Name: Microdissectie van Black Widow Spider Silk-producerende klieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T23:59:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Leer microdissectie van zijdeproducerende klieren bij zwarte weduwespinnen voor moleculair en biochemisch onderzoek. Deze methode isoleert zeven klieren voor analyse van zijde-eiwitten en mRNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een NSF RUI Grant MCB-0950372 recht moleculaire karakterisering van Black Widow Spider Silks.

1. Verlamming van de spin en het isolement van de buik <ol><li> Overdracht van de spin van een glazen pot in een kartonnen doos bekleed met kunststof (Figuur 1A). We meestal verzamelen spinnen uit houtstapels, garages of struiken en het huis ze in het lab in glazen potten. Omdat de spin niet kan beklimmen de kunststof bekleding, biedt een efficiënte methode om de spin transfer van een glazen pot of koffie kan in een kleiner flesje voor verlamming doeleinden. Terwijl de behandeling van de spin op dit punt, moet je het dragen van twee paar latex handschoenen of tuinhandschoenen voor veiligheidsdoeleinden. </li><li> Terwijl de spin is in de doos bekleed met plastic, aanpak van de spin van zijn achterkant en laat de spin glijden in de plastic flacon cultuur. Na de spin komt in de flacon, onmiddellijk plaats de plug over de top (figuur 1B). Wij raden u aan een flesje, dat is ongeveer 101,6 mm x 31,75 mm (L x D). Dit minimaliseert de hoeveelheid koolstofdioxide gas nodig is voor de verlamming stap. </li><li> Verdoven de spin door de invoering van koolstofdioxide gas op 5-10 pond per vierkante inch voor 10 min (figuur 1C). Deze hoeveelheid gas zal alleen kloppen de spin uit voor ongeveer 5 minuten, dus na verdoving dient u onmiddellijk verder met de stappen 1,4-1,5. </li><li> Plaats de verdoofde spin in een kleine dissectie schotel en een tang om de spin dorsale zijde naar boven (rood zandloper naar beneden gericht) positie. </li><li> Clip hoogte van de taille (smalle steel het aansluiten van de kopborststuk en de buik) om de buik los van de rest van de spin (figuur 1D). Bewaar de cephalothorax in de vriezer 's nachts in een petrischaal en gooi na bevroren de volgende dag. Wees voorzichtig bij het verplaatsen van de cephalothorax als de tanden van de spin zijn aanwezig op dit segment. </li><li> Bevestig de buik om de Sylgard materiaal in de kleine dissectie schotel met een enkele insect pin. Steek het insect pen door het gat gemaakt van clipping hoogte van de taille (figuur 1E). Dit kan gemakkelijk worden geïdentificeerd als de plaats waar de vloeistof die uit het knippen van de hoogte van de taille. Zorg ervoor dat de spindop (tegenover het einde van de hoogte van de taille) gericht is in de richting van de onderkant (het dichtst bij je). </li></ol> 2. Verwijdering van het exoskelet <ol><li> Maak de eerste incisie door het exoskelet met behulp van een paar microscissors, te beginnen bij de opening van het steeltje clipping. Snijd zijwaarts tot de dorsale zijde is bereikt aan beide zijden (Figuur 1F). Met behulp van een pincet, schil de rug van de voorste exoskeleton segment en voegt u een tweede pin op deze locatie. Na het inbrengen van de tweede pin, draait u de lade ontleden caudaal (90 ° hoek) van de initiële laterale snijdt en verder te snijden totdat de spintepels zijn bereikt (figuur 1G). Deze incisie wordt loodrecht of verticaal worden de eerste laterale snijden. Niet snijden door de spintepels als de verticale incisie wordt gemaakt (posterior ten opzichte van de zandloper en het heeft een ronde uiterlijk). Als de tweede pin te voegen zal resulteren in de buik draaien wanneer de verticale incisies worden uitgevoerd. </li><li> Dompel de buik in ontleden bufferoplossing (0.1 M natriumchloride, 0,015 M natriumcitraat, 0,1% Diethyl Pyrocarbonate). </li><li> Schil de resterende exoskelet terug vanaf het beginstadium, laterale incisie. Wanneer dit is voltooid, moet het vetweefsel duidelijk zichtbaar zijn (Figuur 1H). </li></ol> 3. Isolatie van de zijde-producerende klieren <ol><li> Met behulp van een tang beginnen plagen weg de vetlaag (Figuur 1H). Het vet heeft een witachtig tot geelachtig uiterlijk. Ga verder tot het grootste deel van het vet wordt verwijderd en de zijde klieren zijn duidelijk zichtbaar. De tubuliform klier bestaat uit drie paar zeer lange, cilindrische buizen die zijn er in overvloed in de buikholte. De belangrijkste ampullate, die is gevonden in paren, is een grote, halvemaanvormige ampulla met een lange ingewikkelde distaal staart en een proximale kanaal dat de dalingen in de breedte bij het naderen van de spin spintepels. De minor ampullate is zeer vergelijkbaar in morfologie op de grote ampullate, maar het is beduidend kleiner. De flagelliform klier, zich ook voor in paren, is rond en multilobular met een kleine cilindrische zig-zag kanaal die naar beneden uitstrekt in de richting van de spintepels. De totale klier (te vinden in paren) is een zeer grote, multilobular klier die een zeer grote uitscheidingsorganen kanaal die grote, onregelmatige lobben heeft op heeft. De aciniform klieren komen in grote aantallen en lijken op korte, kleine vingervormige uitsteeksels. De peervormig klier is de kleinste klier in de buik en heeft vele verdicht, cilindrische buizen die lijken op een ventilator met veel kleine uitscheidingsorganen buizen die naar beneden uit te breiden tot de spintepels. </li><li> We raden aan het verwijderen van de klieren in de volgende volgorde: tubuliform, grote ampullate, flagelliform, kleine ampullate, aggregaat, aciniform, en vervolgens de peervormig (Figuur 2A-B). </li><li> Beginnend met de tubuliform, plagen deze klieren af ​​van de rest van ee klieren - ze moeten zitten op de top van de andere klieren (Figuur 2A). Er zijn drie paren van tubuliform klieren in een spin. Laat ze drijven vrij, maar gehecht aan hun spintepels blijven door hun kabelgoten. </li><li> Vervolgens plagen weg de belangrijkste ampullate klieren. Er zijn twee belangrijke ampullate klieren aanwezig zijn in een spin. Tijdens de verhuizing procedure, zorg ervoor dat de leidingen blijft vastzitten aan het klieren (Figuur 2A). </li><li> Ga verder naar de rest van