Name: Nucleofection en Primaire Cultuur van de embryonale Mouse hippocampus en de corticale neuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-24T17:50:00.000+00:00
Duration: 15 min 40 s
Description: Leer nucleofectie en primaire cultuur van embryonale muizen hippocampus- en cortexneuronen. Deze methode maakt expressie van fluorescent gelabelde eiwitten mogelijk voor studies naar axonuitgroei, synaptogenese en dendritische ontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Alle procedures werden goedgekeurd door de Universiteit van Wisconsin Comite voor de Zorg en waren in overeenstemming met NIH richtlijnen. Wij danken dr. Katherine Kalil voor de gulle gebruik van haar Nucleofector apparaat. We danken ook de leden van de Dent lab voor commentaar op het protocol. Dit werk werd ondersteund door subsidies NIH R01-NS064014, Dana Foundation en Whitehall Stichting EWD Christopher Viesselmann, Jason Ballweg en Derek Lumbard droegen ook aan deze krant.

1. Voorbereiding van Dekglaasjes en Kamers <ol><li> De voorbereiding van schone coverslips en kamers is essentieel voor een gezonde culturen. Snelkoppelingen mag niet worden ingenomen op een van deze stappen. </li><li> Was de dekglaasjes (12mm of 22mm rond, Duits glas - Carolina Assistant Brand) overnachting in geconcentreerd salpeterzuur (HNO3) in een speciale glazen pot of beker. </li><li> Verwijder de dekglaasjes van salpeterzuur en was uitgebreid (5-7x) in gedeïoniseerd water. </li><li> Scheiden de dekglaasjes en droog in een laminaire stroming kap of bioveiligheid kast. Bij het droog, steriliseren ze met UV-licht gedurende 30 minuten. Plaats gesteriliseerd coverslips in een steriele Petrischalen voor opslag. Als plating neuronen op 12mm dekglaasjes direct plaatsen dekglaasjes in een steriele 35mm schotel en ga verder met deel 2. </li><li> Imaging kamers zijn gebouwd door het boren van een 15mm gat in de bodem van 35mm petrischalen (verwijder alle bramen) en het bevestigen van de gereinigde dekglaasjes met een 3:1 mengsel van paraffine en vaseline. </li><li> Smelt de paraffine / vaseline mengsel in een conische buis in een bad met kokend water. Gebruik een kleine kwast en vacht de onderkant van de schotel rond de 15mm gat. Zorg ervoor dat blijf roeren de paraffine / vaseline mengsel als het zal scheiden. Dit resulteert meestal in kamers, samen met een hogere concentratie van vaseline, die viskeus wanneer gerechten worden geplaatst in de incubator, wat resulteert in dekglaasje onthechting gelijmd. De overige paraffine / vaseline kan worden opgeslagen bij kamertemperatuur. </li><li> Zet de schaal ondersteboven op een vlakke lade en plaats het dekglaasje over het gat. Verhit in 80 ° C oven tot paraffine mengsel gesmolten is (~ 10 minuten). Verwijder de gerechten op een vlakke ondergrond en laat het mengsel paraffine in te stellen. </li><li> Draai de gerechten op en steriliseer zowel de binnenkant van de covers en de bodem van de kamers met UV-licht. </li><li> Coat coverslips of glazen regio's van de kamers met 1.0mg/mL Poly-d-lysine (30kDa) in boraat buffer (0,1 M natriumboraat, pH 8,5) gedurende een uur. Spoel 3-5 maal overvloedig met weefselkweek kwaliteit gedeïoniseerd water. Zorg ervoor dat alle sporen van boraatbuffer te verwijderen. Droog en onmiddellijk gebruiken of op te slaan kamers / dekglaasjes voor later gebruik. We gebruiken meestal gereinigd dekglaasjes binnen een maand van voorbereiding. </li></ol> 2. Voorbereiding van Neuronale Dissection en Cultuur Medium <ol><li> Bereid de dissectie medium (DM) door het toevoegen van de juiste hoeveelheden van 10x HBSS en 100x HEPES aan weefselkweek kwaliteit water. Bewaren bij 4 ° C. Blijf op ijs tijdens de dissectie. </li><li> De dag voor de dissectie de voorbereiding van de beplating medium (PM) en serum-vrij medium (SFM). PM bestaat uit Neurobasal Medium, B27 supplement, 2 mM glutamine, 0,3% glucose, 37,5 mM NaCl en 5% foetaal bovine serum (FBS). SFM bestaat uit Neurobasal Medium, B27 supplement, 2 mM glutamine, 0,3% glucose en 37,5 mM NaCl. </li><li> Maak alleen genoeg voor de dissectie en op te slaan in een weefselkweek incubator 's nachts met de dop op een kier, zodat de temperatuur en de CO 2-gehalte van het medium evenwicht houdt. We voegen extra glucose en verhoging van de osmolaliteit tot ongeveer 310mOsm met NaCl. We vinden de cultuur beter te doen op een meer fysiologische osmolaliteit (Neurobasal osmolaliteit is typisch 205-245mOsm). </li></ol> 3. Corticale gliale Feeder Layer Voorbereiding voor de lange termijn culturen <ol><li> Als lange termijn culturen te worden voorbereid, voert dit deel van het protocol twee tot drie weken voordat u verder gaat met de corticale of hippocampus dissecties. </li><li> Bereid gliale medium (GM) met MEM, 0,3% glucose, penicilline / streptomycine en 10% paard serum. </li><li> Euthanaseren P1-P3 muis pups door afkoeling op ijs gedurende 5 minuten. Verwijder elk pup uit het ijs en spuit met 70% ethanol. Snel onthoofden met een schaar. Verwijder de gehele hersenen om een ​​schotel met koud DM (stap 2.1). </li><li> Verwijder de twee hersenhelften en hersenvliezen. Accijnzen de neocortex en te verwijderen om een ​​nieuw gerecht bevat geen media. Bereid cortex van 4 hersenen totaal. </li><li> Gehakt van de cortex met een schone, steriele scheermesje zo fijn mogelijk en verwijder stukjes weefsel met een plastic pipet aan op een 50 ml conische buis met 12 ml koud DM. Voeg trypsine en DNase tot de uiteindelijke concentratie van 0,25% (1,5 ml) en 0,1% (1,5 ml), respectievelijk. Incubeer in een 37 ° C waterbad gedurende 10 minuten met intermitterende wervelende. </li><li> Haal de buis met de corticale tissue en reinig grondig met 70% ethanol alvorens in de weefselkweek kap. Pipet corticale weefsel op en neer met een 10 ml pipet ongeveer 10-15 keer, of tot de meeste brokken verdwijnen. </li><li> Zet de buis tot 37 ° C in een waterbad nog 10 minuten met intermitterende wervelende. </li><li> Grondig reinigen van de buis met 70% ethanol en terug te brengen naar de weefselkweek kap. Pipet de corticale weefsel op en neer met een 5 mL pipet circa 10-15 keer, of tot de stukken verdwijnen. </li><li> Voeg 15 ml warm GM en centrifugeer bij 200xg (1000 tpm) gedurende 10 minuten. </li><li> Supernatant Gooi, resuspendeer de gepelleteerde cellen in 20 ml vers GM en tellen met een hemocytometer. Plaat 5-7.5x10 6 cellen in 15 ml van GM per 75cm 2 kolf. </li><li> Na een dag en om de 2-3 de daaropvolgende dagen in cultuur, verjagen