Name: Inductie en controle van Active Vertraagde overgevoeligheidsreacties (DTH) bij ratten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 26 s
Description: Leer de inductie van actieve vertraagde overgevoeligheidsreacties (DTH) bij Lewis-ratten met behulp van KLH-antigeen in Freund's adjuvans. Deze methode maakt het mogelijk om ontstekingsreacties te meten via zwelling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. De voorbereiding van de emulsie <ol><li> De emulsie is een 1:1 mengsel van antigeen (DTH kunnen ertoe worden aangespoord verschillende antigenen: ovalbumine, tetanustoxoïd, keyhole limpet hemocyanine ....) in waterige oplossing toegevoegd aan Freund&#39;s adjuvans te voltooien. Het is zeer belangrijk om het antigeen toe te voegen aan de hulpstof en niet andersom! </li><li> Er is een veel afval bij het maken van en het injecteren van een emulsie, dus altijd voor te bereiden 1,5 of 2 keer meer dan wat je nodig hebt. </li><li> Los antigeen in een zoutoplossing met een 2 mg / ml oplossing voor te bereiden. Geen filter, als je niet wilt dat de aggregaten verliezen! </li><li> Zet volledige Freund&#39;s adjuvans H37Ra (Difco, catalogus # 231.131) in een buis en vortex op hoge snelheid. Voeg de antigeen druppelsgewijs, terwijl vortexen. Wanneer alle van het antigeen wordt toegevoegd, vortex nog 5 minuten. Het mengsel moet wit worden. </li><li> Doe de emulsie in een glazen injectiespuit en een link naar een andere glazen injectiespuit met behulp van een 18G brug (Fisher catalogus # 14 tot 825-17L). Stuur de emulsie uit een spuit naar de andere totdat het wordt moeilijk (5-10 min). Het beste is om gebruik van twee 5 ml spuiten. Als er meer dan 5 ml van de emulsie nodig zijn, gebruik maken van verschillende sets van 5 ml spuiten. </li><li> De emulsie kan worden opgeslagen in de spuiten bij 4 ° C gedurende 3 weken. </li></ol> 2. Immunisatie van de ratten <ol><li> Meng de emulsie in de spuiten voor een paar minuten en transfer naar de spuit die voor de injectie. Subcutaan injecteren 200 ml binnen 1-2 plaatsen aan de basis van de staart met behulp van 23G naalden en een Luer-Lok tip 3 ml spuit. </li></ol> 3. Uitdaging met antigeen in de rug <ol><li> Zeven dagen na immunisatie, scheren 2 vlekken op de rug van de ratten en injecteer intradermaal 20 ml van een 1 mg / ml antigen oplossing in een plek en zout (of irrelevante antigeen) in de andere plek. NIET filter het antigeen-oplossing, zoals je misschien losse aggregaten die de ontstekingsreactie te versterken. </li><li> De ratten moeten anesthesized om bewegingen te voorkomen. Injecteer de oplossing intradermaal met behulp van 27G ½ naalden en 1 ml spuiten. Verandering naalden tussen de injecties. Let op: de uitdaging kan gedaan worden in de oorschelp van de oren in plaats van de rug voor meer nauwkeurige metingen. Zie video op <a href="/index/Details.stp?ID=325">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=325</a> </li></ol> 4. Meting van DTH <ol><li> De plaats van injectie zal beginnen te draaien rood en gezwollen als een teken van ontsteking. Meet de diameter van het ontstoken gebied met behulp van een liniaal of, beter nog, met een dikte. De maximale zwelling moet plaatsvinden tussen 24 en 72 uur. </li></ol>

<ol>
	<li>Beeton, C., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+monitoring+of+adoptive+delayed-type+hypersensitivity+in+rats.">Induction and monitoring of adoptive delayed-type hypersensitivity in rats.</a> Journal of Visualized Experiments. 8, (2007).</li></ol>

De auteurs zijn mede-oprichters en consultants voor Airmid Inc

Voor een meer nauwkeurige meting van de DTH-reactie raden wij aan tegen de ratten met het antigeen in de oorschelp van het oor. De reactie kan dan worden gemeten als een verschil in het oor van zwelling tussen de relevante antigeen-uitgedaagd oor en het oor uitgedaagd met een zoutoplossing alleen of met de irrelevante antigeen. Een demonstratie van de uitdaging in het oor wordt getoond in een.

