Name: Transfecteren menselijke neurale stamcellen met de Amaxa Nucleofector (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Leer hoe u menselijke neurale stamcellen transfereert met de Amaxa Nucleofector voor genfunctie-onderzoek. Deze methode biedt hoge transfertie-efficiëntie en celviabiliteit in de neurowetenschap.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen dr. Philip H. Schwartz van de National Human Resource Neural Stamcel erkennen bij de Children&#39;s Hospital, Orange County Instituut voor het verstrekken van hNSPC culturen.

Opmerking: Raadpleeg de passage menselijke neurale stamcellen artikel ( <a href="/index/Details.stp?ID=263">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263</a> ) en de Counting menselijke neurale stamcellen artikel ( <a href="/index/Details.stp?ID=262">https://www.jove.com / index / Details.stp? ID = 262</a> ) om te leren hoe te mengen en te tellen hNSPCs. Voorbereiding <ol><li> Zorg ervoor dat er voldoende cellen beschikbaar zijn voor transfectie (enkele miljoenen cellen voor elk DNA getransfecteerd worden). </li><li> Coat een weefselkweek schotel, waarin de getransfecteerde cellen worden gezaaid met 10 ug / ml humaan fibronectine de avond tevoren transfectie. Vlak voor het begin van de transfectie-protocol, verwijder de fibronectine, spoel de schotel met PBS, en plaats de cultuur media in de schotel. Laat de schotel in de 37 ° C weefselkweek incubator aan de media warm. Ook, plaats 1 ml van de cultuur media in de incubator te pre-warm tot 37 ° C. </li><li> Plaats het DNA (s) te worden getransfecteerd, en transfectie (uit Amaxa), op ijs. </li></ol> Transfectie <ol><li> Was een bepaald aantal cellen met PBS (we meestal gebruik ~ 5 x 106 cellen per transfectie). Pellet de cellen door centrifugeren (1000 toeren per minuut (~ 200xg) gedurende 5 minuten), verwijder zo veel PBS als mogelijk, en resuspendeer de cel pellet in 100 ui van de transfectie-oplossing die bij de transfectie kit. Breng de celsuspensie naar een 1,7 ml Eppendorf buis. </li><li> Voeg 5 pi van het DNA (~ 50-10 ug van DNA per transfectie) om de celsuspensie en meng voorzichtig. </li><li> Met behulp van de Amaxa mini-pipet de cel-DNA mix in de Amaxa transfectie cuvette. Zorg ervoor dat je 1 ml van de voorverwarmde kweekmedia voor de volgende stap. Ook, verwijder de cel gerecht met de cultuur media uit de incubator en plaats deze in de weefselkweek kap. </li><li> Plaats de cuvette in de Nucleofector, draai het wiel met de klok mee, en selecteer het programma &quot;A-033&quot;. Druk op Enter. </li><li> Een succesvolle transfectie wordt aangegeven door de aanwezigheid van een zeer dichte laag van bellen op de top van de oplossing in de cuvet. Voeg 500 ul warm media in de cuvet, en het gebruik van de Amaxa mini-pipet de getransfecteerde cellen in de schaal met voorverwarmd media. Spoel de cuvet met meer warm media en voeg de spoel aan dezelfde schotel. Zet de schaal met cellen in het 37 ° C weefselkweek incubator. </li></ol>

<ol><li>Gresch, O., Engel, F. B., Nesic, D., Tran, T. T., England, H. M., Hickman, E. S., Krner, I., Gan, L., Chen, S., Castro-Obregon, S., Hammermann, R., Wolf, J., M ller-Hartmann, H., Nix, M., Siebenkotten, G., Kraus, G., Lun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+non-viral+method+for+gene+transfer+into+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">New non-viral method for gene transfer into primary cells.</a> Methods. 33, 151-163 (2004).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Passaging Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, 

 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263">http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263</a> (2007).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Counting Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, 

 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262">http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262</a> (2007).</li>
</ol>

Dit protocol beschrijft een relatief snelle en efficiënte procedure voor transfectie hNSPCs. Met behulp van deze procedure, hebben wij de eerste transfectie efficiëntie van ~ 35%. Cellen die zijn getransfecteerd door deze procedure kan worden gebruikt voor korte-termijn studies (transient getransfecteerde cellen) of voor een langere-termijn studies als een selectiemiddel wordt gebruikt om een ​​stabiel getransfecteerde bevolking te genereren. We hebben gegenereerd stabiel getransfecteerde cellen waarin ~ 70% van de cellen drukken de exogene...