losse cellen door kloppen de kolf tegen je hand. Verwijder het medium samen met eventuele verdreven cellen en te vervangen door 15 ml vers GM. </li><li> Glia kan worden geoogst na 1-2 weken van de groei in de kolven, als ze ongeveer 70-100% confluent. Ter voorbereiding op de individuele coverslips bedekt met glia, plaats 6 salpeterzuur gereinigd en gesteriliseerd 25mm ronde dekglaasjes in een 10cm schotel, en plaats 3 punten van het 3:1 mengsel van paraffine / vaseline op elk dekglaasje in een driehoekig patroon met een kleine kwast . Behandel openen schotels met UV-licht gedurende 30 minuten. Coat de dekglaasjes met 0,1 mg / ml poly-D-lysine (30kDa) in boraatbuffer voor een uur, daarna uitgebreid wassen (3-5x) met steriele weefselkweek kwaliteit gedeïoniseerd water en laten drogen. </li><li> Verwijder de gliale-bevattende kolf van incubator, gooi het medium en spoel na met 5 ml van de voorverwarmde trypsine / EDTA-oplossing. Verwijder de trypsine / EDTA-oplossing uit de kolf en pipet 3 ml vers voorverwarmde trypsine / EDTA in de fles. Incubeer de kolf gedurende 1 minuut bij 37 ° C voor het toevoegen van 5 ml van GM om de behandeling met trypsine te stoppen. </li><li> Haal de glia uit kolf door herhaald pipetteren 10-15 keer, en vervolgens over de media om een ​​15 ml conische buis. Centrifugeer op 200xg (1000 tpm) gedurende 8 minuten. Verwijder de bovenstaande vloeistof en voeg 10 ml van GM, tellen cellen, en de plaat 5x10 5 cellen in 12,5 ml van GM per 10cm schotel met de dekglaasjes. </li><li> Exchange het medium met verse voorverwarmd GM om de 2-3 dagen. De dag voor de neuron dissectie, verwijder de GM en te vervangen door SFM (paragraaf 2.2). Gebruik deze gliale-conditioning SFM bij stap 4.12 bij overstromingen corticale of hippocampus culturen. </li></ol> 4. Corticale en / of de hippocampus Dissection en Elektroporatie <ol><li> Verwijder de juiste hoeveelheden nucleofection oplossingen (Lonza), combineren en opwarmen tot kamertemperatuur voordat u de dissectie. Sinds Nucleofection oplossing heeft een beperkte levensduur wanneer deze wordt gecombineerd, we alleen samen de benodigde bedrag voor elke bereiding (100 ul per transfectie). </li><li> Euthanaseren een zwangere muis op E15.5 met CO 2 (dag van de plug is E0.5) en verwijder de baarmoeder om een 10cm petrischaal. Verwijder de foetussen en onthoofden in koude DM (paragraaf 2.1). </li><li> Verwijder de hele hersenen in een apart schaaltje van koude DM en met een gebogen wolfraam naald, verwijder beide neocortices. Verwijder de hersenvliezen met microforceps en plaats cortex in nieuwe schotel van koude DM. Met een kleine iris of Wecker schaar, verwijder de cortex of de hippocampus en doe dit in een 1,5 ml Eppendorf buis gevuld met 1,0 ml koud DM. Houd deze buis op ijs. </li><li> Na het ontleden van alle cortices of hippocampus, voeg 110 pl van 2,5% trypsine om de Eppendorf buis met het weefsel en plaats buis in een 37 ° C incubator gedurende 20 minuten. </li><li> Verwijder het supernatant en wassen cortex of hippocampus met 1,0 ml PM (paragraaf 2.2) door voorzichtig het omkeren van de Eppendorf buis. Tweemaal herhalen de was en laat 1 mL van PM in de buis. </li><li> Vermaal de brokken 15 keer met een pipet P1000, en verwijder supernatant / cellen naar een nieuwe 15 ml conische buis met 4 ml van PM, zodat alle stukken die nog in Eppendorf buis. </li><li> Draai de 15 ml buis 20xg (350rpm) gedurende 7 minuten met de rem af. Verwijder het supernatant en voeg 100 ul van voorgemengde, op kamertemperatuur nucleofection oplossing (Lonza) voor elke transfectie. Vermaal vijf keer met een zachte op en neer beweging van de P1000 pipet. </li><li> Verwijder de 100 pi van de nucleofection oplossing / cel mengsel om elke nieuwe eppendorfbuisje en voeg de juiste hoeveelheid DNA. Voor de lange termijn culturen wij over het algemeen gebruik van 1-2μg van DNA per transfectie. Echter, dit alleen etiketten een klein &lt;10% aandeel van de neuronen in de cultuur. Wij gebruiken over het algemeen 5-10μg van DNA per transfectie of wilt een hogere transfectie-efficiëntie op korte termijn cultuur. Wij hebben gebruik gemaakt tot een totaal van 40μg van DNA bij transfectie met twee verschillende plasmiden. Plasmiden worden opgeslagen in TE-buffer bij 1μg / ul. </li><li> Voeg celsuspensie / DNA op de cuvet (Lonza) en electroporate de cellen in de Nucleofector (Lonza), met behulp van het programma O-005 (Mouse CNS neuronen). </li><li> Snel te werken, voeg 500 ul van voorverwarmde en in evenwicht uur tot de cuvette en verwijder oplossing / cellen om een ​​nieuwe 1,5 ml Eppendorf buis. Voeg genoeg PM om het volume van elke transfectie tot 1,0 ml te brengen. Tel de cellen met een hemocytometer en plaat op 3-5x10 3 cellen / cm 2 voor jonge culturen, of 5-10x10 3 cellen / cm 2 voor de lange termijn culturen. &lt;/ Li&gt; </li><li> Voor de korte termijn culturen, overstroming van de 35mm cultuur gerechten met 2,0 ml warm, CO 2-evenwicht SFM na een uur in de platen. Als u dekglaasjes, hebben we een half verwijderen van de PM en vervang deze door SFM, herhaal dan nog twee keer. Ofwel overstroming van de imaging kamers of het wassen van de dekglaasjes resulteert in een zeer lage serum-gehalte (&lt;0,5%). Op korte termijn culturen hoeven niet te worden gekweekt met een gliale feeder-laag en hoeven niet opnieuw te worden gevoed. </li><li> Voor de lange termijn culturen, verwijderen we een glia overdekte dekglaasje met drie punten van paraffine / vaseline en keer het over de 15mm gat in de 35mm schotel, een uur na de eerste plating. Twee ml van het geconditioneerde SFM van de gliale schotel wordt vervolgens toegevoegd aan de beeldvorming kamer. Te voeden op de lange termijn culturen, verwijderen we een derde van de SFM om de 2-3 dagen en te vervangen door frisse, voorverwarmd en CO 2-evenwicht SFM. </li></ol> 5. Representatieve resultaten: <img src="/files/ftp_upload/2373/2373fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Wonen hippocampale neuronen in opeenvolgende stadia van ontwikkeling. Gepaarde beelden van representatieve leven hippocampus neuronen worden weergegeven als zowel een differentieel interferentie contrast beeld en een bijbehorende fluorescerende micrograaf. Elk van deze cellen is getransfecteerd met EGFP-tubuline en DsRed2 in pCAX vectoren. De neuronen werden afgebeeld op de volgende dagen in vitro (DIV): Fase 1 (1DIV), Fase 2 (1DIV), Stage 3 (2DIV), Fase 4 (11DIV) en fase 5 (32DIV). Schaal bar is 20μm.

