Transfecteren menselijke neurale stamcellen met de Amaxa Nucleofector
19 juli 2007
Het introduceren van een gen van interesse in een cel is een krachtige methode voor het ophelderen van de functie in vivo. Dit protocol beschrijft een efficiënte methode voor het transfecteren een cultuur van menselijke neurale stamcellen / precursor cellen (hNSPCs) met de Nucleofector elektroporatie apparaat gemaakt door Amaxa.
Hoi, ik ben Steve. Ik werk in het laboratorium van Dr. Flanagan bij de afdeling Pathologie van uc, Irvine. Vandaag ga ik u laten zien hoe u menselijke neurale precursorcellen kunt transfecteren met behulp van een maxis nucleaire factor.
Om te beginnen heeft u veel cellen nodig. Ik zou zeggen datten een confluente T 25-fles vereist is, aangezien dit protocol een zeer hoge celdichtheid vereist; u heeft dus minimaal een miljoen cellen nodig. Allereerst ga ik de cellen van het oppervlak halen met behulp van een cel-dissociatiebuffer en ze vervolgens tellen.
Voor die procedure kunt u mijn verpakkingsprotocol raadplegen. De reden waarom ik een Maxa prefereer voor mijn transfectie-experimenten is dat Maxa op maat gemaakte transfectieprotocollen ontwikkelt voor specifieke celtypen, en in mijn geval voor neurale stamcellen. En dat werkt uitstekend.
Het biedt een zeer hoge transfectie-efficiëntie en een zeer hoge cellevensvatbaarheid. Laten we beginnen. Ik ben nu klaar om een transfectie uit te voeren.
Ter voorbereiding op deze transfectie heb ik mijn weefselkweekschaal al gedurende de nacht gecoat met fibrine. Daarna heb ik er groeimedium in geplaatst. Op dit moment staat de schaal in de incubator te wachten op de cellen.
Daarnaast heb ik al al mijn reagentia, mijn DNA-vector en de transfectie-oplossing klaargezet. Deze staan allemaal hier op ijs te wachten. Ik ben nu klaar om te beginnen met de transfectie.
Dit is de M max kernfactor; voordat ik deze in de zuigkast plaats, desinfecteer ik deze met 70% ethanol en veeg ik hem daarna af met een papieren handdoek. Ik heb net geteld zodat ik in totaal 4 miljoen cellen heb en deze heb ik gesuspendeerd. Nu ben ik klaar om te beginnen met het transfecteren.
Eerst verwijder ik het medium waarin ze zich bevinden. Ik heb hier mijn celpellet en ik ga het medium waarin ze zaten afzuigen. Ik probeer zoveel mogelijk medium te verwijderen, omdat ik geen eiwitten of dergelijke in het transfectiemedium wil hebben, aangezien dit het transfectieprotocol zou kunnen beïnvloeden.
Ik heb nu vrijwel al het medium verwijderd en ga dit celpellet resuspenderen in 100 µL van deze specifiek geformuleerde mouse neuro stem cell nuclear factor-oplossing. Mxa produceert een transfectie-oplossing voor het transfecteren van muis-neurale stamcellen; hoewel er geen specifieke oplossing is voor humane neurale stamcellen, hebben we vastgesteld dat het gebruik van die voor muiscellen zeer goed werkt. Ik ga dus 100 µL van deze mouse neuro stem cell nuclear effector-oplossing toevoegen.
Vervolgens zal ik mijn celpellet hierin zeer goed resuspenderen, zodat er geen celklontjes overblijven. Op die manier verkrijg ik een nagenoeg homogene celsuspensie. Ik zal hiervoor ongeveer 10 keer pipetteren.
Ik denk dat ik nu een vrij homogeen mengsel heb, en ik ga dit nu overbrengen naar een open Eppendorf-buisje van 1,5 ml. Ik gebruik hiervoor een P 1000-pipet en zorg dat ik de gehele oplossing meeneem. Nu heb ik mijn 4 miljoen cellen resuspendéerd in nieuwe muistransfectieoplossing, en nu ga ik vijf microliter van mijn vector toevoegen.