de klieren plagen uit de buurt van elkaar, zorgvuldig werken om te voorkomen dat doorprikken een van de klieren, vooral de aggregaat en flagelliform klieren. Elke klier moet vrij zwevende helemaal aan haar punt van uitgang in het exoskelet van de spintepels. Deze klieren worden ook gevonden in paren. Verwijder elke klier door knijpen de buis met een tang en zorgvuldig te trekken tot het breekt uit de buurt van de uitgang. De belangrijkste ampullate, flagelliform, kleine ampullate, en geaggregeerde klieren zijn te vinden in paren. De aciniform en peervormig klieren komen in veel meer paren. </li><li> Verwijder elke klier door knijpen de buis met een tang en zorgvuldig te trekken tot het breekt uit de buurt van de uitgang door de spindop. We meestal slaan de klieren nat, maar wij niet toe te voegen extra buffer. </li><li> Omdat de klieren zijn verwijderd, plaats ze in steriele gelabelde 1,5 ml microcentrifuge buizen. Individuele klieren worden weergegeven in Figuur 3A-G. Houd deze klieren op ijs en dan flitsen ze invriezen in vloeibare stikstof. Na de flits bevriezen in vloeibare stikstof, plaats ze bij -80 ° C voor opslag. </li></ol> 4. Representatieve resultaten Bij het verwijderen van de verschillende klieren, moet uiterste zorg worden genomen tijdens het hanteren van de flagelliform en aggregeren klieren, omdat deze twee structuren kunnen eenvoudig worden doorboord en beschadigde met de tang. Verder is het vermeldenswaard dat morfologisch de flagelliform en aggregeren klieren erg lijken voorafgaand aan hun verwijdering en ze zijn vaak met elkaar verweven. Om te voorkomen dat kruisbesmetting van deze weefsels na verwijdering, moet de dissector zorgvuldig te plagen deze structuren uit elkaar. Daarnaast, op de eerste blootstelling van de zijde-producerende klieren, zal de aciniform en peervormig klieren het meest moeilijk om direct te visualiseren door hun kleinere omvang en de anatomische locatie. Vaak is er de aanwezigheid van vele eieren. Bovendien, extra zorg moet worden genomen bij het verwijderen van de klier peervormig, omdat dit weefsel is zeer kleverig en zal vaak voldoen aan uw tang. Wanneer deze procedure correct is uitgevoerd, is het mogelijk om alle zeven zijde-producerende klieren te verkrijgen van een spin in een sterk gezuiverd manier. Normaal gesproken kan men herstellen microgram totale hoeveelheid RNA en eiwit uit een enkele spin dissectie. Een voorbeeld van het gebruik van het totale RNA voor qPCR om de mRNA niveaus van een tubuliform beperkte fibroin gen, TuSp1 te onderzoeken, wordt weergegeven (figuur 4). Vertegenwoordiger van experimenten die betrekking eiwit lysaten verzameld uit de klieren bijvoorbeeld in-oplossing tryptische spijsvertering, gevolgd door MS-analyse (kan ook worden gebruikt voor MS / MS-analyse) of een aminozuursamenstelling analyse wordt getoond (Figuur 5-6, respectievelijk). <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig1a.jpg" alt="Figuur 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1a"><img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig1e.jpg" alt="Figuur 1e" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1e"> Figuur 1. Handling, verlamming, en verwijdering van het exoskelet uit de buik van een vrouwelijke zwarte weduwe spin. A) Overdracht van de spin in een kartonnen doos bekleed met plastic om te vergemakkelijken het verplaatsen van de spin in een kleiner plastic flacon. B) Spider geplaatst in een plastic flacon met stekker. C) verlamming van de spin met kooldioxide gas. D) Scheiding van het kopborststuk van de buik met behulp van microscissors. E) Immobilisatie van de buik in het ontleden lade met behulp van insecten pinnen. F) Bekijk na een laterale incisie gemaakt met de schaar en een gedeelte van het exoskelet is terug gepeld met een pincet. G) Incisies loodrecht in de oorspronkelijke laterale snijden. H) Afschaffing van het exoskelet en de blootstelling van de vetlaag. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Visualisatie van de zeven verschillende zijde-producerende klieren, terwijl intact in de buik van de spin en omliggende weefsels. A) Beelden van de tubuliform, grote ampullate, flagelliform, aggregaat, kleine ampullate weefsels bij 12X vergroting. B) Afbeelding van de aciniform en peervormig klieren bij 12X vergroting. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig3a.jpg" alt="Figuur 3a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3a"><img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig3e.jpg" alt="Figuur 3e" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3e"> Figuur 3. Foto's van de zeven zijde-producerende klieren na hun verwijdering uit de buik. Alle beelden werden opgenomen met een vergroting van 20x, met uitzondering van de aciniform en peervormig klieren, die werden gedaan op 40X. A) belangrijkeampullate klier, B), grote en kleine ampullate (rechts) voor grootte vergelijking; C) tubuliform; D) flagelliform; E) aggregaat; F) aciniform; G) peervormig. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Vertegenwoordiger resultaten van de expressie patroon van de zijde gen, TuSp1, na inventarisatie van de TuSp1 mRNA niveaus in de verschillende zijde-producerende klieren (exclusief de peervormig klier) met behulp van kwantitatieve real-time PCR (qPCR) na isolatie van totaal RNA van de klieren. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig5.jpg" alt="Figuur 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5. Voorbeeld van MS analyse van eiwitextracten verkregen uit de peervormig klier volgende in-oplossing tryptische spijsvertering. Let op: x2 staat voor 2-voudige vergroting van het spectrum intensiteit. Spectrum peptide ion massa's die overeenkomen met de regio's van de PySp1 fibroin worden weergegeven met het symbool #. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig6.jpg" alt="Figuur 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 6"> Figuur 6. Typisch resultaat van de aminozuursamenstelling profiel van de eiwitten uit de tubuliform klier. Let op: ASX = Asp en Asn; GLX = Glu en Gin. Blauwe kleur geeft aminozuren met polaire zijketen groepen dat de rode kleur staat voor aminozuurresten met niet-polaire zijketen groepen.

