chemistry. 76, 3707-3715 (2004).</li>
<li>Wheeler, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convectively+driven+polymerase+chain+reaction+thermal+cycler%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Convectively driven polymerase chain reaction thermal cycler.</a> Analytical Chemistry. 76, 4011-4016 (2004).</li>
<li>Krishnan, M., Agrawal, N., Burns, M. A., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactions+and+fluidics+in+miniaturized+natural+convection+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reactions and fluidics in miniaturized natural convection systems.</a> Analytical Chemistry. 76, 6254-6265 (2004).</li>
<li>Ugaz, V. M., Krishnan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+convective+flow+based+approaches+for+high-throughput+PCR+thermocycling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Association+for+Laboratory+Automation+%28JALA%29%22%5BJournal%5D)">Novel convective flow based approaches for high-throughput PCR thermocycling.</a> Journal of the Association for Laboratory Automation (JALA). 9, 318-323 (2004).</li>
<li>Yao, D. J., Chen, J. R., Ju, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-Rayleigh-Benard+convection+polymerase+chain+reaction+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micro-Nanolithography+MEMS+and+MOEMS%22%5BJournal%5D)">Micro-Rayleigh-Benard convection polymerase chain reaction system.</a> Journal of Micro-Nanolithography MEMS and MOEMS. 6, 043007-043007 (2007).</li>
<li>Agrawal, N., Hassan, Y. A., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Pocket-sized+Convective+PCR+Thermocycler%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">A Pocket-sized Convective PCR Thermocycler.</a> Angewandte Chemie International Edition. 46, 4316-4319 (2007).</li>
<li>Yariv, E., Ben-Dov, G., Dorfman, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction+in+natural+convection+systems%3A+A+convection-diffusion-reaction+model%5BTitle%5D)+AND+%22Europhysics+Letters%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction in natural convection systems: A convection-diffusion-reaction model.</a> Europhysics Letters. 71, 1008-1014 (2005).</li>
<li>Allen, J. W., Kenward, M., Dorfman, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+flow+and+reaction+during+natural+convection+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluidics+and+Nanofluidics%22%5BJournal%5D)">Coupled flow and reaction during natural convection PCR.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 6, 121-130 (2009).</li>
<li>Muddu, R., Hassan, Y. A., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+Biochemistry+by+Chaotic+Stirring%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Accelerated Biochemistry by Chaotic Stirring.</a> , Forthcoming (2010).</li>
</ol>

De wisselwerking tussen stroming en chemische reactie kan drastisch veranderen onder invloed van de chaotische advectie. Maar deze complexe stroom staten zijn uitdagend om te studeren, met name in realistische geometrieën, waar 3D-effecten worden belangrijk. Rayleigh-Benard convectie op h / d&gt; 1 niet alleen een handig platform om deze verschijnselen te verkennen, de toepassing daarvan op PCR uit te voeren maakt het ook mogelijk de koppeling tussen de stroming en chemische reacties worden gepeild. Deze unieke mogelijkheid maakt het mogelijk om een ​​optimale doorstroming staten waar chaotisch effecten optreden (counterintuitively) om de snelheid van de DNA-replicatie te versnellen.

<table><tbody><tr><td>KOD DNA-polymerase kit</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td>71085-3</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan &amp;#946;-actine controle-reagentia kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>401846</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumtape</td><td>Axygen Scientific</td><td>PCR-AS-200</td><td></td></tr><tr><td>Bovien serumalbumine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Rain-X Anti-Fog</td><td>SOPUS Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lange pipetpunten voor gelbelading</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-151</td><td></td></tr><tr><td>FEP Teflon-tape</td><td>McMaster-Carr</td><td>7562A17</td><td></td></tr><tr><td>Agarosegel</td><td>Bio-Rad</td><td>161-3107</td><td></td></tr><tr><td>TAE-runbuffer</td><td>Bio-Rad</td><td>141-0743</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I</td><td>Invitrogen</td><td>S7563</td><td></td></tr><tr><td>6x Oranje laadkleurstof</td><td>Fermentas</td><td>R0631</td><td></td></tr><tr><td>100 bp DNA-ladder maatmarker</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8202</td><td></td></tr></tbody></table>