<ol><li>Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G. Chapter 13. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoslin%2C+K+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. Goslin, K., Banker, G. , The MIT Press. 339-370 (1998).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reorganization+and+movement+of+microtubules+in+axonal+growth+cones+and+developing+interstitial+branches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches.</a> J Neurosci. 19, 8894-8908 (1999).</li>
<li>Dent, E. W., Kalil, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+neuronal+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of neuronal cytoskeleton.</a> Methods Enzymol. 361, 390-407 (2003).</li>
<li>Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filopodia+are+required+for+cortical+neurite+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Filopodia are required for cortical neurite initiation.</a> Nat Cell Biol. 9, 1347-1359 (2007).</li>
<li>Hu, X., Viesselmann, C., Nam, S., Merriam, E., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+dynamic+microtubule+invasion+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent dynamic microtubule invasion of dendritic spines.</a> J Neurosci. 28, 13094-13105 (2008).</li>
<li>Lebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+Ena%2FVASP+proteins+for+filopodia+formation+in+neurons+and+in+function+downstream+of+netrin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Critical role of Ena/VASP proteins for filopodia formation in neurons and in function downstream of netrin-1.</a> Neuron. 42, 37-49 (2004).</li>
<li>Meberg, P. J., Miller, M. W. Chapter 7. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMeberg%2C+PJ+%22Neurons%3A+Methods+and+Applications+for+the+Cell+Biologist%22">Neurons: Methods and Applications for the Cell Biologist</a>. Hollenbeck, P. J., Bamburg, J. R. , Academic Press. Volume 71 112-129 (2003).</li>
<li>Osumi, N., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Methods. 24, 35-42 (2001).</li>
<li>Zeitelhofer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transfection+of+mammalian+neurons+via+nucleofection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection.</a> Nat Protoc. 2, 1692-1704 (2007).</li>
</ol>