<ol><li>Vollrath, F., Knight, D. P. Int. J. Biol. Macromol. 24, 243-243 (1999).</li>
<li>Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S. J. Exp. Biol. 202, 3295-3295 (1999).</li>
<li>Gosline, J. M., DeMont, M. E., Denny, M. W. Endeavour. 10, 31-31 (1986).</li>
<li>Hinman, M. B., Jones, J. A., Lewis, R. V. Trends Biotechnol. 18 (9), 374-374 (2000).</li>
<li>Lewis, R. V., Xu, M. Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7120-7120 (1990).</li>
<li>Colgin, M. A., Lewis, R. V. Protein Sci. 7 (3), 667-667 (1998).</li>
<li>Tian, M., Lewis, R. V. Appl. Phys. A-Mater. 82, 265-265 (2006).</li>
<li>Hu, X., Lawrence, B., Kohler, K. Biochemistry. 44 (30), 10020-10020 (2005).</li>
<li>Vasanthavada, K., Hu, X., Falick, A. M. J Biol Chem. 282 (48), 35088-35088 (2007).</li>
<li>Hayashi, C. Y., Blackledge, T. A., Lewis, R. V. Mol. Biol. Evol.. 21 (10), 1950-1950 (2004).</li>
<li>Blasingame, E., Tuton-Blasingame, T., Larkin, L. J Biol Chem. 284 (42), 29097-29097 (2009).</li>
</ol>