<table><tbody><tr><td>Het Nucleofector-apparaat</td><td>Instrument</td><td>Amaxa</td><td>AAD-1001</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector-kit voor neurale stamcellen van muizen</td><td>Reagens</td><td>Amaxa</td><td>VPG-1004</td><td></td></tr></tbody></table>

transfecteren menselijke neurale stamcellen met de amaxa nucleofector

Transfecting Human Neural Stem Cells with the Amaxa Nucleofector

Transfectie van primaire zoogdieren neurale cellen, zoals menselijke neurale stamcellen / precursor cellen (hNSPCs), met veel gebruikte kationische lipiden transfectiereagentia heeft vaak geleid tot een slechte levensvatbaarheid van de cellen en de lage transfectie-efficiëntie. Andere mechanische methoden van de invoering van een gen van belang, zoals een gen geweer of micro-injectie, worden ook beperkt door een slechte levensvatbaarheid van de cellen en de lage aantallen van getransfecteerde cellen. De strategie van het gebruik van virale constructen om een ​​exogene gen te introduceren in primaire cellen is beperkt door zowel de hoeveelheid tijd en werk nodig is om virale vectoren en mogelijke veiligheidsproblemen te creëren. We beschrijven hier een stap-voor-stap protocol voor het gebruik van transfecteren hNSPCs Nucleofector apparaat Amaxa en technologie met elektrische stroom parameters en buffer-oplossingen die specifiek geoptimaliseerd voor het transfecteren neurale stamcellen. Met behulp van dit protocol hebben we bereikt de eerste transfectie efficiëntie van ~ 35% en ~ 70% na stabiele transfectie. Het protocol houdt een combinatie van een groot aantal hNSPCs met de DNA getransfecteerd worden in de juiste buffer, gevolgd door elektroporatie met de Nucleofector apparaat.

Het introduceren van een gen van interesse in een cel is een krachtige methode voor het ophelderen van de functie in vivo. Dit protocol beschrijft een efficiënte methode voor het transfecteren een cultuur van menselijke neurale stamcellen / precursor cellen (hNSPCs) met de Nucleofector elektroporatie apparaat gemaakt door Amaxa.

Transfecteren menselijke neurale stamcellen met de Amaxa Nucleofector

Transfectie van primaire neurale cellen van zoogdieren, zoals menselijke neurale stam-/precursorcellen (hNSPCs), met veelgebruikte kationische lipide transfectie...

Hoi, ik ben Steve. Ik werk in het laboratorium van Dr. Flanagan bij de afdeling Pathologie van uc, Irvine. Vandaag ga ik u laten zien hoe u menselijke neurale precursorcellen kunt transfecteren met behulp van een maxis nucleaire factor.Om te beginnen heeft u veel cellen nodig. Ik zou zeggen datten een confluente T 25-fles vereist is, aangezien dit protocol een zeer hoge celdichtheid vereist; u heeft dus minimaal een miljoen cellen nodig. Allereerst ga ik de cellen van het oppervlak halen met behulp van een cel-dissociatiebuffer en ze vervolgens tellen.Voor die procedure kunt u mijn verpakkingsprotocol raadplegen. De reden waarom ik een Maxa prefereer voor mijn transfectie-experimenten is dat Maxa op maat gemaakte transfectieprotocollen ontwikkelt voor specifieke celtypen, en in mijn geval voor neurale stamcellen. En dat werkt uitstekend.Het biedt een zeer hoge transfectie-efficiëntie en een zeer hoge cellevensvatbaarheid. Laten we beginnen. Ik ben nu klaar om een transfectie uit te voeren.Ter voorbereiding op deze transfectie heb ik mijn weefselkweekschaal al gedurende de nacht gecoat met fibrine. Daarna heb ik er groeimedium in geplaatst. Op dit moment staat de schaal in de incuba

transfecting-human-neural-stem-cells-with-the-amaxa-nucleofector

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ondanks de recente ontwikkelingen in genetische modificatie, transfectie van humane embryonale stamcellen (hESC 's) blijft een grillig proces. Voor zover wij weten, zijn systematische en efficiënte methoden om menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) transfecteren niet gemeld. Hier beschrijven we robuuste protocollen om efficiënt te transfecteren en nucleofect menselijke iPSCs.