Dit protocol voor het kweken van embryonale hippocampale en corticale neuronen muis werd ontwikkeld als een wijziging van de bank-protocol, dat rat neuronen 1,2 gebruikt. We hebben gebruik gemaakt van deze protocol voor het kweken van muis en de hamster neuronen ook 3,4,5,6,7. Dit protocol werkt even goed voor zowel de hippocampus en neocorticale neuronen en is vergelijkbaar met een protocol gepubliceerd door Meberg en Miller 8. Over het algemeen gebruiken we de hippocampus neuronen voor de lange termijn, cultuur, omdat ze zijn goed gekarakteriseerd en een meer gevestigde modelsysteem. Bovendien zijn ze waarschijnlijk een meer homogene populatie van neuronen dan neocortex bevatten. Echter, neocorticale neuronen gekweekt met behulp van dit protocol ook te overleven en zo ook te onderscheiden (ongepubliceerde gegevens). We routinematig gebruik van de hippocampus en neocorticale neuronen voor korte termijn cultuur. Dissectie van de neocortex resulteert ook in aanzienlijk meer neuronen (1.5x10 6 neuronen per paar van cortex) dan de hippocampus dissectie (2.5x10 5 neuronen per paar hippocampus), waardoor het een betere keuze van materiaal voor Western blotting, bijvoorbeeld. Zoals met elke primaire cultuur, is het essentieel om het minimaliseren van de tijd die nodig is vanaf de dood van het dier aan de beplating van de cellen. Over het algemeen neemt 10-20 dissecties te worden constant snel bij dissectie en plating. Ook bij het werken met de Lonza Nucleofector, is het essentieel om snel te werken tijdens de elektroporatie procedure, aangezien de levensvatbaarheid van de neuronen snel afneemt als ze links in de nucleofection buffer. Een groot deel van onze beeldvorming wordt uitgevoerd met een totaal inwendig reflectie fluorescentiemicroscopie (TIRFM). Dit type van microscopie is alleen geschikt voor imaging enkele honderden nanometers buiten de dekglaasje aan. Daarom is de gebieden van de neuronen die we regelmatig beeld, de axonale groei kegel en dendritische spines, moeten direct worden gehandeld op grond van het dekglaasje. Zo maken we gebruik van lage dichtheid culturen die gliale voeding nodig hebben voor de lange termijn cultuur. We hebben gebruik gemaakt een hogere dichtheid culturen (&gt; 2x10 4 cellen / cm 2), zonder dat gliale feeder lagen, voor de lange termijn culturen en vond dat ze heel goed overleven met weinig voeding. Echter, de dendritische spines van deze neuronen zijn vaak te ver weg van het substraat om de afbeelding in TIRFM, hoewel ze gemakkelijk kan worden gedetecteerd met wide-field microscopie of confocale microscopie. In de meeste van ons onderzoek hebben we transfecteren neuronen voor plating, en hebben belicht fluorescent-gelabelde eiwitten voor maximaal drie maanden in cultuur. Deze lange termijn expressie van fluorescent-gelabelde eiwitten geeft ons het vertrouwen dat door gebruik te lage concentraties van DNA (1-2μg) we niet overexpressie artefacten produceren in de neuronen. Toch kan deze procedure ook worden gebruikt om de overexpressie van eiwitten studie als grote hoeveelheden DNA worden gebruikt (10-20 microgram). De plasmiden die we gebruiken om neuronen transfecteren bevatten meestal EGFP of mCherry fusie-eiwitten, hoewel we ook het etiket van de neuronale cytoplasma met DsRed2 of EGFP alleen. Deze electroporatie techniek werkt goed samen met een aantal vectoren. Wij geven de voorkeur plasmiden die een β-actine-promotor met een CMV enhancer en β-globine bevatten poly-A staart (pCAGGs of pCAX plasmiden) 9, te wijten aan de relatief hoge niveaus van expressie, en het feit dat ze goed worden getolereerd door de neuronen in zowel de korte-en lange termijn cultuur. In het algemeen, eiwitten beginnen te uiten binnen ongeveer 4 uur in de platen en het niveau voldoende is voor beeldvorming te bereiken binnen 10-24 uur 10. We hebben met succes gebruikt CMV-promoter-driven plasmiden op korte termijn culturen, maar hebben ontdekt dat ze een hoog niveau van overexpressie oorzaak die doden neuronen in de lange termijn cultuur. Toch hebben we vastgesteld dat de gliale conditionering van lage dichtheid culturen helpt bij het overleven van neuronen die getransfecteerd zijn met CMV-promoter gedreven plasmiden, in vergelijking met een hogere dichtheid (niet-gliale FED) culturen.

* De meeste reagentia die wij opslaan bij -80 ° C kan worden opgeslagen bij -20 ° C ook. Ze op te slaan bij -80 ° C verlengt de houdbaarheid en resulteert in iets meer consistent culturen.

nucleofection en primaire cultuur van de embryonale mouse hippocampus en de corticale neuronen

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampus en corticale neuronen zijn uitgebreid gebruikt voor het centrale zenuwstelsel (CZS) neuronale polarisatie, axon / dendriet uitgroei, en synapsvorming en functie te bestuderen. Een voordeel van het kweken van deze neuronen is dat ze gemakkelijk polariseren, de vorming van onderscheidende axonen en dendrieten, op een twee dimensionale substraat bij zeer lage dichtheden. Deze eigenschap heeft hen zeer nuttig voor het bepalen van vele aspecten van de neuronale ontwikkeling. Bovendien, door het verstrekken van glia-conditioning voor deze neuronen ze zullen blijven ontwikkelen, de vorming van functionele synaptische verbindingen en overleven enkele maanden in de cultuur. In dit protocol schetsen we een techniek te ontleden, cultuur en transfecteren embryonale muis hippocampus en corticale neuronen. Transfectie wordt bereikt door electroporating DNA in de neuronen voor het uitplaten via nucleofection. Dit protocol heeft het voordeel te drukken fluorescent-gemerkte fusie-eiwitten vroeg in de ontwikkeling (~ 4-8uur na plating) om de dynamiek en de functie van eiwitten te bestuderen tijdens de polarisatie, axon uitgroei en vertakking. We hebben ook ontdekt dat dit ene transfectie voordat plating fluorescent-gelabelde fusie-eiwit expressie blijft op een niveau dat geschikt is voor beeldvorming gedurende de hele levensduur van het neuron (&gt; 2 maanden in cultuur). Zo, deze methodiek is handig voor het bestuderen van eiwitten lokalisatie en de functie heel CNS ontwikkeling met weinig of geen verstoring van de neuronale functie.

Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn om te ontleden, transfecteren via elektroporatie en cultuur muis hippocampus en corticale neuronen. Op korte termijn culturen kan worden gebruikt voor studies van axon uitgroei en begeleiding, terwijl de lange-termijn culturen kunnen worden gebruikt voor onderzoek naar synaptogenese en dendritische rug analyse.

Nucleofection en Primaire Cultuur van de embryonale Mouse hippocampus en de corticale neuronen

Hippocampale en corticale neuronen zijn uitgebreid gebruikt om neuronale polarisatie van het centraal zenuwstelsel (CZS), axonale/dendritische uitgroei en ... te bestuderen.

Hippocampale en corticale neuronen zijn uitgebreid gebruikt om neuronale polarisatie van het centraal zenuwstelsel, axon-dendrietgroei en synaptische vorming en functie te bestuderen; een voordeel van het kweken van deze neuronen is dat ze gemakkelijk polariseren en kenmerkende axonen en dendrieten vormen op een tweedimensionaal substraat bij zeer lage dichtheden. Deze video demonstreert een techniek om embryonale muis-hippocampale en corticale neuronen te dissekeren, te kweken en te transfecteren via nucleofectie, wat de expressie van fluorescentie-gelabelde fusie-eiwitten mogelijk maakt in een vroeg stadium van de ontwikkeling, ongeveer vier tot acht uur na het uitplaten; de expressie van de fluorescentie-gelabelde eiwitten wordt gedurende de gehele levensduur van het neuron behouden, gedurende meer dan twee maanden in cultuur. Dit maakt de bestudering van eiwitfuncties mogelijk tijdens vroege ontwikkelingsgebeurtenissen, zoals axonale uitgroei, en latere gebeurtenissen, zoals synaptogenese en synaptische plasticiteit.Eerst worden gliacellen geïsoleerd uit corticale hemisferen van pasgeboren muizenpups van één tot drie dagen oud en geplaatst in flessen. Nadat een confluentie van 70 tot 100% is bereikt, worden de gliacellen vervolgens overgeplaatst op glazen dekglasjes.Vervolgens worden hippocampale of corticale neuronen geïsoleerd uit E 15.5 muizen en getransfecteerd via nucleofectie met plasmiden die coderen voor fluorescente fusie-eiwitten, zoals red fluorescent protein. De getransfecteerde neuronen worden daarna geplaatst in beeldvormingskamers voor kortetermijnstudies. Voor langetermijnculturen worden gliale cellen op glazen dekglasjes omgekeerd boven de hippocampale of corticale culturen om trofische ondersteuning te bieden; individuele neuronen kunnen vervolgens worden afgebeeld om de dynamische lokalisatie van fusie-eiwitten in de axonen of dendrieten van neuronen te tonen.Hallo, ik ben Eric Dent, universitair docent anatomie aan de University of Wisconsin Madison. Vandaag zullen drie van mijn bachelorstudenten, Chris Wezelman, Jason Bwe en Derek Lombard, een procedure demonstreren voor het isoleren, uitplaten en onderhouden van culturen van corticale en hippocampale neuronen voor kort- en langetermijncultuur. Deze culturen kunnen worden gebruikt om de dynamiek van fluorescerende fusie-eiwitten te bestuderen gedurende de neuronale ontwikkeling, vanaf de initiële neurietuitgroei tot de ontwikkeling van axonen en dendrieten en synaptogenese.Om de kamers voor beeldvorming voor te bereiden, worden embryonale hippocampale en corticale neuronen van muizen gebruikt. Begin met Petrischalen van 35 millimeter met gaten van 15 millimeter die in de bodem zijn geboord en waarvan alle bramen zijn verwijderd. Smelt een mengsel van paraffine en vaseline in een verhouding van drie op één in een conische buis door deze in een kokend waterbad te plaatsen.Gebruik vervolgens een klein penseel om de onderkant van de schaal rond het gat te bestrijken. Zorg ervoor dat het mengsel van paraffine en vaseline tussen de kamers door wordt geroerd, omdat het kan scheiden. Plaats het dekglas over het gat.Zodra alle schaaltjes zijn voorbereid, plaatst u deze in een oven op 80 graden Celsius totdat het paraffinemengsel is gesmolten. Dit zou ongeveer 10 minuten duren. Verplaats de schaaltjes vervolgens naar een vlak oppervlak en laat het paraffinemengsel ten minste één minuut stollen.Keer de schalen om en plaats ze onder een zuigkast. Schakel het UV-licht 30 minuten in om zowel de binnenzijde van de deksels als de bodems van de kamers te steriliseren. Vervolg met de coating.De kamerdekglasjes worden gedurende één uur behandeld met poly-D-lysinen. Spoel de gecoate dekglasjes vervolgens grondig drie tot vijf keer met steriel gefiltreerd gedeïoniseerd water om alle sporen van de buffer te verwijderen. Gebruik na de laatste spoelbeurt een vacuüm om de kamers te drogen. Deze kunnen onmiddellijk worden gebruikt of bewaard in een weefselkweekruimte voor later gebruik.Gecoate kamers moeten binnen één week na bereiding worden gebruikt als er langetermijnculturen worden aangemaakt. Corticale gliale feederlagen moeten twee tot drie weken voor het begin van de corticale of hippocampale dissecties worden gestart. Plaats de hersenen van vier muizen van P1 tot P3 in een schaal met koud dissectiemedium en plaats deze onder de dissectiemicroscoop.Verwijder de bulbi olfactorii, de twee cerebrale hemisferen en de meninges. Verplaats de hemisferen naar een nieuw schaaltje zonder medium. Hak de cortices met een schoon, steriel scheermesje zo fijn mogelijk.Breng vervolgens met een plastic pipet het gehakt weefsel over naar een conische buis van 50 milliliter met 12 milliliters koud dissectiemedium. Voeg trypsine en DNase toe tot finale concentraties van