Onze methodologie voor de microdissectie van de zijde-producerende klieren van de zwarte weduwe spin biedt een effectief middel om zeer zuivere zijde-producerende klieren te verkrijgen. Dissecties kan worden voltooid in 1,5 tot 3 uur, waardoor een complete set van de zeven verschillende zijde-producerende klieren van cobweavers. Het verkrijgen van zeer zuivere zijde-klier samples maakt onderzoekers de mogelijkheid om een ​​breed scala van biochemische studies, waaronder de identificatie van nieuwe zijde of chaperonne-ei...

<table><tbody><tr><td>Natriumchloride</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>SX0420-1</td><td>0.1 M in water</td></tr><tr><td>Diethylpyrocarbonaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-5758 - 5 ml</td><td>0.1% v/v</td></tr><tr><td>Natriumcitraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804 - 1 kg</td><td>0.015 M in water</td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica MZ16</td><td></td></tr><tr><td>Digitale microscoopcamera</td><td>Leica Microsystems</td><td>DFC320</td><td>Software - Leica Application Suite v2.8.1</td></tr><tr><td>Vannas-scharen</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500260</td><td></td></tr><tr><td>Rvs-pincetten</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>501764</td><td>Mini Dumont #M5S</td></tr><tr><td>Insectenspelden</td><td>Indigo Instruments</td><td>33414-2</td><td>Insectenspelden #2</td></tr><tr><td>Kleine of grote dissectieschalen</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>DD-50-S of DD-90-S</td><td>52 mm diameter x 18 mm H (Sylgard-diepte ~6mm) of 93 mm x 22 mm</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; kweekbuisjes</td><td>Carolina Biological</td><td>FR-17-3076</td><td>Afmeting is 31.75 mm diameter x 101.6 mm</td></tr></tbody></table>

