Nucleofection en Primaire Cultuur van de embryonale Mouse hippocampus en de corticale neuronen

Hippocampale en corticale neuronen zijn uitgebreid gebruikt om neuronale polarisatie van het centraal zenuwstelsel, axon-dendrietgroei en synaptische vorming en functie te bestuderen; een voordeel van het kweken van deze neuronen is dat ze gemakkelijk polariseren en kenmerkende axonen en dendrieten vormen op een tweedimensionaal substraat bij zeer lage dichtheden. Deze video demonstreert een techniek om embryonale muis-hippocampale en corticale neuronen te dissekeren, te kweken en te transfecteren via nucleofectie, wat de expressie van fluorescentie-gelabelde fusie-eiwitten mogelijk maakt in een vroeg stadium van de ontwikkeling, ongeveer vier tot acht uur na het uitplaten; de expressie van de fluorescentie-gelabelde eiwitten wordt gedurende de gehele levensduur van het neuron behouden, gedurende meer dan twee maanden in cultuur. Dit maakt de bestudering van eiwitfuncties mogelijk tijdens vroege ontwikkelingsgebeurtenissen, zoals axonale uitgroei, en latere gebeurtenissen, zoals synaptogenese en synaptische plasticiteit.

Eerst worden gliacellen geïsoleerd uit corticale hemisferen van pasgeboren muizenpups van één tot drie dagen oud en geplaatst in flessen. Nadat een confluentie van 70 tot 100% is bereikt, worden de gliacellen vervolgens overgeplaatst op glazen dekglasjes.

Vervolgens worden hippocampale of corticale neuronen geïsoleerd uit E 15.5 muizen en getransfecteerd via nucleofectie met plasmiden die coderen voor fluorescente fusie-eiwitten, zoals red fluorescent protein. De getransfecteerde neuronen worden daarna geplaatst in beeldvormingskamers voor kortetermijnstudies. Voor langetermijnculturen worden gliale cellen op glazen dekglasjes omgekeerd boven de hippocampale of corticale culturen om trofische ondersteuning te bieden; individuele neuronen kunnen vervolgens worden afgebeeld om de dynamische lokalisatie van fusie-eiwitten in de axonen of dendrieten van neuronen te tonen.

Hallo, ik ben Eric Dent, universitair docent anatomie aan de University of Wisconsin Madison. Vandaag zullen drie van mijn bachelorstudenten, Chris Wezelman, Jason Bwe en Derek Lombard, een procedure demonstreren voor het isoleren, uitplaten en onderhouden van culturen van corticale en hippocampale neuronen voor kort- en langetermijncultuur. Deze culturen kunnen worden gebruikt om de dynamiek van fluorescerende fusie-eiwitten te bestuderen gedurende de neuronale ontwikkeling, vanaf de initiële neurietuitgroei tot de ontwikkeling van axonen en dendrieten en synaptogenese.

Om de kamers voor beeldvorming voor te bereiden, worden embryonale hippocampale en corticale neuronen van muizen gebruikt. Begin met Petrischalen van 35 millimeter met gaten van 15 millimeter die in de bodem zijn geboord en waarvan alle bramen zijn verwijderd. Smelt een mengsel van paraffine en vaseline in een verhouding van drie op één in een conische buis door deze in een kokend waterbad te plaatsen.

Gebruik vervolgens een klein penseel om de onderkant van de schaal rond het gat te bestrijken. Zorg ervoor dat het mengsel van paraffine en vaseline tussen de kamers door wordt geroerd, omdat het kan scheiden. Plaats het dekglas over het gat.

Zodra alle schaaltjes zijn voorbereid, plaatst u deze in een oven op 80 graden Celsius totdat het paraffinemengsel is gesmolten. Dit zou ongeveer 10 minuten duren. Verplaats de schaaltjes vervolgens naar een vlak oppervlak en laat het paraffinemengsel ten minste één minuut stollen.

Keer de schalen om en plaats ze onder een zuigkast. Schakel het UV-licht 30 minuten in om zowel de binnenzijde van de deksels als de bodems van de kamers te steriliseren. Vervolg met de coating.

De kamerdekglasjes worden gedurende één uur behandeld met poly-D-lysinen. Spoel de gecoate dekglasjes vervolgens grondig drie tot vijf keer met steriel gefiltreerd gedeïoniseerd water om alle sporen van de buffer te verwijderen. Gebruik na de laatste spoelbeurt een vacuüm om de kamers te drogen. Deze kunnen onmiddellijk worden gebruikt of bewaard in een weefselkweekruimte voor later gebruik.