snelle pcr thermocycling met microscale thermal convectie

Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection

Veel moleculaire biologie assays hangen op een bepaalde manier op de polymerase chain reaction (PCR) om een ​​aanvankelijk verdunnen doelwit DNA-monster te versterken een detecteerbare concentratie niveau. Maar het ontwerp van de conventionele PCR thermocycling hardware, voornamelijk op basis van massieve metalen verwarming blokken waarvan de temperatuur wordt geregeld door thermo-elektrische kachels, beperkt de haalbare reactiesnelheid 1. Grote elektrische stroom is ook nodig om herhaaldelijk warmte en het reactiemengsel afkoelen, het beperken van de mogelijkheid om deze instrumenten in te zetten in een draagbaar formaat. Thermische convectie heeft ontpopt als een veelbelovend alternatief thermocycling benadering die het potentieel heeft om te overwinnen deze beperkingen 2-9 is. Convectieve stromen zijn een alledaags verschijnsel in een diverse reeks van instellingen, variërend van de atmosfeer van de aarde, de oceanen, en interieur, tot decoratieve en kleurrijke lava lampen. Vloeiende beweging is gestart op dezelfde manier in elk geval: een drijfvermogen gedreven instabiliteit ontstaat wanneer een beperkte hoeveelheid vloeistof wordt blootgesteld aan een ruimtelijke temperatuurgradiënt. Deze zelfde verschijnselen bieden een aantrekkelijke manier om PCR thermocycling uit te voeren. Door het toepassen van een statische temperatuur gradiënt over een goed ontworpen reactor geometrie, kan een continue circulatie-stroom worden vastgesteld dat bij herhaling zal PCR-reagentia transport door middel van temperatuur zones in verband met de denaturering, gloeien, en uitbreiding stadia van de reactie (figuur 1). Thermocycling kan dus worden bediend in een pseudo-isotherme manier door eenvoudigweg twee tegenovergestelde vlakken op vaste temperatuur, het volledig afschaffen van de noodzaak om herhaaldelijk verwarming en koeling van het instrument. Een van de belangrijkste uitdagingen voor het ontwerp van de convectieve thermocyclers is de noodzaak om de ruimtelijke snelheid en temperatuur uitkeringen nauwkeurig controle binnen de reactor om ervoor te zorgen dat de reagentia opeenvolgend de juiste temperatuur zones voor een voldoende lange periode 10,11 bezetten. Hier beschrijven we resultaten van onze inspanningen om de volledige 3-D snelheid en temperatuur-distributies sonde in microschaal convectieve thermocyclers 12. Onverwacht hebben we ontdekt dat er een subset van complexe stromen trajecten die zeer gunstig zijn voor PCR te wijten aan een synergetische combinatie van (1) continue uitwisseling tussen de stroom paden dat voorziet in een verbeterde kans voor reagentia aan proeven van de volledige reeks van optimale temperatuur profielen, en ( 2) meer tijd doorgebracht in de uitbreiding temperatuur zone de snelheidsbepalende stap van de PCR. Extreem snelle DNA-amplificatie keer (minder dan 10 min) zijn haalbaar in reactoren ontwikkeld om deze stromen te genereren.

Beschrijven we een nieuwe methode om DNA-replicatie uit te voeren via de polymerase chain reaction (PCR). Thermische convectie wordt benut om continu pendeldienst tussen de reagentia denatureren, gloeien, en uitbreiding voorwaarden door het handhaven van tegenovergestelde vlakken van de reactor bij constante temperatuur. Dit inherent eenvoudige ontwerp belooft om een ​​snelle PCR meer toegankelijk.

Snelle PCR thermocycling met Microscale Thermal Convectie

Veel moleculair biologische assays zijn op een bepaalde manier afhankelijk van de polymeraseketenreactie (PCR) om een aanvankelijk verdund target-DNA-monster te amplificeren tot een detecteerbaar...