Gebruik steriele oplossingen reagentia en spuiten. Het glas spuiten en 18G bruggen kunnen worden geautoclaveerd. Lees materiaal veiligheidsinformatieblad voordat u een reagens voor de eerste keer en geschikte kleding te dragen.

inductie en controle van active vertraagde overgevoeligheidsreacties (dth) bij ratten

Induction and Monitoring of Active Delayed Type Hypersensitivity (DTH) in Rats

Vertraagde type overgevoeligheid (DTH) is een ontstekingsreactie gemedieerd door CCR7-effector-geheugen T-lymfocyten die de plaats van de injectie van een antigen waartegen het immuunsysteem is gevuld te infiltreren. De ontstekingsreactie wordt gekenmerkt door roodheid en zwelling van de site van antigene uitdaging. Het is een handig model om vast te stellen de in vivo werkzaamheid van immunosuppressiva. Cutane DTH kan worden geïnduceerd door adoptieve overdracht van antigeen-specifieke T-lymfocyten of door actieve immunisatie met een antigeen, en de daaropvolgende intradermale uitdaging met het antigeen van de ontstekingsreactie in een bepaald huidgebied induceren. DTH reacties kunnen worden veroorzaakt aan verschillende antigenen, zoals ovalbumine, tuberculine, tetanustoxoïd of keyhole limpet hemocyanine (KLH). Hier laten we zien hoe een actieve DTH reactie in Lewis ratten veroorzaken. We zullen een water-in-olie emulsie van KLH, onze antigeen van belang, eerst voor te bereiden in volledig Freund&#39;s adjuvans en subcutaan injecteren deze emulsie aan ratten. Dit zal premier van het immuunsysteem in het geheugen T-cellen gericht aan KLH te ontwikkelen. Zeven dagen later zullen we intradermaal uitdaging de ratten op de rug met KLH aan de ene kant en met ovalbumine, een irrelevante antigen, aan de andere kant. De ontstekingsreactie is zichtbaar 16 tot 72 uur later en de rode en gezwollen gebied zal worden gemeten als een indicatie van de DTH ernst.

Vertraagde type overgevoeligheid (DTH) is een ontstekingsreactie gemedieerd door CCR7-effector geheugen T-lymfocyten. Hier laten we zien hoe actief DTH induceren in Lewis ratten en toezicht op de ontstekingsreactie.

Inductie en controle van Active Vertraagde overgevoeligheidsreacties (DTH) bij ratten

Vertraagde overgevoeligheidsreactie (DTH) is een inflammatoire reactie die wordt gemedieerd door CCR7-effectorgeheugen T-lymfocyten die infiltreren op de injectieplaats van ...