respectievelijk 0,25% en 0,1%. Incubeer gedurende 10 minuten in een waterbad van 37 °C met tussentijds zwenken.Verwijder na de incubatie de buis uit het waterbad en maak deze grondig schoon met 70% ethanol voordat u deze in de weefselkweekkap plaatst. Pipetteer het corticale weefsel herhaaldelijk op en neer.Gebruik een pipet van 10 milliliter ongeveer 10 tot 15 keer of totdat de meeste klonten zijn verdwenen, plaats de buis vervolgens nog eens 10 minuten terug in het waterbad onder tussenpoos van zwenken. Reinig de buis opnieuw grondig met 70% ethanol en breng deze terug naar de weefselkweekkast.Pipetteer het corticale weefsel op en neer. Voeg, zoals voorheen maar nu met een pipette van 5 ml, 15 ml warm glia-medium toe en centrifugeer 10 minuten bij 1000 RPM. Gooi het supernatant weg en resuspendeer de gepelletteerde cellen in 20 ml vers glia-medium.Gebruik een hemocytometer om de cellen te tellen. Zaai vervolgens vijf tot 7,5 miljoen cellen in 15 milliliter gliaal medium per fles van 75 vierkante centimeter. Plaats de cellen in de incubator bij 37 °C en tik na één dag en elke twee tot drie opeenvolgende dagen in kweek de fles tegen het oppervlak van de zuurkast om eventuele losse cellen te onthechten.Verwijder het medium samen met alle losgekomen cellen en vervang dit door 15 milliliters vers gliaal medium. Glia kunnen worden geoogst na één tot twee weken groei in de kolf, wanneer ze ongeveer 100% confluent zijn. Om individuele dekglasjes te prepareren die zijn gecoat met glia, begint u met het plaatsen van zes met salpeterzuur gereinigde en gesteriliseerde dekglasjes.Plaats ronde dekglasjes van 25 millimeter in een schaal van 10 centimeter en breng met een klein penseel drie stippen van het mengsel van paraffin petroleum jelly in een drie-op-één verhouding aan op elk dekglasje in een driehoekig patroon. Plaats twee stippen op de randen van het dekglasje om het aan de schaal te verankeren.Behandel open petrischalen 30 minuten lang met UV-licht. Coat de dekglasjes gedurende één uur met poly-D-lysine. Was ze vervolgens uitgebreid drie tot vijf keer met steriel gefiltreerd gedeïoniseerd water en laat ze drogen; haal de gliacellen uit de incubator.Verwijder het medium en was met vijf milliliters voorverwarmde trypsine. Voeg drie milliliters trypsine toe aan de kolf en incubeer gedurende één minuut bij 37 °C. Zodra de cellen zijn losgekomen, voegt u vijf milliliters gliaal medium toe om de trypsinisatie te stoppen.Verwijder de GL uit de kolf door 10 tot 15 keer op en neer te pipetteren. Draai het medium vervolgens in een conische buis van 15 milliliter in een centrifuge gedurende acht minuten bij 1000 RPM. Suspendeer de cellen na de centrifugatie in 10 milliliter glia-medium.Planteer na het tellen van de cellen 5 × 10⁵ cellen in 12,5 milliliter gliale medium per schaal van 10 centimeter die de dekglasjes bevat. Vervang het medium elke twee tot drie dagen door vers, voorverwarm gliaal medium. Verwijder de dag vóór de neurondissectie het gliale medium en vervang dit door serumvrij medium.Gebruik dit serumvrije medium voor gliale condities later. Bij het overstromen van corticale of hippocampale culturen wordt C toegevoegd tot een eindconcentratie van 5 µM. Om gliale proliferatie te voorkomen, worden de nucleofectiereagentia per transfectie toegevoegd zoals aangegeven in de instructies van de fabrikant; verwarm de oplossing vervolgens tot kamertemperatuur.Plaats een schaaltje met muizenhersenen van E 15.5 in koud dissectiemedium. Verwijder met behulp van een dissectiemicroscoop en een gebogen wolfraamnaald beide neocortices. Verwijder vervolgens met micro-pincetten de hersenvliezen en plaats de cortices in een nieuw schaaltje met koud dissectiemedium.De hippocampus en de cortex zijn zichtbaar langs de mediale zijde van de hersenhelft met kleine irisscharen. Verwijder voorzichtig de hippocampus. Verwijder vervolgens de resterende cortex.Herhaal de dissectie op de hersenen van het gehele nest. Plaats de hippo Camp Cortices in afzonderlijke 1,5 milliliter microbuisjes gevuld met één milliliter koud dissectie-medium. Plaats de buisjes op ijs nadat alle cortices en hippo Campi zijn gedisseceerd.Voeg 110 µL 2,5%trypsine toe aan de microcentrifugebuisjes met het weefsel en plaats de buisjes gedurende 20 minuten in een incubator op 37 °C. Verwijder met een P 1000 pipet zoveel mogelijk vloeistof uit de buis. Voeg vervolgens één mL platingmedium toe aan elk buisje en was het weefsel door de microcentrifugebuis voorzichtig om te keren.Herhaal de wasstap twee keer. Voeg na de laatste wasbeurt één milliliter platingmedium toe. Gebruik een P 1000 pipet om de klonters 15 keer te tritureren. Draag vervolgens het supernatant en de cellen over naar een nieuwe conische buis van 15 milliliter met vier milliliter platingmedium, waarbij eventueel overgebleven klonters in de microcentrifugebuis achterblijven.Centrifugeer de buis van 15 milliliter gedurende zeven minuten bij 350 RPM met de rem uitgeschakeld na centrifugatie, verwijder het supernatant en voeg 100 µL vooraf gemengde nucleaire affectie-oplossing op kamertemperatuur toe voor elke transfectie. Pipetteer vijf keer op en neer om te mengen en breng vervolgens 100 µL van het mengsel van de nucleaire affectie-oplossing en de cellen over naar elke nieuwe microcentrifugebuis met een passende hoeveelheid DNA; 1 tot 2 µg DNA per transfectie zal bij langetermijnculturen minder dan 10% van de neuronen in de cultuur labelen.Hoewel