Het algemene doel van deze procedure is om aan te tonen hoe het principe van PCR-thermocycleren via thermische convectie kan worden toegepast om een feitelijke reactie uit te voeren. Dit wordt bereikt door eerst het idee te introduceren van hoe thermocycleren door natuurlijke convectie werkt, samen met de basisontwerpprincipes. De tweede stap van de procedure is het laten zien hoe de reactiecartridge wordt voorbereid en hoe de reagentia hierin worden geladen.De derde stap van de procedure is het monteren van de reactorkit in de verwarmingseenheid en het uitvoeren van de reactie. De laatste stap van de procedure is het verwijderen van de reagentia na de reactie en het controleren van de resultaten met gelelektroforese. Uiteindelijk kunnen resultaten worden behaald die een snelle DNA-replicatie aantonen via natuurlijke convectie PCR-thermocycling.Hoi, ik ben Radha OU van het UGAs-lab aan Texas A&amp;M University. Vandaag laten we u een procedure zien voor het uitvoeren van snelle PCR-thermocycling met behulp van natuurlijke convectie, vergelijkbaar met een lavalamp. Wij gebruiken deze procedure in het laboratorium om het ontwerp en de optimalisatie van thermocycling-apparaten die gebruikmaken van dit principe te bestuderen.Laten we beginnen. Dit protocol start met het ontwerp en de constructie van een eenvoudig convectief thermocycling-apparaat. Het apparaat dat voor deze demonstratie wordt gebruikt, bestaat uit uitwisselbare plastic reactiekamer-cartridges die tussen twee aluminium platen zijn geplaatst waarvan de temperaturen onafhankelijk van elkaar worden geregeld.Cilindrische reactorputjes werden ingebed door matrices van gaten te frezen in polycarbonaatblokken, waarbij verschillende combinaties van totale diameter en dikte van de kunststofplaat werden gebruikt om de gewenste aspectratio's te bereiken. Een optimaal ontwerp houdt in dat de juiste reactorgeometrie wordt gekozen die een circulatiestroom genereert die in staat is om reagentia te transporteren door de belangrijkste temperaturen die betrokken zijn bij het PCR-proces. De geometrische parameters die in de hier beschouwde cilindrische reactoren kunnen worden gevarieerd, zijn de hoogte en diameter, of gelijkwaardig daaraan de aspectratio.Het onderste oppervlak van de reactor wordt verwarmd met een aluminium blok dat patroonverwarmers bevat, welke zijn gekoppeld aan een door een microprocessor aangestuurde temperatuurregelaar. De temperatuur aan het bovenste oppervlak van de reactor wordt geregeld met een aluminium blok dat is aangesloten op een recirculerend waterbad. De gehele opstelling is met nylon schroeven op elkaar geklemd om thermische geleiding tussen de tegenover elkaar liggende aluminium blokken te beperken.Bereid elke PCR-reactie van 100 µL voor door een 10x bufferoplossing, 25 mM magnesiumchloride, twee dNTP's, gedestilleerd water, de bèta-actine probe, forward primer, reverse primer, menselijk genomisch template-DNA en K-O-D D-N-A polymerase te mengen. Verzegel vóór het toevoegen van de reagentia het bodemoppervlak van de PCR-kamer met een dunne strook aluminiumtape, spoel de reactieputjes met een waterige oplossing van 10 mg/mL runderserumalbumine en breng vervolgens Rain-X anti-fog aan. Pipetteer tot slot de reagentia in de reactieputjes met behulp van gel-laadtips en verzegel het bovenoppervlak met FEP-Teflontape.Verwarm beide aluminiumblokken voor tot de gewenste boven- en onderoppervlaktetemperaturen voordat de reactie wordt gestart. Plaats de plastic reactor, gevuld met de PCR-reagentia, tussen de aluminium verwarmingsblokken en klem de assemblage snel samen met nylon schroeven. Wanneer de reactie de gewenste tijd heeft doorlopen, schakel de verwarmers uit en plaats het onderste verwarmde oppervlak van het apparaat op een gekoeld metaalblok om het snel af te koelen en de convectiestroom te stoppen.Verwijder de plastic