Ik heb het dus al die tijd op ijs bewaard tot nu. Ik ga nu eerst 5 µL afmeten. Deze voeg ik nu toe aan de cel-suspensie.
Nu ga ik een P 200 gebruiken die is ingesteld op ongeveer 50 µL, en ik ga de cellen heel goed mengen met de vector. Ik ga dit 10 keer op en neer pipetteren. Oké, dat is klaar.
En ik ben klaar voor de transfectie. Ik ga daarom een nieuwe koker openen. Daarnaast pak ik een speciale pipet die door Amaxa wordt geleverd.
Ik verwijder nu de dop en trek dit mengsel voorzichtig omhoog. Vervolgens voer ik de pipet volledig in de vete in en knijp ik de oplossing er voorzichtig uit. Ik zet nu de max nuclear factor aan, stel deze in op 33 0 3 3 en druk op enter.
Vervolgens plaats ik de vete in de vetehouder, waarna ik het wiel draai; nu ben ik klaar om te transfecteren. Maar daarvoor zorg ik dat er warm medium klaarstaat om direct aan de getransfecteerde cellen toe te voegen. Dit helpt de celviabiliteit te verhogen als ik direct na een transfectie warm medium in de vete toevoeg.
Ik ga nu een P 1000 klaarmaken. Daarnaast haal ik de plaat met medium uit de incubator, zodat ik de cellen direct naar het medium kan overbrengen. Ik druk nu opnieuw op enter en het is voltooid.
En bij een succesvolle transfectie, zoals u hier kunt zien, is er een zeer dikke laag bellen die duidt op een succesvolle transfectie. Ik ga nu 500 µL voorverwarmd medium aan de vete toevoegen. Ik voeg dus meer medium toe dat de cellen dringend nodig hebben, en ik zal dezelfde MX-pipet gebruiken om de cellen uit de vete te halen.
Ze zijn op dit moment dus erg gestrest. Daarom ga ik ze direct in warm medium plaatsen, meer warm medium. En tot slot, de laatste stap, spoel ik de Quellvette af met nog wat voorverwarmd medium om er zeker van te zijn dat ik al deze cellen krijg, en ik plaats het in dezelfde put L en zet de plaat onmiddellijk in de incubator.
Op deze afbeelding zien we menselijke neurale precursorcellen die zijn getransfecteerd met een nucleaire factor en zijn uitgeplaat op rasterdekglasjes. Zelfs twee dagen na transfectie hebben we een transfectie-efficiëntie van ongeveer 50%, wat we kunnen waarnemen via GFP-expressie. Vandaag heb ik u laten zien hoe u menselijke neurale precursorcellen kunt transfecteren met behulp van de Xis-nucleaire factor.
Veel succes met uw transfectie.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een efficiënte methode voor het transfecteren van humane neurale stam-/precursorcellen (hNSPCs) met behulp van het Nucleofector electroporatieapparaat. Dit proces is cruciaal voor het bestuderen van genfuncties in vivo.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Analyse van genfuncties
Achtergrond
- Transfectie is een sleuteltechniek voor genstudie.
- Humane neurale precursorcellen zijn essentieel voor neurowetenschappelijk onderzoek.
- Nucleofector-technologie verhoogt de transfectie-efficiëntie.
- Inzicht in genfuncties kan leiden tot nieuwe inzichten in de neurobiologie.
Doel van de studie
- Om een gen van belang in hNSPCs te introduceren.
- Om de functie van genen in een neurale context te verduidelijken.
- Om een betrouwbaar protocol voor onderzoekers te bieden.
Gebruikte methoden
- Celdissociatie met gebruik van een buffer.
- Tellen van cellen om een hoge dichtheid te garanderen.
- Gebruik van het Nucleofector-apparaat voor electroporatie.
- Transfecteren van menselijke neurale precursorcellen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle transfectie van hNSPCs.
- Een hoge celdichtheid is cruciaal voor een effectieve transfectie.
- Het protocol demonstreert reproduceerbaarheid in de resultaten.
- Faciliteert verdere studies naar genfunctie.
Conclusies
- Het protocol is effectief voor gentransfectie in hNSPCs.
- Biedt een basis voor toekomstig neurowetenschappelijk onderzoek.
