Inductie en controle van Active Vertraagde overgevoeligheidsreacties (DTH) bij ratten

Hallo, ik ben Christine Beaton. Ik werk in het laboratorium van George Chandy bij de afdeling Fysiologie en Biofysica aan de UCI. Vandaag ga ik u laten zien hoe u actieve DTH bij ratten induceert.

Daarom ga ik een emulsie bereiden van KLH, mijn antigeen, in Freunds adjuvant. Vervolgens zal ik deze emulsie injecteren aan de basis van de staart van Lewis-ratten. Dit zal immunisatie van de ratten tegen KLH induceren. Na één week zal ik de ratten uitdagen met KLH en de DTH-reactie meten door de zwelling te kwantificeren.

Dit is de plaats van de uitdaging en we gebruiken dit in het laboratorium om het effect van PO-kanaalblokkers op ontstekingsreacties zoals DTH te bestuderen. Hier is het incomplete trans-adjuvans dat ik ga gebruiken om de emulsie te maken. Ik zou ook compleet trans-adjuvans kunnen gebruiken.

Hier is kwartskristal van KLH, wat vandaag mijn antigeen is, en ik heb hier een oplossing van 2 mg/ml in PBS. Met deze spuit van 5 ml ga ik het incomplete Tween-adjuvans opnemen en overbrengen naar een buisje van 15 ml. Vervolgens plaats ik het buisje in de vortexし en voeg ik, tijdens het vortexen, mijn antigeen druppel voor druppel toe aan het adjuvans.

Vervolgens ga ik het geheel nog vijf minuten vortexen. Daarna vul ik deze glazen spuit van 5 mL met mijn mengsel; het moet een glazen spuit zijn omdat het adjuvans de neiging heeft om plastic aan te tasten. We hebben gemerkt dat spuiten van 5 mL het meest geschikt zijn voor het maken van de emulsie.

Kleiner of groter is minder optimaal. Zodra ik mijn spuit met het mengsel heb gevuld, gebruik ik deze metalen brug om deze glazen spuit te verbinden met een andere glazen spuit van vijf ml. Vervolgens oefen ik druk uit op de spuiten zodat mijn mengsel zo snel mogelijk van de ene spuit naar de andere gaat, totdat het echt dik wordt, totdat de emulsie echt dik wordt en klaar is voor injectie.

Ik ga nu 2,5 ml van mijn adjuvans toevoegen. Ik injecteer eerst wat lucht om het adjuvans makkelijker uit de spuit te kunnen krijgen en voeg vervolgens al het adjuvans toe aan mijn buisje. Vervolgens neem ik 2,5 ml van deze oplossing en voeg ik die toe terwijl ik meng op de vortex.

Aangezien ik 2,5 ml van het adjuvans heb genomen, ga ik nu 2,5 ml van mijn KLH toevoegen. Terwijl ik dit druppel voor druppel toevoeg, zult u zien dat het mengsel van kleur verandert en wit wordt. Nu heb ik al het antigeen aan het adjuvans toegevoegd.

Ik ga het mengsel nu nog vijf minuten vortexen. Omdat ik de buis niet vijf minuten lang vast wil houden, plak ik deze met tape aan de vortexer. Zorg dat de vortex in de buis zo snel mogelijk is, maar voorkom dat de inhoud overloopt. Ik laat het geheel nu vijf minuten zo staan.

De vijf minuten zijn nu voorbij. Ik stop nu de vortex en mijn mengsel is wit. Dus ik haal de buis eruit. Oeps.

Het mengsel is inmiddels volledig wit, maar het is nog vrij vloeibaar. Voor de injectie is een stevigere consistentie gewenst. Daarom zal ik het gehele mengsel overbrengen naar een glazen spuit van 5 mL.

Deze spuiten zijn geautoclaveerd. Ik verbind een complete spuit met mijn brug. Van de andere spuit verbind ik alleen de cilinder.

Ik laat de zuiger eruit en giet vervolgens mijn mengsel in de bovenste spuit. Ik ga alles overbrengen naar de onderste spuit. Daarna moet ik de luchtbel die hier zit, wegduwen.

Ik ga nu de bovenste spuit loskoppelen om de luchtbel te verwijderen. De bel is moeilijk te zien, maar hij bevindt zich hier. Dus ik verwijder de luchtbel.

Ik jaag het ook uit de verbindingsstuk, en vervolgens sluit ik de bovenste spuit opnieuw aan. Ik zorg ervoor dat alles stevig is verbonden, waarna ik mijn mengsel van de ene spuit naar de andere ga overbrengen. In het begin is dit eenvoudig, maar al snel zal het mengsel harder worden.

Vanavond wordt het moeilijker en ik wil de brug niet verbreken, dus ik draai simpelweg mijn spuiten. Soms duurt het langer. Dit varieert van emulsie tot emulsie.

Het hangt waarschijnlijk ook af van de temperatuur en de luchtvochtigheid. Maar ik denk dat mijn emulsie klaar is. Deze is veel dikker dan toen ik deze inschenkt.