microdissectie van black widow spider silk-producerende klieren

Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands

Moderne spinnen draaien high-performance zijde vezels met een breed scala aan biologische functies, met inbegrip van voortbeweging, prooi te vangen en de bescherming van de ontwikkeling van nakomelingen 1,2. Spinnen deze taken uitvoeren door het draaien van een aantal verschillende soorten vezels die diverse mechanische eigenschappen hebben. Een dergelijke specialisatie van vezeltypen heeft plaatsgevonden door de evolutie van de verschillende zijde-producerende klieren, die fungeren als kleine biofactories. Deze biofactories fabriceren en op te slaan grote hoeveelheden van de zijde eiwitten voor vezelproductie. Door middel van een complexe reeks van biochemische gebeurtenissen, worden deze zijde eiwitten omgezet van een vloeistof in een vaste stof bij de extrusie. Mechanische studies hebben aangetoond dat de spin zijde zijn sterker dan hoogwaardig staal 3. Analyses van de relatie tussen de structuur en functie van spin zijden draden te begrijpen is gebleken dat spindraad bestaat grotendeels uit eiwitten of fibroins, dat blok herhaalt hebben binnen hun eiwitsequenties 4. Gemeenschappelijke moleculaire handtekeningen die bijdragen aan de ongelooflijke treksterkte en uitbreidbaarheid van spider zijde worden ontrafeld door de analyses van vertaalde zijde cDNA&#39;s. Gezien de buitengewone eigenschappen van het materiaal van de spin zijde, zijn onderzoekslaboratoria over de hele wereld racen te begrijpen en de draaiende proces na te bootsen om synthetische zijde vezels voor commerciële, militaire en industriële toepassingen. Een van de belangrijkste uitdagingen voor spinning kunstmatige spindraad in het onderzoek lab gaat om een ​​volledig inzicht in de biochemische processen die optreden tijdens de extrusie van de vezels van de zijde-producerende klieren. Hier presenteren we een methode voor de isolatie van de zeven verschillende zijde-producerende klieren van de cobweaving zwarte weduwe spin, die de grote en kleine ampullate klieren bevat [produceert dragline en steigers zijde] 5,6, tubuliform [synthetiseert ei geval zijde] 7 , 8, flagelliform [onbekende functie in cob-wevers], aggregaat [maakt lijm zijde], aciniform [synthetiseert prooi inpakken en ei bij discussies] 9 en peervormig [produceert attachment schijf zijde] 10. Deze aanpak is gebaseerd op verlamming van de spin met koolzuurgas, na afscheiding van het kopborststuk van de buik, en microdissectie van de buik aan de zijde-producerende klieren te verkrijgen. Na de scheiding van de verschillende zijde-producerende klieren, kunnen deze weefsels worden gebruikt om verschillende macromoleculen voor verschillende biochemische analyses, met inbegrip van kwantitatieve real-time PCR, Noord-en West-blotting, massaspectrometrie (MS of MS / MS) analyses te identificeren op te halen nieuwe zijde eiwitsequenties, zoek naar eiwitten die deelnemen aan de zijde montage pad, of gebruik de intacte weefsel voor celkweek of histologische experimenten.

Hier beschrijven we een efficiënte strategie om de zijde-producerende klieren te verwijderen uit de buik van de vrouwelijke zwarte weduwe spinnen. Deze procedure maakt het mogelijk een snelle isolatie van de zeven verschillende zijde-producerende klieren in een sterk gezuiverd, mode, een belangrijk proces voor de onderzoekers bestuderen spinnenzijde productie en assemblage vezels.

Microdissectie van Black Widow Spider Silk-producerende klieren

Moderne spinnen spinnen hoogwaardige zijdevezels met een breed scala aan biologische functies, waaronder voortbeweging, het vangen van prooien en de bescherming van ...