Gecoate kamers moeten binnen één week na bereiding worden gebruikt als er langetermijnculturen worden aangemaakt. Corticale gliale feederlagen moeten twee tot drie weken voor het begin van de corticale of hippocampale dissecties worden gestart. Plaats de hersenen van vier muizen van P1 tot P3 in een schaal met koud dissectiemedium en plaats deze onder de dissectiemicroscoop.

Verwijder de bulbi olfactorii, de twee cerebrale hemisferen en de meninges. Verplaats de hemisferen naar een nieuw schaaltje zonder medium. Hak de cortices met een schoon, steriel scheermesje zo fijn mogelijk.

Breng vervolgens met een plastic pipet het gehakt weefsel over naar een conische buis van 50 milliliter met 12 milliliters koud dissectiemedium. Voeg trypsine en DNase toe tot finale concentraties van respectievelijk 0,25% en 0,1%. Incubeer gedurende 10 minuten in een waterbad van 37 °C met tussentijds zwenken.

Verwijder na de incubatie de buis uit het waterbad en maak deze grondig schoon met 70% ethanol voordat u deze in de weefselkweekkap plaatst. Pipetteer het corticale weefsel herhaaldelijk op en neer.

Gebruik een pipet van 10 milliliter ongeveer 10 tot 15 keer of totdat de meeste klonten zijn verdwenen, plaats de buis vervolgens nog eens 10 minuten terug in het waterbad onder tussenpoos van zwenken. Reinig de buis opnieuw grondig met 70% ethanol en breng deze terug naar de weefselkweekkast.

Pipetteer het corticale weefsel op en neer. Voeg, zoals voorheen maar nu met een pipette van 5 ml, 15 ml warm glia-medium toe en centrifugeer 10 minuten bij 1000 RPM. Gooi het supernatant weg en resuspendeer de gepelletteerde cellen in 20 ml vers glia-medium.

Gebruik een hemocytometer om de cellen te tellen. Zaai vervolgens vijf tot 7,5 miljoen cellen in 15 milliliter gliaal medium per fles van 75 vierkante centimeter. Plaats de cellen in de incubator bij 37 °C en tik na één dag en elke twee tot drie opeenvolgende dagen in kweek de fles tegen het oppervlak van de zuurkast om eventuele losse cellen te onthechten.

Verwijder het medium samen met alle losgekomen cellen en vervang dit door 15 milliliters vers gliaal medium. Glia kunnen worden geoogst na één tot twee weken groei in de kolf, wanneer ze ongeveer 100% confluent zijn. Om individuele dekglasjes te prepareren die zijn gecoat met glia, begint u met het plaatsen van zes met salpeterzuur gereinigde en gesteriliseerde dekglasjes.

Plaats ronde dekglasjes van 25 millimeter in een schaal van 10 centimeter en breng met een klein penseel drie stippen van het mengsel van paraffin petroleum jelly in een drie-op-één verhouding aan op elk dekglasje in een driehoekig patroon. Plaats twee stippen op de randen van het dekglasje om het aan de schaal te verankeren.

Behandel open petrischalen 30 minuten lang met UV-licht. Coat de dekglasjes gedurende één uur met poly-D-lysine. Was ze vervolgens uitgebreid drie tot vijf keer met steriel gefiltreerd gedeïoniseerd water en laat ze drogen; haal de gliacellen uit de incubator.

Verwijder het medium en was met vijf milliliters voorverwarmde trypsine. Voeg drie milliliters trypsine toe aan de kolf en incubeer gedurende één minuut bij 37 °C. Zodra de cellen zijn losgekomen, voegt u vijf milliliters gliaal medium toe om de trypsinisatie te stoppen.

Verwijder de GL uit de kolf door 10 tot 15 keer op en neer te pipetteren. Draai het medium vervolgens in een conische buis van 15 milliliter in een centrifuge gedurende acht minuten bij 1000 RPM. Suspendeer de cellen na de centrifugatie in 10 milliliter glia-medium.

Planteer na het tellen van de cellen 5 × 10⁵ cellen in 12,5 milliliter gliale medium per schaal van 10 centimeter die de dekglasjes bevat. Vervang het medium elke twee tot drie dagen door vers, voorverwarm gliaal medium. Verwijder de dag vóór de neurondissectie het gliale medium en vervang dit door serumvrij medium.