reactor en pipetteer de producten uit de wells voor verdere analyse. Bereid een 2% agarosegel voor door 10 gram agarose te verhitten met 500 milliliter één keer buffer op een roerplaat met verwarming totdat de oplossing helder wordt. Giet de agarosegel in het gietframe en plaats de kam.Laat de gel ongeveer 30 minuten uitharden. Verwijder de kam en voeg 1× TAE-buffer toe tot de gel volledig is ondergedompeld. Bereid fluorescent gekleurde DNA-monsters voor met 2 µL van 100× cyber green.Meng één oplossing van 2 µL DNA-monster, 2 µL zesvoudige oranje ladingskleurstof en 4 µL TAE-buffer. Laad een 100 bp DNA-ladder als grootte-marker en de DNA-monsters in de putjes van de gel. Scheid het DNA door de gel gedurende één uur op 60 V te draaien.Verwijder de gel en fotografeer deze onder UV-licht om het resultaat te verkrijgen. De 3D-stroomvelden in convectieve PCR-reactoren werden onderzocht over een reeks verschillende aspectratio's met behulp van computational fluid dynamics of CFD. Deze gegevens onthulden dat er complexe patronen kunnen ontstaan en dat een subset van deze complexe stroomvelden de reactie aanzienlijk kan versnellen.Deze geometrische effecten kunnen duidelijk worden waargenomen door de stroomvelden in reactoren met een hoge en lage aspectratio te vergelijken met een hoge aspectratio. Fluïde elementen worden langs trajecten beïnvloed, waarbij zij paden volgen die in essentie gesloten lussen vormen en gedurende lange perioden vastzitten aan dezezelfde paden. Bijgevolg is er weinig mogelijkheid tot uitwisseling tussen stroomtrajecten die reagentia blootstellen aan de optimale volgorde van thermische condities voor PCR en het veel grotere geheel van overige trajecten die niet bijdragen aan de amplificatie.Het stromingsveld is zeer verschillend bij een kleinere aspectratio. Het stromingsveld is chaotischer, aangezien de trajecten van de vloeistofelementen geen gesloten paden meer volgen. Hoewel de reacties worden blootgesteld aan een complexer temperatuurprofiel, kunnen vloeistofelementen een veel breder scala aan trajecten verkennen, waardoor een groter deel van het reagensvolume de kans heeft om optimale thermische profielen te ervaren.Deze resultaten suggereren dat hoewel individuele stroomtrajecten bij H over D gelijk aan negen gunstiger lijken voor PCR, doordat ze temperatuurprofielen produceren die vergelijkbaar zijn met die in een conventionele thermocycler, de chaotische aard van het stromingsveld bij HOD gelijk aan drie op globale schaal uiteindelijk overheerst door een verbeterde uitwisseling te bevorderen, waardoor reagentia niet langdurig vast komen te zitten in ongunstige trajecten. Om deze hypothese te testen en te bepalen welke reactorgeometrie gunstiger was voor PCR, werden beide cilinders gebruikt voor de PCR-replicatie van een target van 295 basenparen geassocieerd met het bèta-actinegen vanuit een menselijk genomisch DNA-template; de amplificatie van het juiste targetproduct werd herhaaldelijk bereikt in slechts 10 minuten bij H over D gelijk aan drie.Omgekeerd vereiste dezelfde reactie ten minste 20 minuten voordat detecteerbare producten werden waargenomen bij H over D equals negen. De reactiespecificiteit is bovendien veel groter bij H over D equals drie, waarbij een enkel PCR-product wordt verkregen. Er worden daarentegen meerdere aspecifieke producten gegenereerd bij H over D equals negen, waarbij het stromingsveld vloeistofelementen gedurende langere tijd in ongunstige thermische trajecten vasthoudt.We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u een PCR-reactie uitvoert met een convective flow thermocycler. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden de reagentia in de reactorkamer af te sluiten zonder luchtbellen te laten ontstaan. Deze zouden het stromingsveld binnenin verstoren en de reactie remmen.Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