vijf tot 10 µg DNA per transfectie zal leiden tot een hogere transfectie-efficiëntie voor de cultuur, voegt u de celsuspensie en de DNA-mix toe aan een electroporatie-cuvet. Plaats vervolgens de cuvet in de electroporator. Stel voor muis CNS-neuronen het nucleo effector-programma in op oh 0 0 5; voeg snel 500 µL van het voorverwarmde en geëquilibreerde platingmedium toe aan de cuvet en breng de celoplossing over naar een nieuwe 1,5 mL microcentrifugebuis.Voeg voldoende plaatmedium toe om het volume van elke transfectie aan te vullen tot één milliliter. Plaat na het tellen van de cellen drie tot vijf keer 10³ cellen per vierkante centimeter voor jonge culturen, of vijf tot 10 keer 10³ cellen per vierkante centimeter voor langeterminculturen, gewoonlijk vijf keer 10⁵ of één keer 10⁶ cellen per transfectie om korteterminculturen voor te bereiden.Een uur na het uitplaten worden de 35 millimeter cultuurplaten gevuld met twee milliliters opgewarmd, met koolstofdioxide geëquilibreerd, serumvrij medium. De beelduitsneden resulteren in een zeer laag serumgehalte van minder dan 0,5%. Kortstondige culturen hoeven niet te worden gekweekt met een gliale feederlaag en hoeven niet te worden gevoed. Voor de bereiding van langdurige culturen wordt één milliliter gliaal geconditioneerd medium toegevoegd aan het serumvrije medium.Verwijder een GL-dekglaasje met drie stippen paraffinevaseline en plaats dit omgekeerd op het gat van 15 millimeter in de 35-schaal. Voeg vervolgens nog één milliliter medium toe om de langeterminculturen te voeden. Vervang elke twee tot drie dagen één derde van het serumvrije medium.Na vijf tot zeven dagen in cultuur wordt cytosine arabinoside (Ara-C) toegevoegd tot een uiteindelijke concentratie van 5 µM om gliale proliferatie te voorkomen. De volgende gepaarde beelden van representatieve levende hippocampale neuronen tonen zowel een beeld met differentiële interferentiecontrast als een corresponderende fluorescentiemicrografie. Elk van deze cellen is getransfecteerd met EGFP, tubuline en DsRed2 in pA-vectoren.Tijdens fase één zullen neuronen zich in eerste instantie hechten en gedurende ongeveer een dag plaatvormige lamellipodia en vingerachtige filipodia uitstoten rond de periferie van het cellichaam. Tijdens fase twee zullen de initiële uitstulpingen differentiëren in verschillende neurieten die uit het cellichaam ontspringen en gewoonlijk een lengte van ongeveer 30 tot 50 microns behouden. Tijdens fase drie begint, op stochastische wijze, één van de neurieten zich snel uit te strekken om het axon te worden.De overige neurieten blijven kort en worden kleine uitlopers genoemd. De meeste hippocampale en corticale neuronen bereikten na twee tot drie dagen in cultuur stadium drie; tijdens stadium vier, dat gedurende de volgende week of twee plaatsvindt, worden kleine uitlopers dikker, langer en vertakken ze om dendrieten te worden, hier in het groen weergegeven. Ondertussen wordt het axon dunner terwijl het gedurende twee tot drie weken blijft groeien en vertakken.In kweek differentiëren dendrieten zich door de vorming van dendritische stekels, kleine uitsteeksels langs de dendrieten. Neuronen in stadium vijf zullen variëren in vorm en grootte, maar de meeste zouden deze reeks ontwikkelingsfasen moeten doorlopen. Getransfecteerde neuronen lopen mogelijk niet door deze fasen heen als overexpressie van eiwitten de neuronale ontwikkeling verstoort.Bovendien is het mogelijk dat neuronen niet door alle ontwikkelingsstadia gaan. Als de dekglasplaatjes niet correct worden gereinigd of als de polylysine niet goed hecht, kunnen glia ook uitgebreid prolifereren, vooral wanneer er geen C wordt gebruikt. Dit is een fasecontrastafbeelding van een twee weken oude cultuur waarin de glia de cultuur in de langetermijnculturen hebben overgroeid.Het te vaak of onvoldoende frequent vervangen van het medium kan ook de levensvatbaarheid van de neuronen in gevaar brengen. Dit is een fasecontrastafbeelding van een cultuur waarin de meeste neuronen zijn gestorven en de overgebleven neuronen gekrompen cellichamen en gekraalde uitlopers vertonen. Ter vergelijking: dit is een fasecontrastafbeelding van gezonde hippocampale neuronen na twee weken in cultuur. Let op de grotere cellichamen en het ontbreken van kraalvorming in de uitlopers.Bovendien zijn de dendritische uitlopers in dit stadium dikker geworden en is er een uitgebreid netwerk van axonale uitlopers aanwezig. Zodra de techniek onder de knie is, kunnen de embryonale, corticale en dissectie, transfectie en het uitplaten van een volledig nest foetussen in twee uur worden voltooid, mits dit correct wordt uitgevoerd. Tijdens deze procedure is het belangrijk om eraan te denken dat hippocampale en corticale neuronen zeer gevoelig zijn voor mechanische beschadiging.Daarnaast is het belangrijk om oplossingen zo koud mogelijk te houden tijdens de isolatie van neuronen om de metabole activiteit laag te houden. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals live-cell imaging en fysiologische registratie van activiteit, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de manier waarop fluorescente fusie-eiwitten van belang zich verdelen over verschillende regio's van het neuron. Dit kan bijvoorbeeld gaan over of de eiwitlokalisatie geassocieerd is met veranderingen in de synaptische activiteit, of hoe de functies van deze eiwitten worden beïnvloed door verschillende farmacologische behandelingen.