Transfecteren en Nucleofecting Human geïnduceerde pluripotente stamcellen

This video describes a precise genome editing technique in human induced pluripotent stem cells, or hiPSCs, using TALENs to create double-stranded breaks at a targeted locus, inducing homology-directed repair for fluorescence protein gene integration.

TALEN-Mediated Targeted Gene Integration: Using Engineered Sequence-Specific Nucleases for the Precise Insertion of Fluorescent Protein Gene into hiPSCs

This video demonstrates the direct reprogramming of genetically modified hematopoietic progenitor cells into neuronal stem cells. Transcription factors expressed by hematopoietic progenitor cells trigger a cascade of molecular events facilitating their transformation. Further specific media is used to select and grow induced neuronal stem cells.

Direct Reprogramming of Hematopoietic Progenitor Cells into Neural Stem Cells

This video demonstrates the process of inducing human pluripotent stem cells to differentiate into neurons by transfecting them with engineered lentiviruses carrying a neurogenic transcription factor gene under the control of  tetracycline-responsive element, followed by treatment with a tetracycline derivative and maturation medium.

Human Pluripotent Stem Cell Differentiation in Neurons Using Engineered Lentiviruses

Reporter cellijnen bieden een middel om te visualiseren, te volgen en te isoleren cellen van belang zijn van de heterogene populatie. Echter, gen targeting met gebruikelijke homologe recombinatie in humane embryonale stamcellen is inefficiënt. Hierin beschrijven we richten CNS middenhersenen specifieke transcriptiefactor PITX3 locus met EGFP met zink-vinger nuclease verbeterde homologe recombinatie.

Zink-vinger Nuclease Enhanced gentargeting in menselijke embryonale stamcellen

Een werkwijze werd ontwikkeld om direct voort humane neurale stamcellen van hematopoïetische progenitorcellen verrijkte uit perifere bloedcellen.

Direct Inductie van Human neurale stamcellen uit perifeer bloed hematopoïetische voorlopercellen

TALEN-gemedieerde genre-editing op het veilige haven-locus AAVS1 maakt hoog-efficiënte toevoeging van transgenen mogelijk in menselijke iPSC's. Dit protocol beschrijft de procedures voor het voorbereiden van iPSC's voor TALEN en donorvector-levering, het transfecteren van iPSC's en het selecteren en isoleren van iPSC-klonen om gerichte integratie van een GFP-gen te bereiken voor het genereren van reporter-lijnen.

Transfectie, Selection, en Kolonie-picking van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen TALEN-gericht, met een GFP-gen in de AAVS1 Safe Harbor

Hier beschrijven we een gedetailleerde methode voor naadloze genbewerking in menselijke pluripotente stamcellen met behulp van een piggyBac-gebaseerd donorplasmide en de Cas9-nickasemutant. Tweepuntsmutaties werden geïntroduceerd in exon 8 van de hepatocytaire alfafactor 4 alfa (HNF4α) locus in menselijke embryonale stamcellen (hESCs).

Introductie van puntmutaties in menselijke pluripotente stamcellen met behulp van naadloze genoombewerking

Hier beschrijven we een nucleofectiesysteem dat is ontworpen om de efficiëntie van genafgifte te verbeteren in uitgebreide neurale stamcellen (NSC's) geïsoleerd uit de subventriculaire zone van volwassen muizen. De bevindingen tonen aan dat deze methode de genverstoring in NSC's aanzienlijk verbetert, de effectiviteit van traditionele transfectieprotocollen overtreft en de celoverleving verbetert.

Isolatie, expansie en nucleofectie van neurale stamcellen uit de subventriculaire zone van volwassen muizen

Hier beschrijven we een protocol voor het manipuleren van chemisch geherprogrammeerde stamcellen om nauwkeurige neuronale modulatie te bereiken door deze cellen te differentiëren in dopaminerge voorlopercellen, ze te transplanteren in muismodellen van de ziekte van Parkinson en gedrags- en elektrofysiologische resultaten te evalueren om de succesvolle integratie en functionele effectiviteit van de getransplanteerde cellen te bevestigen.

Chemogenetische regulatie in geherprogrammeerde stamcel-afgeleide voorlopercellen bij de behandeling van neurodegeneratieve ziekten

Leer hoe u menselijke neurale stamcellen transfereert met de Amaxa Nucleofector voor genfunctie-onderzoek. Deze methode biedt hoge transfertie-efficiëntie en celviabiliteit in de neurowetenschap.

Transfecteren menselijke neurale stamcellen met de Amaxa Nucleofector

Meer video's verkennen