Gebruik dit serumvrije medium voor gliale condities later. Bij het overstromen van corticale of hippocampale culturen wordt C toegevoegd tot een eindconcentratie van 5 µM. Om gliale proliferatie te voorkomen, worden de nucleofectiereagentia per transfectie toegevoegd zoals aangegeven in de instructies van de fabrikant; verwarm de oplossing vervolgens tot kamertemperatuur.

Plaats een schaaltje met muizenhersenen van E 15.5 in koud dissectiemedium. Verwijder met behulp van een dissectiemicroscoop en een gebogen wolfraamnaald beide neocortices. Verwijder vervolgens met micro-pincetten de hersenvliezen en plaats de cortices in een nieuw schaaltje met koud dissectiemedium.

De hippocampus en de cortex zijn zichtbaar langs de mediale zijde van de hersenhelft met kleine irisscharen. Verwijder voorzichtig de hippocampus. Verwijder vervolgens de resterende cortex.

Herhaal de dissectie op de hersenen van het gehele nest. Plaats de hippo Camp Cortices in afzonderlijke 1,5 milliliter microbuisjes gevuld met één milliliter koud dissectie-medium. Plaats de buisjes op ijs nadat alle cortices en hippo Campi zijn gedisseceerd.

Voeg 110 µL 2,5%trypsine toe aan de microcentrifugebuisjes met het weefsel en plaats de buisjes gedurende 20 minuten in een incubator op 37 °C. Verwijder met een P 1000 pipet zoveel mogelijk vloeistof uit de buis. Voeg vervolgens één mL platingmedium toe aan elk buisje en was het weefsel door de microcentrifugebuis voorzichtig om te keren.

Herhaal de wasstap twee keer. Voeg na de laatste wasbeurt één milliliter platingmedium toe. Gebruik een P 1000 pipet om de klonters 15 keer te tritureren. Draag vervolgens het supernatant en de cellen over naar een nieuwe conische buis van 15 milliliter met vier milliliter platingmedium, waarbij eventueel overgebleven klonters in de microcentrifugebuis achterblijven.

Centrifugeer de buis van 15 milliliter gedurende zeven minuten bij 350 RPM met de rem uitgeschakeld na centrifugatie, verwijder het supernatant en voeg 100 µL vooraf gemengde nucleaire affectie-oplossing op kamertemperatuur toe voor elke transfectie. Pipetteer vijf keer op en neer om te mengen en breng vervolgens 100 µL van het mengsel van de nucleaire affectie-oplossing en de cellen over naar elke nieuwe microcentrifugebuis met een passende hoeveelheid DNA; 1 tot 2 µg DNA per transfectie zal bij langetermijnculturen minder dan 10% van de neuronen in de cultuur labelen.

Hoewel vijf tot 10 µg DNA per transfectie zal leiden tot een hogere transfectie-efficiëntie voor de cultuur, voegt u de celsuspensie en de DNA-mix toe aan een electroporatie-cuvet. Plaats vervolgens de cuvet in de electroporator. Stel voor muis CNS-neuronen het nucleo effector-programma in op oh 0 0 5; voeg snel 500 µL van het voorverwarmde en geëquilibreerde platingmedium toe aan de cuvet en breng de celoplossing over naar een nieuwe 1,5 mL microcentrifugebuis.

Voeg voldoende plaatmedium toe om het volume van elke transfectie aan te vullen tot één milliliter. Plaat na het tellen van de cellen drie tot vijf keer 10³ cellen per vierkante centimeter voor jonge culturen, of vijf tot 10 keer 10³ cellen per vierkante centimeter voor langeterminculturen, gewoonlijk vijf keer 10⁵ of één keer 10⁶ cellen per transfectie om korteterminculturen voor te bereiden.

Een uur na het uitplaten worden de 35 millimeter cultuurplaten gevuld met twee milliliters opgewarmd, met koolstofdioxide geëquilibreerd, serumvrij medium. De beelduitsneden resulteren in een zeer laag serumgehalte van minder dan 0,5%. Kortstondige culturen hoeven niet te worden gekweekt met een gliale feederlaag en hoeven niet te worden gevoed. Voor de bereiding van langdurige culturen wordt één milliliter gliaal geconditioneerd medium toegevoegd aan het serumvrije medium.

