In Utero Intraventriculaire injectie en elektroporatie van de E15 muizenembryo's

Hoi, ik ben William Tis van het Krete Lab. Vandaag ga ik samen met anderen intrauterine injecties bij embryonen van muizen op dag E 15 demonstreren. Hoi, mijn naam is Laura Elias.

Vandaag laat ik u zien hoe u de micro-injectiepijpjes voorbereidt en vult voor de intraventriculaire injecties en electroporatie die we zullen uitvoeren. Mijn naam is David Castaneda en vandaag zal ik assisteren bij in vivo in utero injecties van muisembryo's. We zullen plasmid-DNA injecteren in het laterale ventrikel van ontwikkelende muisembryo's.

We richten ons op de CE-cortex van deze embryo's om expressie te verkrijgen van verschillende moleculen door gliacellen en cellen die later in de ontwikkeling neuronen zullen worden. Bij het uitvoeren van deze intra-uteriene injecties zijn er een paar belangrijke instrumenten die u moet gebruiken en die ik u nu zal laten zien. We gebruiken een fixer en een paar fijne pincetten.

Eén, één paar dat gekarteld is, en een ander paar met een klein tandje aan het uiteinde. We gebruiken een paar hemostaten. Dit is een schaar.

Vervolgens gebruiken we deze twee nietmachines. Dit is de grotere, die we voor ratten gebruiken. Dit is de kleinere, die we voor muizen gebruiken.

Er wordt een niet van maat zeven gebruikt, en hier wordt een niet van maat negen gebruikt; deze zijn simpelweg veerbelast. Enkele zaken die we hier gebruiken ter ondersteuning van de operaties zijn een eenvoudige glasvezellichtbron met een dubbele kop. We maken gebruik van een verwarmde mat die warm water circuleert om de temperatuur constant te houden.

Voor het werkoppervlak gebruiken we dit electroporatiesysteem van BTX. We hebben verschillende maten elektroden die we gebruiken afhankelijk van de grootte van de embryo's. De blauwe zijde is de positieve zijde.

Voor de muizen gebruiken we een isofluraanverdampariër. We hebben vastgesteld dat dit de overlevingskans van zowel de moeder als de embryo's verhoogt. Daarnaast stelt het ons in staat om het dier zeer snel en op een gecontroleerde manier onder en weer boven narcose te brengen.

Om die reden vonden we dit zeer nuttig. Goed, we gaan nu onze injectiepipetten afschuinen. Dit is zeer belangrijk, zodat uw pipet een voldoende grote opening heeft om het DNA te kunnen laden, maar ook zodat deze zeer scherp is om schade aan het embryo tijdens de injectie te voorkomen.

En als u het embryo beschadigt tijdens het injecteren, zal de mortaliteit veel hoger liggen. Dat is onwenselijk. Dit is dus een zeer belangrijk proces binnen deze chirurgische ingreep.

Eerst voegen we wat water toe aan deze roterende afschuifsteen. Vervolgens pakken we, laten we kijken, gewoon een stokje. En we gaan de pipet die we zojuist hebben getrokken met wat tape op dit stokje bevestigen.

We gebruiken een van deze micromanipulatoren om de pipet op de schuine kant vast te houden en deze hier te laten rusten. Plaats deze nu, waarbij we de microscoop gebruiken om de punt van de pipet te visualiseren. We plaatsen deze rechtstreeks in het water op de schuine kant, zodat er een lichte druk ontstaat.

En u kunt zien hoe de punt tegen de steen wordt gedrukt. Laat dit een tijdje schuin afschuren, gedurende ten minste 15 minuten. Ik laat ze zelfs vaak een uur liggen.

Soms worden ze echt heel erg scherp, maar het hangt absoluut per persoon af hoe lang ze hun pipetten afschuinen. Goed, dus hier hebben we, zoals u bovenaan kunt zien, een pipet die is uitgetrokken maar nog niet is afgeschuind. Hoewel deze scherp is, is er geen opening waardoor u uw DNA kunt laden.