Het algemene doel van deze procedure is om de zeven verschillende zijdeproducerende klieren uit het abdomen van de spin te isoleren en deze weefsels te gebruiken voor moleculaire en biochemische studies. Dit wordt bereikt door de spin eerst te anesthetiseren. De tweede stap van de procedure is het scheiden van het cephalon, het thorax en het abdomen, waarna het abdomen met insectenspeldjes in een kleine dissectieschaal wordt vastgezet.De derde stap van de procedure is het maken van incisies in het exoskelet om de zijdeproducerende klieren bloot te leggen. De laatste stap van de procedure is het verwijderen van de verschillende zijdeproducerende klieren. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die aantonen dat de verschillende zijdeproducerende klieren verschillende zijde-mRNA's of -eiwitten tot expressie brengen via moleculaire en biochemische methoden, zoals respectievelijk kwantitatieve real-time PCR of massaspectrometrie.Deze methode biedt belangrijke inzichten voor het biologisch onderzoek naar spinnen door eiwitten te onthullen die worden opgeslagen in de zijdeproducerende klieren. Deze eiwitten hebben toepassingen die van invloed zijn op het leger en de geneeskunde, evenals vele commerciële en industriële toepassingen. Het idee om dit specifieke onderzoek uit te voeren ontstond toen we meer wilden leren over de eiwitten die in de zijdeproducerende klieren worden opgeslagen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat vrouwelijke zwarte weduwen zeer grote abdomens hebben, waardoor de zijdeproducerende klieren zeer gemakkelijk te isoleren zijn. Personen die nieuw zijn met deze methode kunnen problemen ondervinden, omdat de klieren tijdens de dissectie vaak scheuren. Er zijn ook bepaalde anatomische structuren die moeilijk te isoleren zijn.Een visuele demonstratie is essentieel voor een goede dissectie. De procedure zal worden gedemonstreerd door Kobe LaMattina, Tiffany Tootin, Blasingame en Y Shaw. Bereid vóór aanvang van de dissectie 500 milliliters dissectiebuffer voor, bestaande uit 0.1 molar natriumchloride, 0.015 molar natriumcitraat en 0.1% ethylbicarbonaat.Bereid vervolgens een kartonnen doos voor met een plastic voering om de spin te herbergen en te voorkomen dat deze ontsnapt. Wij verkrijgen zwarte weduwen doorgaans uit houtstapels, struikgewas of garages, en gebruiken glazen potten om ze in het laboratorium te huisvesten. Zodra de spin is verkregen, wordt deze tijdens het hanteren van de spin vanuit de glazen pot naar de doos overgebracht.Draag voor de veiligheid twee paar latex- of tuinhandschoenen. Benader de spin vervolgens van achteren met een klein plastic cultuurbuisje, schuif de spin in het buisje en sluit dit onmiddellijk af. Introduceer koolstofdioxidegas in het buisje bij 5 tot 10 PSI gedurende 10 minuten om de spin te anesthetiseren; de initiële dissectie van het abdomen van de cephalothorax moet binnen vijf minuten worden uitgevoerd terwijl de spin nog onder anesthesie is.Plaats de geanestheseerde spin in een kleine dissectieschaal. Knip het pedicel, de smalle steel die het cephalothorax met het abdomen verbindt, door om het abdomen los te maken. Het cephalothorax bevat de giftanden van de spin en moet op de juiste wijze worden afgevoerd.Verwijder voorzichtig de cephalothorax, plaats deze in een Petrischaal en vries deze een nacht lang in. Lokaliseer vóór het weggooien het gat in het abdomen van de spin, dat is gemaakt met de pedes-celclip, door de plek te identificeren waar vloeistof uit het abdomen komt. Steek met één dissectienaald de naald door het gat in het abdomen om het abdomen aan de dissectieschaal te bevestigen, waarbij de spin zo wordt georiënteerd dat het voetstuk het verst van de dissector af staat en de spint het dichtst bij de dissector staat.Begin in het gat vanaf de cellen van de pedes met een microschaartje en knip aan beide zijden lateraal door het exoskelet tot de dorsale zijde is bereikt. Pel met een pincet het anterieure segment van het exoskelet terug en plaats op deze positie een tweede speld. Draai vervolgens de dissectieschaal 90 graden ten opzichte van de initiële laterale sneden.Snijd door tot de spints zijn bereikt. De incisie staat loodrecht of verticaal op de initiële laterale snede. De spints bevinden zich onder het zandloper-gedeelte en hebben een cirkelvormig uiterlijk.Snijd niet door de spints wanneer de verticale incisie wordt gemaakt. Dompel het abdomen onder in de dissectiebufferoplossing. Pel het resterende exoskelet terug, beginnend bij de initiële laterale incisie.Wanneer dit is voltooid, moet het witachtige tot gelige