Hallo, ik ben Christine Beaton. Ik werk in het laboratorium van George Chandy bij de afdeling Fysiologie en Biofysica aan de UCI. Vandaag ga ik u laten zien hoe u actieve DTH bij ratten induceert.Daarom ga ik een emulsie bereiden van KLH, mijn antigeen, in Freunds adjuvant. Vervolgens zal ik deze emulsie injecteren aan de basis van de staart van Lewis-ratten. Dit zal immunisatie van de ratten tegen KLH induceren. Na één week zal ik de ratten uitdagen met KLH en de DTH-reactie meten door de zwelling te kwantificeren.Dit is de plaats van de uitdaging en we gebruiken dit in het laboratorium om het effect van PO-kanaalblokkers op ontstekingsreacties zoals DTH te bestuderen. Hier is het incomplete trans-adjuvans dat ik ga gebruiken om de emulsie te maken. Ik zou ook compleet trans-adjuvans kunnen gebruiken.Hier is kwartskristal van KLH, wat vandaag mijn antigeen is, en ik heb hier een oplossing van 2 mg/ml in PBS. Met deze spuit van 5 ml ga ik het incomplete Tween-adjuvans opnemen en overbrengen naar een buisje van 15 ml. Vervolgens plaats ik het buisje in de vortexし en voeg ik, tijdens het vortexen, mijn antigeen druppel voor druppel toe aan het adjuvans.Vervolgens ga ik het geheel nog vijf minuten vortexen. Daarna vul ik deze glazen spuit van 5 mL met mijn mengsel; het moet een glazen spuit zijn omdat het adjuvans de neiging heeft om plastic aan te tasten. We hebben gemerkt dat spuiten van 5 mL het meest geschikt zijn voor het maken van de emulsie.Kleiner of groter is minder optimaal. Zodra ik mijn spuit met het mengsel heb gevuld, gebruik ik deze metalen brug om deze glazen spuit te verbinden met een andere glazen spuit van vijf ml. Vervolgens oefen ik druk uit op de spuiten zodat mijn mengsel zo snel mogelijk van de ene spuit naar de andere gaat, totdat het echt dik wordt, totdat de emulsie echt dik wordt en klaar is voor injectie.Ik ga nu 2,5 ml van mijn adjuvans toevoegen. Ik injecteer eerst wat lucht om het adjuvans makkelijker uit de spuit te kunnen krijgen en voeg vervolgens al het adjuvans toe aan mijn buisje. Vervolgens neem ik 2,5 ml van deze oplossing en voeg ik die toe terwijl ik meng op de vortex.Aangezien ik 2,5 ml van het adjuvans heb genomen, ga ik nu 2,5 ml van mijn KLH toevoegen. Terwijl ik dit druppel voor druppel toevoeg, zult u zien dat het mengsel van kleur verandert en wit wordt. Nu heb ik al het antigeen aan het adjuvans toegevoegd.Ik ga het mengsel nu nog vijf minuten vortexen. Omdat ik de buis niet vijf minuten lang vast wil houden, plak ik deze met tape aan de vortexer. Zorg dat de vortex in de buis zo snel mogelijk is, maar voorkom dat de inhoud overloopt. Ik laat het geheel nu vijf minuten zo staan.De vijf minuten zijn nu voorbij. Ik stop nu de vortex en mijn mengsel is wit. Dus ik haal de buis eruit. Oeps.Het mengsel is inmiddels volledig wit, maar het is nog vrij vloeibaar. Voor de injectie is een stevigere consistentie gewenst. Daarom zal ik het gehele mengsel overbrengen naar een glazen spuit van 5 mL.Deze spuiten zijn geautoclaveerd. Ik verbind een complete spuit met mijn brug. Van de andere spuit verbind ik alleen de cilinder.Ik laat de zuiger eruit en giet vervolgens mijn mengsel in de bovenste spuit. Ik ga alles overbrengen naar de onderste spuit. Daarna moet ik de luchtbel die hier zit, wegduwen.Ik ga nu de bovenste spuit loskoppelen om de luchtbel te verwijderen. De bel is moeilijk te zien, maar hij bevindt zich hier. Dus ik verwijder de luchtbel.Ik jaag het ook uit de verbindingsstuk, en vervolgens sluit ik de bovenste spuit opnieuw aan. Ik zorg ervoor dat alles stevig is verbonden, waarna ik mijn mengsel van de ene spuit naar de andere ga overbrengen. In het begin is dit eenvoudig, maar al snel zal het mengsel harder worden.Vanavond wordt het moeilijker en ik wil de brug niet verbreken, dus ik draai simpelweg mijn spuiten. Soms duurt het langer. Dit varieert van emulsie tot emulsie.Het hangt waarschijnlijk ook af van de temperatuur en de luchtvochtigheid. Maar ik denk dat mijn emulsie klaar is. Deze is veel dikker dan toen ik deze inschenkt.Het is volledig wit. En er is slechts één fase. Er mag nooit een scheiding optreden van de ACO-fase van de olie.Het is nu klaar voor injectie. De immersie is nu klaar