Nu is de onderkant van de pipet schuin afgesneden en u kunt deze mooie schuine opening zien. Dit stelt u in staat om uw DNA te laden, maar de tip is nog steeds scherp zodat u kunt injecteren zonder schade aan te richten. Goed, we gaan nu onze injectiepipetten vullen met DNA. Het is belangrijk dat u uw DNA op een endotoxinevrije manier voorbereidt, zodat u geen lipopolysachariden injecteert wanneer u uw DNA injecteert.

We nemen nu ons DNA en maken hier de parafilm klaar. Je maakt de parafilm klaar, verzamelt je DNA en plaatst dit als een klein stipje op de parafilm. Vervolgens neem ik gewoon voor elke 10 µL DNA, waarbij ik gewoonlijk een concentratie van ongeveer 1,5 tot 1,7 µg/µL gebruik.

Ik gebruik ongeveer 1 µL van deze fast green-kleurstof. Dit is enkel om ons te helpen de injectie te lokaliseren en om er zeker van te zijn dat we succesvol in het ventrikel hebben geïnjecteerd. Vervolgens meng ik deze fast green-kleurstof met mijn DNA.

Neem vervolgens de injectie-elektrode en vul de pipet door aan de zuiger te trekken. U kunt hier zien dat, indien de pipet correct is afgeschuind en over een voldoende grote opening beschikt, de DNI vrij gemakkelijk geladen zou moeten worden. Soms moet u de zuiger heen en weer bewegen om het correct laden te bevorderen.

Vervolgens kun je de pipet op deze manier vullen. Het DNA is nu volledig in deze pipet geladen en is klaar voor injectie. Oké, ik ga het dier nu wassen met alcohol en jodium, maar eerst wil ik natuurlijk een knijpprik in de teen doen om er zeker van te zijn dat het dier volledig onder narcose is, en dat ziet er goed uit.

Ik kan nu beginnen. Net als bij de ratten voeren we een serie van drie van deze stappen uit, beginnend met de ethanol. Oké, jodium.

Om het risico op infectie te minimaliseren, let er op dat William het dier reinigt met het deel van de doekjes dat niet door zijn vingers is aangeraakt nadat hij deze heeft geopend. Dit is om te waarborgen dat het gebied maximaal schoon blijft. Ten tweede voert hij slechts één veegbeweging uit om te voorkomen dat er ziektekiemen over het buikoppervlak worden verspreid.

Oké, prima. Nu ga ik eerst alles een beetje schoonmaken en trek ik chirurgische handschoenen aan. Oké. Oké. Oké. Nu ga ik de muis openen om de uterine hoorns te verwijderen, en dat begin ik met een kleine huidplooi.

Ik voer hier nogmaals een teenknijp-test uit om er zeker van te zijn dat ze volledig onder narcose is, en dat is goed. Ik knijp in de huid om daar een klein plooitje te maken dat omhoog komt, wat het knippen voor mij vergemakkelijkt. En opnieuw: we willen de incisie precies langs de middenlijn van het dier maken om bloedvaten te vermijden.

Ik snijd de huid gewoon zo door, scheid deze en leg de spier bloot. Zodra dat is gedaan, kun je de middellijn in de spier gemakkelijk zien. Deze is zeer duidelijk gedefinieerd.

Ik pak daar wat spierweefsel vast en knip het door. Dat is een goede grootte voor de incisie; ik zou deze niet groter willen maken. Vervolgens gebruik ik deze freer om de spier en de huid op te tillen en opzij te trekken, waarna ik heel voorzichtig sondeer en probeer de freer tussen de twee embryo's te positioneren, zodat ik ze voorzichtig naar buiten kan trekken zonder ze te beschadigen.

Soms gaat het makkelijker dan andere keren. Zo gedaan. Trek het nu voorzichtig door en zodra het erdoorheen is, kan ik ze een beetje naar buiten duwen.

Het is belangrijk om de embryo's nooit samen te knijpen; je wilt ze enkel sturen, een beetje aansturen. Zodra je ze eruit hebt, moet je ervoor zorgen dat ze altijd erg nat blijven. Je mag ze niet laten uitdrogen.