Verwijder een GL-dekglaasje met drie stippen paraffinevaseline en plaats dit omgekeerd op het gat van 15 millimeter in de 35-schaal. Voeg vervolgens nog één milliliter medium toe om de langeterminculturen te voeden. Vervang elke twee tot drie dagen één derde van het serumvrije medium.

Na vijf tot zeven dagen in cultuur wordt cytosine arabinoside (Ara-C) toegevoegd tot een uiteindelijke concentratie van 5 µM om gliale proliferatie te voorkomen. De volgende gepaarde beelden van representatieve levende hippocampale neuronen tonen zowel een beeld met differentiële interferentiecontrast als een corresponderende fluorescentiemicrografie. Elk van deze cellen is getransfecteerd met EGFP, tubuline en DsRed2 in pA-vectoren.

Tijdens fase één zullen neuronen zich in eerste instantie hechten en gedurende ongeveer een dag plaatvormige lamellipodia en vingerachtige filipodia uitstoten rond de periferie van het cellichaam. Tijdens fase twee zullen de initiële uitstulpingen differentiëren in verschillende neurieten die uit het cellichaam ontspringen en gewoonlijk een lengte van ongeveer 30 tot 50 microns behouden. Tijdens fase drie begint, op stochastische wijze, één van de neurieten zich snel uit te strekken om het axon te worden.

De overige neurieten blijven kort en worden kleine uitlopers genoemd. De meeste hippocampale en corticale neuronen bereikten na twee tot drie dagen in cultuur stadium drie; tijdens stadium vier, dat gedurende de volgende week of twee plaatsvindt, worden kleine uitlopers dikker, langer en vertakken ze om dendrieten te worden, hier in het groen weergegeven. Ondertussen wordt het axon dunner terwijl het gedurende twee tot drie weken blijft groeien en vertakken.

In kweek differentiëren dendrieten zich door de vorming van dendritische stekels, kleine uitsteeksels langs de dendrieten. Neuronen in stadium vijf zullen variëren in vorm en grootte, maar de meeste zouden deze reeks ontwikkelingsfasen moeten doorlopen. Getransfecteerde neuronen lopen mogelijk niet door deze fasen heen als overexpressie van eiwitten de neuronale ontwikkeling verstoort.

Bovendien is het mogelijk dat neuronen niet door alle ontwikkelingsstadia gaan. Als de dekglasplaatjes niet correct worden gereinigd of als de polylysine niet goed hecht, kunnen glia ook uitgebreid prolifereren, vooral wanneer er geen C wordt gebruikt. Dit is een fasecontrastafbeelding van een twee weken oude cultuur waarin de glia de cultuur in de langetermijnculturen hebben overgroeid.

Het te vaak of onvoldoende frequent vervangen van het medium kan ook de levensvatbaarheid van de neuronen in gevaar brengen. Dit is een fasecontrastafbeelding van een cultuur waarin de meeste neuronen zijn gestorven en de overgebleven neuronen gekrompen cellichamen en gekraalde uitlopers vertonen. Ter vergelijking: dit is een fasecontrastafbeelding van gezonde hippocampale neuronen na twee weken in cultuur. Let op de grotere cellichamen en het ontbreken van kraalvorming in de uitlopers.

Bovendien zijn de dendritische uitlopers in dit stadium dikker geworden en is er een uitgebreid netwerk van axonale uitlopers aanwezig. Zodra de techniek onder de knie is, kunnen de embryonale, corticale en dissectie, transfectie en het uitplaten van een volledig nest foetussen in twee uur worden voltooid, mits dit correct wordt uitgevoerd. Tijdens deze procedure is het belangrijk om eraan te denken dat hippocampale en corticale neuronen zeer gevoelig zijn voor mechanische beschadiging.

Daarnaast is het belangrijk om oplossingen zo koud mogelijk te houden tijdens de isolatie van neuronen om de metabole activiteit laag te houden. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals live-cell imaging en fysiologische registratie van activiteit, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de manier waarop fluorescente fusie-eiwitten van belang zich verdelen over verschillende regio's van het neuron. Dit kan bijvoorbeeld gaan over of de eiwitlokalisatie geassocieerd is met veranderingen in de synaptische activiteit, of hoe de functies van deze eiwitten worden beïnvloed door verschillende farmacologische behandelingen.