Het is volledig wit. En er is slechts één fase. Er mag nooit een scheiding optreden van de ACO-fase van de olie.

Het is nu klaar voor injectie. De immersie is nu klaar om geïnjecteerd te worden. Om dit te injecteren, gebruik ik 200 µL per hut.

Hiervoor ga ik spuiten van 3 ml gebruiken. Ik gebruik spuiten met een Luer-lock aansluiting om te voorkomen dat de naald loslaat, omdat de emulsie erg dik kan zijn en lastig te injecteren is. Wat betreft de naalden probeer ik de kleinst mogelijke naalden te gebruiken waardoor de emulsie nog wel kan passeren.

En ik heb gemerkt dat de 20 3G spuiten voldoende zijn voor deze emulsie. Voor dikkere emulsies moet u mogelijk grotere spuiten gebruiken. De manier waarop wij dit doen, is dat één persoon de rat vasthoudt en de andere persoon injecteert.

En voor maximale veiligheid draagt de persoon die de ratten vasthoudt — hoewel deze ratten zeer rustig zijn en gewend zijn aan hantering — deze knaagdierbestendige handschoenen, simpelweg voor maximale veiligheid, omdat we beetwonden willen voorkomen. Vervolgens breng ik de volledige emulsie over in één glazen spuit en koppel ik de lege glazen spuit los van de brug. Op die plaats plaats ik mijn Luer-lock plastic spuit van 3 mL.

Nu breng ik meer over dan nodig is voor één emulsiegeul. Ik verdrijf de luchtbel. Aangezien ik 200 µL per geul ga injecteren, laat ik 300 µL in mijn spuit achter.

Ik ontkoppel de brug, ik plaats de naald op mijn plastic spuit, vul de naald en breng de zuiger naar 200 µL. Op die manier weet ik zeker dat er geen luchtbellen in zitten. Nu zijn we klaar om te injecteren.

We willen ervoor zorgen dat de rat niet beweegt. Daarom pak ik de rat vast en plaats ik één vinger boven de schouder en één eronder; met de andere hand houd ik de achterpoten en de staart vast. We gaan nu injecteren in de flanken: we dienen microliters toe aan deze zijde en vervolgens microliters aan de andere zijde. Vorige week heb ik de ratten geïmmuniseerd met een emulsie die KLH als antigeen bevatte.

En vandaag ga ik ze intradermaal op de rug uitdagen met KLH, mijn antigeen, en met o albumin, wat een relevant antigeen is. Om ze echter intradermaal op de rug te kunnen injecteren, moet ik ze eerst scheren. Hiervoor gebruik ik een eenvoudige elektrische scheermachine. Ik vervang de naalden tussen elke rat om ervoor te zorgen dat de naald niet stomp is.

Dit maakt intradermale injectie veel gemakkelijker, vooral omdat ik kleine volumes van 20 µL van elk antigeen injecteer. Ik heb nu beide antigenen in alle ratten geïnjecteerd en ik laat ze tot morgen in hun kooien. Morgen zullen we een ontsteking kunnen waarnemen.

De injectieplaats zal rood en gezwollen zijn, waardoor we de diameter van de ontsteking kunnen meten als maatstaf voor de mate van inflammatie. Gisteren heb ik de ratten intradermaal in de rug uitgedaagd met het relevante antigeen, KLH, en een irrelevant antigeen, albumin. Nu, 24 uur later, ga ik de ratten nakijken om te zien of er sprake is van een ontsteking.

Ik verwacht daarom alleen ontsteking op de plek van de KLH-injectie, en deze ontsteking zal zich uiten als roodheid en zwelling. Nadat ik de ontsteking heb vastgesteld, ga ik het ontstoken gebied meten door simpelweg de diameter van het gebied te bepalen. Dit is hier de plek waar KLH is geïnjecteerd en u kunt duidelijk zien dat er sprake is van een enorme ontsteking.

Het is zeer rood vergeleken met normale huid en het is gezwollen. Als we nu kijken naar de andere plek die albumine ontvangt, kunt u hier de injectieplaats zien, maar er is geen significante roodheid of zwelling. De negatieve controle heeft dus gewerkt.

Ik ga nu de plek van de ontsteking opmeten. Hiervoor gebruik ik een gewone liniaal en voer ik een meting uit in millimeters. Deze meet zes millimeter en ik neem een tweede meting.

Dit weegt vijf millimeter. Er is zeer weinig roodheid; ik zal de meting uitvoeren, maar het is nauwelijks één millimeter. Wat ik u hier heb laten zien, is hoe u een emulsie met een antigeen bereidt, hoe u ratten immuniseert met deze emulsie, hoe u hen een week later uitdaagt met het antigeen dat voor de immunisatie is gebruikt en tevens met een relevant antigeen, en hoe u de graad van ontsteking visualiseert en meet in het gebruikte en in het Chan-lab.

Wij maken deze techniek vrij routinematig gebruik van als een eenvoudige assay om het effect van kaliumkanaalblokkers op inflammatie bij ratten te meten.