- Verbetert het begrip van genrollen bij de neurale ontwikkeling.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Het transfecteren van menselijke neurale stam-/precursorcellen (hNSPCs) blijft een knelpunt bij de validatie van targets in de neurowetenschappen vanwege de lage efficiëntie en levensvatbaarheid bij conventionele methoden. Het beschreven Nucleofector-elektroporatieprotocol maakt betrouwbare genoverdracht mogelijk met een initiële transfectie-efficiëntie van ~35% en een stabiele efficiëntie van ~70%, wat bijdraagt aan mechanische risicoreductie in de vroege ontdekkingsfase. Deze aanpak verbetert het voorspellende vertrouwen bij het onderzoeken van signaalpaden en de functionele targetvalidatie in modellen van neurodegeneratieve ziekten.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt functionele analyse van therapeutische targets mogelijk in een fysiologisch relevant menselijk neuraal systeem.
- Operationele waarde: Behaalt een hoge transfectie-efficiëntie zonder de tijdlijnen van virale vectorproductie of zorgen over biosafety.
- Predictieve waarde: Ondersteunt het minimaliseren van risico's bij targets door genmodulatie te koppelen aan neurale fenotypes in een schaalbaar formaat.
Screening en assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatief meetbare resultaten (bijv. GFP-expressie) voor dosis-respons- en fenotypische screening.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van gestandaardiseerde electroporatieparameters en een geoptimaliseerde buffer voor reproduceerbare resultaten over verschillende experimenten heen.
- Assay-gereedheid: Produceert stabiel getransfecteerde cellen die geschikt zijn voor langetermijnontwikkeling van assays en studies naar target engagement.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Maakt gebruik van primaire menselijke neurale cellen, wat de relevantie voor menselijke ziekte-mechanismen vergroot ten opzichte van geïmmortaliseerde cellijnen.
- Preklinische Modellering: Maakt de creatie van isogene neurale modellen mogelijk voor target-validatie en studies naar het werkingsmechanisme.
- Risico-gecorrigeerde Vooruitgang: Faciliteert een vroege beoordeling van de effecten van target-modulatie voordat men overgaat tot in vivo-modellen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De Nucleofector-transfectiemethode past binnen het vroege stadium van het ontdekkingscontinuüm en ondersteunt target-validatie tot en met lead-identificatie door betrouwbare genmodulatie mogelijk te maken in ziekterelevante menselijke neurale cellen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetesten en het verduidelijken van signaalpaden via efficiënte genoverexpressie of knockdown in hNSPCs.
- Screening: Levert assay-klare cellen met kwantificeerbare transfectiemetrieken voor compoundscreening en targetvalidatie.
- Analytiek: Maakt fluorescentie-gebaseerde read-outs mogelijk (bijv. GFP) om de transfectie-efficiëntie te kwantificeren en te correleren met fenotypische uitkomsten.
- Translationeel onderzoek: Maakt gebruik van primaire menselijke cellen om de translationele getrouwheid te verbeteren van ontdekking naar preklinische validatie.
- Bedrijfsbrede herbruikbaarheid: Vestigt een gestandaardiseerd, herbruikbaar transfectieplatform voor meerdere targets en programma's binnen neurowetenschappelijke ontdekkingen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in de validatie van targets door efficiënte, reproduceerbare genlevering in primaire menselijke neurale cellen.
- Operationele waarde: Elimineert de noodzaak voor de productie van virale vectoren, waardoor tijdlijnen en biosafety-overhead worden verminderd.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege functionele beoordeling van targets in een mensrelevant systeem mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door biologische ambiguïteit in het targetmechanisme te verminderen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in primaire celkweek en optimalisatie van elektroporatie.
- Afhankelijk van toegang tot een Nucleofector-apparaat en celtype-specifieke transfectie-oplossingen.
- Vereist standaardisatie van celdichtheid en DNA-concentratie tussen gebruikers en laboratoria.
- Houdt rekening met aanpassingen bij uitbreiding naar andere primaire neurale of niet-neurale celtypen.
- Beperkt door de noodzaak van een hoge celinput en onmiddellijke behandeling na transfectie om de levensvatbaarheid te behouden.