om geïnjecteerd te worden. Om dit te injecteren, gebruik ik 200 µL per hut.Hiervoor ga ik spuiten van 3 ml gebruiken. Ik gebruik spuiten met een Luer-lock aansluiting om te voorkomen dat de naald loslaat, omdat de emulsie erg dik kan zijn en lastig te injecteren is. Wat betreft de naalden probeer ik de kleinst mogelijke naalden te gebruiken waardoor de emulsie nog wel kan passeren.En ik heb gemerkt dat de 20 3G spuiten voldoende zijn voor deze emulsie. Voor dikkere emulsies moet u mogelijk grotere spuiten gebruiken. De manier waarop wij dit doen, is dat één persoon de rat vasthoudt en de andere persoon injecteert.En voor maximale veiligheid draagt de persoon die de ratten vasthoudt — hoewel deze ratten zeer rustig zijn en gewend zijn aan hantering — deze knaagdierbestendige handschoenen, simpelweg voor maximale veiligheid, omdat we beetwonden willen voorkomen. Vervolgens breng ik de volledige emulsie over in één glazen spuit en koppel ik de lege glazen spuit los van de brug. Op die plaats plaats ik mijn Luer-lock plastic spuit van 3 mL.Nu breng ik meer over dan nodig is voor één emulsiegeul. Ik verdrijf de luchtbel. Aangezien ik 200 µL per geul ga injecteren, laat ik 300 µL in mijn spuit achter.Ik ontkoppel de brug, ik plaats de naald op mijn plastic spuit, vul de naald en breng de zuiger naar 200 µL. Op die manier weet ik zeker dat er geen luchtbellen in zitten. Nu zijn we klaar om te injecteren.We willen ervoor zorgen dat de rat niet beweegt. Daarom pak ik de rat vast en plaats ik één vinger boven de schouder en één eronder; met de andere hand houd ik de achterpoten en de staart vast. We gaan nu injecteren in de flanken: we dienen microliters toe aan deze zijde en vervolgens microliters aan de andere zijde. Vorige week heb ik de ratten geïmmuniseerd met een emulsie die KLH als antigeen bevatte.En vandaag ga ik ze intradermaal op de rug uitdagen met KLH, mijn antigeen, en met o albumin, wat een relevant antigeen is. Om ze echter intradermaal op de rug te kunnen injecteren, moet ik ze eerst scheren. Hiervoor gebruik ik een eenvoudige elektrische scheermachine. Ik vervang de naalden tussen elke rat om ervoor te zorgen dat de naald niet stomp is.Dit maakt intradermale injectie veel gemakkelijker, vooral omdat ik kleine volumes van 20 µL van elk antigeen injecteer. Ik heb nu beide antigenen in alle ratten geïnjecteerd en ik laat ze tot morgen in hun kooien. Morgen zullen we een ontsteking kunnen waarnemen.De injectieplaats zal rood en gezwollen zijn, waardoor we de diameter van de ontsteking kunnen meten als maatstaf voor de mate van inflammatie. Gisteren heb ik de ratten intradermaal in de rug uitgedaagd met het relevante antigeen, KLH, en een irrelevant antigeen, albumin. Nu, 24 uur later, ga ik de ratten nakijken om te zien of er sprake is van een ontsteking.Ik verwacht daarom alleen ontsteking op de plek van de KLH-injectie, en deze ontsteking zal zich uiten als roodheid en zwelling. Nadat ik de ontsteking heb vastgesteld, ga ik het ontstoken gebied meten door simpelweg de diameter van het gebied te bepalen. Dit is hier de plek waar KLH is geïnjecteerd en u kunt duidelijk zien dat er sprake is van een enorme ontsteking.Het is zeer rood vergeleken met normale huid en het is gezwollen. Als we nu kijken naar de andere plek die albumine ontvangt, kunt u hier de injectieplaats zien, maar er is geen significante roodheid of zwelling. De negatieve controle heeft dus gewerkt.Ik ga nu de plek van de ontsteking opmeten. Hiervoor gebruik ik een gewone liniaal en voer ik een meting uit in millimeters. Deze meet zes millimeter en ik neem een tweede meting.Dit weegt vijf millimeter. Er is zeer weinig roodheid; ik zal de meting uitvoeren, maar het is nauwelijks één millimeter. Wat ik u hier heb laten zien, is hoe u een emulsie met een antigeen bereidt, hoe u ratten immuniseert met deze emulsie, hoe u hen een week later uitdaagt met het antigeen dat voor de immunisatie is gebruikt en tevens met een relevant antigeen, en hoe u de graad van ontsteking visualiseert en meet in het gebruikte en in het Chan-lab.Wij maken deze techniek vrij routinematig gebruik van als een eenvoudige assay om het effect van kaliumkanaalblokkers op inflammatie bij ratten te meten.