vetweefsel duidelijk zichtbaar zijn met behulp van een pincet. Begin met het wegscheuren van de vetlaag totdat het grootste deel van het vet is verwijderd en de zijdeklieren duidelijk zichtbaar zijn. Indien er eieren aanwezig zijn, dienen deze te worden verwijderd.Ontleed op dit punt de klieren in de volgende volgorde: de tubulaire vorm, de major ate flagella vorm, de aggregate minor ate assif vorm en vervolgens de piriforme vorm. We beschrijven elke klier in de volgorde van dissectie.De tubulaire klieren bevinden zich bovenop alle andere klieren en beschikken over drie paren zeer lange cilindrische buizen die overvloedig aanwezig zijn in de buikholte. Scheid deze klieren voorzichtig van de rest van de klieren. Laat ze vrij zweven, maar zorg dat ze via hun gangen verbonden blijven met de spinnerets.Scheid vervolgens de twee grote ampulkliertjes die ook bij peren voorkomen. Deze klieren zijn groot en halvemaanvormig, met lange, gewonden distale staarten en proximale delen die in breedte afnemen. Wanneer u de spinnerets van de spin nadert, verwijdert u de grote ampulkliertjes en plaatst u deze in steriele microcentrifugebuisjes van 1,5 milliliter.Plaats de klieren op ijs na verwijdering. Verwijder vervolgens de flagella formm-klier. De flagella formm-klier is ook aanwezig als een peer.Het is een multilobulaire structuur met een klein cilindrisch zigzagvormig kanaal dat zich naar beneden uitstrekt richting de spints nadat deze zijn verwijderd en op ijs zijn geplaatst. Vervolgens is de kleine alet in morfologie zeer vergelijkbaar met de grote alet, maar aanzienlijk kleiner. De aggregaatklier, die in paren voorkomt, is groot en multilobulair en heeft een zeer groot uitscheidingskanaal met grote onregelmatige lobben.De sinoformale klieren komen in grote aantallen voor en lijken op korte, kleine vingerachtige uitsteeksels. De piriforme klier is de kleinste klier in het abdomen en heeft vele compacte cilindrische kanalen die lijken op een waaier, met veel kleine uitscheidingskanalen die naar beneden lopen tot aan de spint. Aangezien de tubulaire formmale klier nu de enige klier is die nog vrij drijft, verwijdert u deze door het kanaal met een pincet dicht te knijpen en voorzichtig te trekken tot het afscheurt van het uitgangspunt bij de spint. Flash-freeze na dissectie alle gedissecteerde klieren door de buis in vloeibare stikstof te plaatsen tot ze bevroren zijn en bewaar ze bij -80 °C voor opslag.Als alternatief kunnen de klieren onmiddellijk worden ingevroren nadat ze afzonderlijk zijn verwijderd tijdens de dissectieprocedure. Deze figuur toont de isolatie van mRNA-niveaus van het zijdegen TUSP one in de verschillende zijdeproducerende klieren, met uitzondering van de piriforme klier, middels kwantitatieve real-time PCR-analyse na isolatie van totaal RNA uit de klieren. De tubulaire klieren bevatten de grootste overvloed aan TUSP one mRNA.Deze figuur toont een typisch resultaat van het aminozuursamenstellingsprofiel van de eiwitten die uit de tubulaire vormklier zijn geëxtraheerd. Blauwe kleuring reflecteert aminozuren met polaire zijketengroepen, terwijl rode kleuring aminozuurresiduen met niet-polaire zijketengroepen vertegenwoordigt. Deze figuur toont de massaspectrometrieanalyse van eiwitextracten verkregen uit de piriforme klier na insolution triptych.De digestie hier maal twee representeert een tweevoudige vergroting van de spectrumintensiteit. Spectrum peptide-ionmassa's gemarkeerd met het hekje-symbool geven peptiden aan die afgeleid zijn van het zijdefibroïne PYSP 1 na de ontwikkeling ervan. Deze techniek baande de weg voor onderzoekers in de soak biology-gemeenschap.Het werd gebruikt om chemische en moleculaire processen te onderzoeken die betrokken zijn bij de productie van verzadigde vezels, de assemblage van zijdevezels en extrusie. Als deze techniek correct wordt uitgevoerd, kan dit in anderhalf tot drie uur worden voltooid. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om twee paar handschoenen te dragen totdat de spinnentanden zijn verwijderd.Aan het einde van deze methode kunnen de zijdeproducerende klieren worden gebruikt voor de extractie van RNA en eiwit. Deze materialen kunnen worden gebruikt voor downstream-toepassingen zoals kwantitatieve real-time PCR, alsook massaspectrometrie. De informatie die uit deze studies kan worden verkregen, zal ons helpen om de assemblage van zijde en het pad van zijde-extrusie beter te begrijpen.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u de zeven verschillende zijdeproducerende klieren uit de vrouwelijke zwarte weduwe-spin kunt isoleren.