nucleofection-primary-culture-embryonic-mouse-hippocampal-cortical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Live-cell imaging is met name van nut bij het bestuderen van de dynamiek van organel mensenhandel. Hier beschrijven we een protocol voor live beeldvorming van dense-core blaasjes in gekweekte neuronen met behulp van wide-field fluorescentie microscopie. Dit protocol is flexibel en kan worden aangepast aan image andere organellen, zoals mitochondriën, endosomen, en peroxisomen.

Live-Imaging van dicht-core Blaasjes in het jeugdwerk Gekweekte hippocampale neuronen

Wij bieden een protocol voor de cultuur van sterk gezuiverd hippocampale neuronen van prenatale muis hersenen zonder het gebruik van een feeder-gliale cellaag.

Isolatie en Cultuur van hippocampale neuronen van Prenatal Muizen

We beschrijven een snelle methode voor het isoleren en cultuur hippocampus en corticale neuronen van knaagdieren embryo's. Dit protocol stelt ons in staat uit te voeren experimenten waarbij bijna zuivere neuronale culturen zijn vereist.

Isolatie en Cultuur van Rat Embryonale neurale cellen: een Quick-protocol

Tagging door de extracellulaire domeinen van membraanreceptoren met superecliptic pHluorin, en imaging deze fusie-receptoren in gekweekte muis neuronen, kunnen we direct visualiseren individuele vesiculaire inbrengen gebeurtenissen van de receptoren aan het plasmamembraan. Deze techniek zal instrumenteel ophelderen van de moleculaire mechanismen voor insertie receptor naar de plasmamembraan.

Imaging pHluorin-tagged Receptor invoegen in op het plasmamembraan in primaire gekweekte muis neuronen

The video demonstrates a method for culturing neurons from murine hippocampi. Initially, the hippocampi undergo enzymatic digestion to break down the extracellular tissue matrix. Subsequently, the digested tissue is mechanically disrupted to isolate individual neurons. Finally, these neurons are cultured on glial feeder cells.

A Technique to Culture Mouse Hippocampal Neurons

We beschrijven procedures voor etikettering en genotypering pasgeboren muizen en het genereren van primaire neuronale kweken van hen. De genotypering is snel, efficiënt en betrouwbaar, en maakt geautomatiseerde nucleïnezuur extractie. Dit is vooral handig neonataal dodelijke muizen en culturen die voorafgaande afronding genotyperen vereisen.

Snelle Genotypering van dieren Gevolgd door Vaststelling Primaire culturen van neuronen in de hersenen

Dit artikel beschrijft het protocol voor het kweken van lage dichtheid primaire hippocampale neuronen groeien op dekglaasjes omgedraaid naar een gliale monolaag. Het neuron en gliale lagen worden gescheiden door paraffinewas kralen. De neuronen gekweekt volgens deze methode geschikt voor hoge-resolutie optische beeldvorming en functionele assays.

Low-Density primaire hippocampus Neuron Cultuur

Het uitvoeren van in vitro experimenten om zo goed mogelijk te reflecteren in vivo omstandigheden is geen gemakkelijke taak. Het gebruik van primaire celculturen is een belangrijke stap naar begrip van celbiologie in een heel organisme. Het meegeleverde protocol schetst hoe succesvol groeien en cultuur embryonale muis cerebellaire neuronen.

Primaire cultuur van neuronen geïsoleerd van embryonale muis cerebellum

Hier beschreven we een protocol om de assemblage en structuur van de axon initiële segmenten (AIS) van hippocampale neuronen die geen vooraf geassembleerde AIS missen vanwege de afwezigheid van een gigantische ankyrine-G kwantitatief te bestuderen.

Gebruik van primaire gekweekte hippocampale neuronen om de assemblage van axon-initiële segmenten te bestuderen

Een kant-en-klare bevroren voorraad neuronen is een krachtig hulpmiddel voor het evalueren van synaptische functies. Hier introduceren we een eenvoudige primaire cultuur met lage dichtheid uit bevroren voorraad met behulp van een 96-well plaat.

Eenvoudige en reproduceerbare primaire cultuur met lage dichtheid met behulp van bevroren voorraad embryonale hippocampusneuronen

Dit protocol beschrijft een microglia-neuronale co-cultuur die is opgezet uit primaire neuronale cellen geïsoleerd uit muizenembryo's op embryonale dagen 15-16 en primaire microglia gegenereerd uit de hersenen van neonatale muizen op postnatale dagen 1-2.

Genereren en co-cultureren van primaire microglia en corticale neuronen van muizen

Leer nucleofectie en primaire cultuur van embryonale muizen hippocampus- en cortexneuronen. Deze methode maakt expressie van fluorescent gelabelde eiwitten mogelijk voor studies naar axonuitgroei, synaptogenese en dendritische ontwikkeling.

Nucleofection en Primaire Cultuur van de embryonale Mouse hippocampus en de corticale neuronen

Meer video's verkennen