En laten we kijken, ik gebruik hier opnieuw mijn freer om te zoeken. Daar gaan we. Dat is geweldig.

Ik wil er daarom altijd zeker van zijn dat ik ze allemaal heb verwijderd, want als je niet op de eierstokken controleert, is het makkelijk om er eentje te laten zitten. Daarom trek ik ze opnieuw heel voorzichtig naar buiten, terwijl ik zoek naar en controleer op de aanwezigheid van de eierstokken aan het uiteinde, die daar zitten. Bij dit dier ziet het eruit als een klein massa rood weefsel.

Draai ze vervolgens om, kom terug en controleer de andere zijde; daar kan ik ze zien. Zorg er dus voor dat ze gehydrateerd blijven en we zijn klaar om te beginnen. Iets wat ik wil benadrukken is dat u de embryo's zeer voorzichtig moet oppakken en alleen de embryo's zelf vastpakt.

Pak het embryo niet vast op de plaatsen waar de bloedvaten zich bevinden, omdat deze zeer gemakkelijk beschadigd kunnen raken, waardoor het dier een bloeding kan oplopen en de overlevingskans drastisch daalt. Het eerste wat we daarom willen bepalen, is waar de kop van het embryo zich bevindt dat we met het DNA willen injecteren. Dit doen we door het dier voorzichtig te draaien en naar het ventrale gedeelte te kijken.

In dit specifieke voorbeeld bevindt de kop zich aan mijn rechterkant en de staart dicht bij mijn linkerkant. De middellijn bevindt zich in deze positie en William zal het embryo op de juiste manier positioneren zodat ik het kan injecteren. Net als bij de ratten positioneer ik ze altijd met de kop aan de rechterkant van de moeder, naar mij toe gericht.

En dus zal ik daar nu mee beginnen. Oké, u kunt daar de linker vloerpaal zien; verschuif deze een klein beetje en u ziet daar zeker de middellijn. Ik zal proberen hem een beetje te draaien zodat hij in een goede positie staat voor David.

Oké, en nu ga ik over tot het injecteren van de linker ventrikel. We kunnen hier zien dat de linker ventrikel volledig is gevuld met DNA. We kunnen zien dat er wat kleurstof naar de rechter ventrikel is verspreid en ook naar de derde en vierde ventrikels hier.

Dat is een goede indicator van een geslaagde injectie. We zullen nu overgaan tot het elektroporteren van het DNA in de cellen. Het is hierbij van essentieel belang om te weten welke elektrode de positieve pool is.

We weten dat de elektrode met de blauwe handgreep hier de positieve elektrode is en dat deze zijde moet worden geplaatst aan de kant waar we het DNA in willen electroporeren. Aangezien we het grootste deel van het DNA in de linker ventrikel hebben geïnjecteerd, plaats ik de positieve elektrode als volgt aan de linkerzijde, waarna we vijf pulsen zullen toepassen en dat is alles. Het is belangrijk dat de elektroden volledig nat zijn in PBS, zodat het contact tussen de elektroden en de baarmoeder goed is en de overdracht van de elektrische pulsen optimaal verloopt.

Oké, nu de exploratie is voltooid, ga ik de hoorns weer terugplaatsen. Dat doe ik door de hoorns heel voorzichtig naar één kant te bewegen, naar binnen te reiken om de spier en de huid vast te pakken en deze heel voorzichtig weer terug te duwen. Oké, mooi.

Pas op voor de blaas. Ik kan de andere kant doen. En daarna schudden we haar voorzichtig om ze daarin te laten zakken.

Gebruik de freer een klein beetje om ze voorzichtig plat te maken. Daarna ga ik spoelen met 3 ml antibioticum-antimycoticum. Laten we een teenknijptest doen om er zeker van te zijn dat ze volledig onder narcose is voordat ik begin te hechten.

En dat ziet er goed uit. Ik ga Henry Shine gebruiken. Nummer zes, chirurgisch hechtmateriaal.

Ik geef de voorkeur aan bloksteken. Ik denk dat deze steviger zijn. We beginnen simpelweg door de naald erdoorheen te steken, deze door te trekken, drie keer om te wikkelen, het uiteinde te pakken en het erdoorheen te trekken.