induction-monitoring-active-delayed-type-hypersensitivity-dth

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Vertraagde type overgevoeligheid (DTH) is een ontstekingsreactie gemedieerd door CCR7-effector-geheugen T (TEM) lymfocyten. Hier laten we zien hoe de antigeen-specifieke TEM-cellen te activeren, te induceren adoptie-DTH bij Lewis ratten en toezicht op de ontstekingsreactie.

Inductie en Monitoring van Adoptieve vertraagd-type overgevoeligheid bij ratten

Hier laten we zien een methode voor het induceren en het opnemen van de voortgang van een vertraagde type-overgevoeligheid (DTH) reactie in de rat oor. Dit wordt gevolgd door een demonstratie van de voorbereiding van de rat oor weefsel voor twee-foton beeldvorming van de effector / geheugen T-cel-respons.

Imaging Effector geheugen T-cellen in het oor na inductie van Adoptieve DTH

Basofielen activatie test is een krachtig instrument voor de detectie van IgE-afhankelijke...

Basofiel activatie test voor Onderzoek van IgE-gemedieerde mechanismen in Drug Overgevoeligheid

We beschrijven een waardevolle diagnostische test die zouden kunnen worden gebruikt om de terugtrekking van immunosuppressie na transplantatie beslist zo verhoogd risico op afstoting. De test maakt gebruik van de principes van Delayed Type Overgevoeligheid en biedt nauwkeurige beoordeling van zowel donor-specifieke effector en regulerende immuunreacties gemonteerd door de ontvangers.

Trans-vivo Vertraagd Type Overgevoeligheid Assay voor Antigen Specifieke Verordening

Allergische reacties, gekenmerkt door de activering van mestcellen en basofielen, worden door de verknoping van IgE en het vrijkomen van pro-inflammatoire mediatoren. Een kwantitatieve beoordeling van allergische reacties kunnen worden bereikt door Evans Blue kleurstof veranderingen in vasculaire permeabiliteit na provocatie met allergeen controleren.

Meten Lokaal Anafylaxie in Muizen

Hier presenteren we een nieuwe methode voor het nauwkeurig meten van de lichaam temperatuurverschillen in passieve systemische anafylaxie (PSA) en voedsel allergie Muismodellen met behulp van een infrarood thermometer. Deze procedure is nauwkeurig gedupliceerd in de resultaten van de vorige PSA.

Muis lichaamstemperatuurmeting met behulp van Infrarood Thermometer tijdens passieve systemische anafylaxie en voedsel allergie evaluatie

We beschrijven een in vivo immunisatie, translationeel hepatitismodel in BALB / c-muizen dat kan worden gebruikt om de pathogenese van door geneesmiddelen geïnduceerde auto-immune hepatitis te bestuderen, inclusief geslachtsverschillen die bij deze ziekte worden waargenomen. We zullen beschrijven hoe dit model reproduceerbare analyses demonstreert met behulp van in vivo en in vitro experimentele technieken.

Inductie van geneesmiddel-geïnduceerde, auto-immune hepatitis bij BALB / c-muizen voor de studie van de pathogene mechanismen

Contactovergevoeligheid (CHS) is een muizenexperimenteel model van allergische contactdermatitis (ACD). CHS is gebaseerd op sensibilisatie met reactieve hapten door de geschoren huid van de borst en buik te schilderen, met een daaropvolgende oorhuiduitdaging met een verdunde hapten, waardoor een zwellingsreactie ontstaat die op verschillende manieren wordt beoordeeld.

Contactovergevoeligheid als een muizenmodel van allergische contactdermatitis

Inspanningen om de katalytische subeenheid van telomerase isoleren, tert, in voldoende hoeveelheden voor structurele studies, is voldaan met beperkt succes voor meer dan een decennium. Hier presenteren we methoden voor de isolatie van het recombinante Tribolium castaneum TERT...

In vitro reconstitutie van de Active T. castaneum Telomerase

Hier hebben we voorstellen eenvoudige methoden om hypoxie te induceren in celkweken en eenvoudige tests om de hypoxische status van de culturen te evalueren.

Inductie en testen van Hypoxie in celkweek

Leer de inductie van actieve vertraagde overgevoeligheidsreacties (DTH) bij Lewis-ratten met behulp van KLH-antigeen in Freund's adjuvans. Deze methode maakt het mogelijk om ontstekingsreacties te meten via zwelling.

Inductie en controle van Active Vertraagde overgevoeligheidsreacties (DTH) bij ratten

Meer video's verkennen