microdissection-of-black-widow-spider-silk-producing-glands

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ondanks de uitstekende mechanische en biochemische eigenschappen van spin zijde, kan dit materiaal worden geoogst in grote hoeveelheden op conventionele wijze. Hier beschrijven we een efficiënte strategie om kunstmatige spinnenzijde vezels, die is een belangrijk proces voor de onderzoekers bestuderen van spinnenzijde productie en het gebruik ervan als next-generation biomaterialen te laten draaien.

Synthetische Spider Silk Production op laboratoriumschaal

Opklaren is een krachtige tool waarmee beeldvorming verschillende biologische processen in levende dieren. In dit artikel presenteren we een gedetailleerde werkwijze voor het afbeelden van de dynamiek van subcellulaire structuren, zoals de secretoire granules in de speekselklieren van levende muizen.

Intravitale Microscopy for Imaging Subcellulaire Structuren in Levende muizen die fluorescerende eiwitten

Plantklieren zijn gespecialiseerde structuren die verantwoordelijk zijn voor de biosynthese en secretie van veel verbindingen die betrokken zijn bij interacties met de biotische omgeving. Om studies naar hun moleculaire en biochemische kenmerken mogelijk te maken, werd een mechanische micropreparatietechniek ontwikkeld om enkele metabolisch actieve klieren te isoleren, hier van de vleesetende plant Nepenthes.

Isolatie van levensvatbare meercellige klieren uit weefsel van de vleesetende plant, Nepenthes

Dit artikel geeft een protocol voor de winning van gif van spinnen met behulp van elektrische stimulatie om 1) uitvoeren van proteomics karakterisering, 2) het stimuleren van gifklier genexpressie, en 3) uitvoeren van functionele studies van vergiften. Daarna volgt een omschrijving van gifklier microdissections genexpressie studies.

Extractie van Venom en Venom Gland Microdissections van Spinnen voor proteoom en transcriptoom Analyses

Een protocol voor de microfluidic spinnen en karakterisering van de microstructuur van geregenereerde zijde fibroin monofilament wordt gepresenteerd.

Microfluidic droog-spinnen en karakterisering van geregenereerde zijde Fibroin vezels

Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van geheel, intact muis borstklieren om te onderzoeken van de extracellulaire matrix (ECM) expressie en ductaal morfologie. Muis #4 abdominale klieren werden gehaald uit de 8-10 week oude vrouwelijke nullipaar muizen, vast in neutraal gebufferde formaline, gesegmenteerd en gekleurd met behulp van immunohistochemistry voor ECM eiwitten.

Isolatie van Intact, hele muis borstklieren p.a. van extracellulaire Matrix expressie en klier morfologie

Hoewel veel insecten in de onderorde Wantsen (Insecta: Hemiptera) zijn giftig, de samenstelling van hun gif en de functies van hun vergift toxinen zijn meestal onbekend. Dit protocol wordt beschreven methoden om te heteropteran boosdoeners voor verdere karakterisering, met behulp van elektrostimulatie, intimidatie en klier dissectie van de oogst.

Oogsten van Venom toxines uit Assassin insecten en andere Heteropteran insecten

Hypopharyngeal klier acinus grootte is een robuuste maatregel van verpleegkundige honing honingbij voeding. Hier, bieden wij een gedetailleerd protocol voor ontleden, kleuring, imaging en verpleegkundige bee hypopharyngeal klier acini meten.

Meten van de Hypopharyngeal de grootte van de Acinus van de klier in de honingbij (Apis mellifera) werknemers

Hier presenteren we een protocol voor de productie van water oplosbare recombinant Spider Silk Protein Solutions en de materiële vormen die kunnen worden gevormd uit deze oplossingen.

Materiaal vorming van recombinant spin Silks door waterige oplosmiddel met behulp van warmte en druk

De speekselklier van volwassen muggen (SG) is vereist voor de overdracht van alle door muggen overgedragen pathogenen naar hun menselijke gastheren, inclusief virussen en parasieten. Deze video toont een efficiënte isolatie van de SG's van de larvale (L4) stadium Anopheles gambiae muggen en de voorbereiding van de L4 SG's voor verdere analyse.

Dissectie en immunostaining van larvale speekselklieren van Anopheles gambiae muggen

Leer microdissectie van zijdeproducerende klieren bij zwarte weduwespinnen voor moleculair en biochemisch onderzoek. Deze methode isoleert zeven klieren voor analyse van zijde-eiwitten en mRNA.

Microdissectie van Black Widow Spider Silk-producerende klieren

Meer video's verkennen