1, 2, 3, knip het teveel af. U wilt dus gewoon in een lijn doorgaan, gelijkmatig afstand houden en strak aantrekken. Ga net voorbij het punt waar de incisie stopt en knoop het daar opnieuw af.

En daar ben ik nu aan toe. Trek het weefsel of de huid een beetje terug. Er is daar sprake van een beetje bloeding.

Het zou goed moeten gaan. We houden een cauterisator bij de hand voor het geval er bloedingen optreden, wat af en toe gebeurt. En die cauterisator werkt goed om dat te stoppen.

Oké, ik ben nu voorbij de incisie. Ik stop daar. Trek het door, maak een lus, draai drie keer rond, pak de lus vast en trek deze naar beneden.

Draai drie keer rond, pak de lus vast, trek deze door en verwijder het overtollige materiaal. Deponeer de naald in de naaldencontainer. Vervolgens gaan we een nietmachine gebruiken.

We zullen nietjes van maat zeven gebruiken bij dit dier. We gebruiken maat zeven voor muizen en maat negen voor ratten.

Pak simpelweg de huid vast, trek deze een stukje omhoog en begin met het plaatsen van de clips. Pak de clip opnieuw. We willen dat deze gelijkmatig verdeeld zijn over de gehele lengte tot iets voorbij de incisie, en dat is goed.

Reinig het gehele gebied vervolgens met een alcoholdoekje. Daarna geven we haar een injectie buprenorfine om er zeker van te zijn dat ze geen pijn ervaart. We zullen haar de komende dagen blijven monitoren om te controleren of ze gezond blijft en geen pijn heeft.

Nu we haar een injectie buprenorfine hebben gegeven, plaatsen we haar terug in haar oorspronkelijke kooi zodat ze zich comfortabel voelt wanneer ze wakker wordt; we zetten deze in de incubator en laten haar daar ongeveer 20 minuten blijven tot ze volledig wakker is en is opgedroogd. We hebben u laten zien hoe u in vivo in utero electroporatie van plasmide-DNA uitvoert. We kunnen elke molecule injecteren.

Het zou DNA kunnen zijn of het zou medicijnen kunnen zijn. Groeifactoren kunnen ook zijn. Als deze moleculen in de cellen moeten worden afgeleverd en ze niet via passieve diffusie passeren, is electroporatie nodig en daarvoor moeten de moleculen geladen zijn.

In essentie zijn de mogelijkheden echter grenzeloos. Een voorbeeld van een alternatieve vector voor het afleveren van genen in een cel zijn onze virussen.

In het verleden hebben we retrovirussen gebruikt om glia met DNA te labelen en aan te tonen hoe ze zich delen en neuronen worden, om uiteindelijk naar de cortex te migreren nadat de cellen met een virus zijn gelabeld, of door middel van elektroporatie, of door het injecteren van geneesmiddelen of andere moleculen om de ontwikkeling van de hersenen te beïnvloeden. Dit kan met verschillende technieken worden bestudeerd. Een daarvan is time-lapse opname, waarbij organotypische plakculturen worden gebruikt.

Vervolgens volgt u het lot van de cellen met behulp van een microscoop. Zoals u hier kunt zien, tijdstip 0,0. We beginnen met een cluster cellen die zich zeer dicht bij het laterale ventrikel bevinden.

Naarmate de tijd verstrijkt, kunnen we zien dat de cellen beginnen te migreren vanuit de ventriculaire zone in de richting van de corticale plaat. Daarnaast fixeren we de embryo's en voeren we immunohistochemie uit om de distributie van verschillende moleculen te bestuderen, of om het lot van deze verschillende cellen te bepalen. Een andere mogelijkheid is het uitvoeren van elektrofysiologie.

We identificeren de labelcellen en bestuderen vervolgens hun elektrische eigenschappen. Bedankt dat u vandaag bij ons was. We hopen dat u heeft genoten van onze demonstraties en dat u succes zult hebben met het uitvoeren van uw experimenten.

Mocht u vragen hebben, neem dan gerust contact met ons op. Veel succes.