rapid-pcr-thermocycling-using-microscale-thermal-convection

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We zullen aantonen de opzet en analyse van pre-microRNA 96-wells-arrays voor QPCR het gebruik van een robot als door de hand met een Thermo Scientific Matrix multichannel pipet.

Profilering van de Pre-micro-RNA&#39;s en microRNA&#39;s met behulp van kwantitatieve real-time PCR (qPCR) arrays

PCR heeft zich ontpopt als een veelgebruikte techniek in veel moleculair-biologische laboratoria. Mits hier is een kort overzicht van enkele conventionele PCR-protocollen. Omdat elk reactie is een uniek experiment optimale voorwaarden te genereren product variëren. Begrijpen van de variabelen in een reactie, zal ook problemen efficiency, waardoor de kans op het gewenste resultaat.

Polymerase Chain Reaction: Basis Protocol Plus Problemen oplossen en Optimalisatie Strategieën

Protein misfolding cyclische amplificatie (PMCA) is een in vitro assay voor de studie van prion conversie en spanning en species barrières. Het kan ook worden gebruikt als een prion detectie assay.

Eiwit misfolding Cyclische Versterking van prionen

Pyrosequencing is een veelzijdige techniek die microbiële genoom die kan worden gebruikt om bacteriële species te identificeren, discrimineren bacteriestammen en detecteren genetische mutaties die resistentie tegen antimicrobiële middelen vergemakkelijkt. In deze video, zal de procedure voor microbiële amplicon generatie, amplicon pyrosequencing, en DNA-sequentie-analyse worden aangetoond.

Pyrosequentiebepaling voor Microbiële identificatie en karakterisering

We beschrijven een protocol van real time PCR om microRNA profileren in de cerebrospinale vloeistof (CSF). Met uitzondering van RNA-extractie protocollen kan de procedure worden uitgebreid tot RNA geëxtraheerd uit andere lichaamsvloeistoffen, gekweekte cellen of weefselmonsters.

Cerebrospinale vloeistof MicroRNA Profiling Met behulp van kwantitatieve real time PCR

Dit protocol beschrijft de kritische stappen en voorzorgsmaatregelen moeten uitvoeren van eencellige multiplex omgekeerde transcriptie polymerase-kettingreactie na patch-clamp. Deze techniek is een eenvoudige en effectieve methode voor het analyseren van het profiel van de expressie van een vooraf vastgesteld samenstel van genen van een enkele cel gekenmerkt door patch-clamp recordings.

Eencellige Multiplex omgekeerde transcriptie Polymerase-kettingreactie na Patch-clamp

Kinetische cross-linking en analyse van cDNA is een methode die onderzoek mogelijk maakt naar de dynamiek van eiwit-RNA interacties in levende cellen met een hoge temporele resolutie. Hier wordt het protocol in detail beschreven, inclusief de groei van gistcellen, UV-crosslinking, oogsten, eiwitzuivering en voorbereidingsstappen voor de volgende generatie sequencingbibliotheek.

Monitoring van eiwit-RNA interactiedynamica in vivo bij hoge temporele resolutie met behulp van χCRAC

Dit protocol beschrijft hoe je een continuous-flow-polymeraseketensysteem bouwt op basis van een microfluïdische chip en hoe je een capillair elektroforesesysteem bouwt in het lab. Het presenteert een eenvoudige methode voor de analyse van nucleïnezuren in het laboratorium.

Amplificatie van Escherichia coli in een Continuous-Flow-PCR microfluïdische chip en de detectie ervan met een capillair elektroforesesysteem

De volledige genotypering van een muis staart monster, met inbegrip weefsel spijsvertering en PCR uitlezing, wordt gedaan in een en een half uur met behulp van Sigma's SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR kit.

Snelle genotypering van Mouse weefsel met behulp van Sigma&#39;s Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

De Solaris qPCR Gene Expression Assays zijn nieuwe vooraf ontworpen qPCR primer / probe met het doel de qPCR proces te vereenvoudigen zonder dat de specificiteit en robuustheid van de test.

Kwantitatieve real-time PCR met behulp van de Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Leer snelle PCR-thermocycling met microscale thermische convectie voor DNA-versterking. Deze methode gebruikt natuurlijke convectie om reagentia tussen temperatuurzones te transporteren.

Snelle PCR thermocycling met Microscale Thermal Convectie

Meer video's verkennen