Name: Corticale Neurogenese: Overstappen van Vooruitgang in het Laboratorium voor Cell-gebaseerde therapieën (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Leer in utero electroporatie voor corticale neurogenese en neuronmigratie. Deze methode maakt gain- en loss-of-function-experimenten mogelijk om genfunctie in neurale stamcellen te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs hebben niets te melden.

corticale neurogenese: overstappen van vooruitgang in het laboratorium voor cell-gebaseerde therapieën

Cortical Neurogenesis: Transitioning from Advances in the Laboratory to Cell-Based Therapies

Corticale Neurogenese: Overstappen van Vooruitgang in het Laboratorium voor Cell-gebaseerde therapieën

Mijn naam is Arnold Krickstein. Ik ben de directeur van het Institute of Regeneration Medicine hier aan de UCSF, en mijn interessegebied ligt bij de ontwikkelingsneurobiologie. Specifiek zijn we zeer geïnteresseerd in de vroege stadia van de corticale ontwikkeling; we hebben gekeken naar neurale stam- en progenitorcellen en bestudeerd hoe zij neuronen genereren, hoe deze neuronen migreren en hoe zij beginnen met het vormen van circuits in de ontwikkelende hersenen, in het bijzonder in de cortex.Ik denk dat de komst van in utero electroporatie een van de transformerende technologieën is geweest die door SDO en zijn collega's zijn geïntroduceerd voor het bestuderen van de vroege stadia van de hersenontwikkeling, omdat dit het mogelijk maakt om gain- en loss-of-function-experimenten uit te voeren voor een breed scala aan genen. Dit kan relatief eenvoudig worden gedaan door deze genen direct te introduceren in de neurale stam- en progenitorcellen die neuronen vormen tijdens de vroege corticale ontwikkeling. De techniek bestaat in essentie uit het injecteren van DNA in de vorm van een plasmide in de cerebrale ventrikels van een dier in het embryonale stadium, gevolgd door het toepassen van een korte elektrische stroom die deze plasmiden de cellen in drijft die de ventrikel bekleden; dit zijn de radiale glia/neuroepitheliale cellen die vervolgens neuronen en uiteindelijk gliacellen produceren.Dit kan onder meer het gebruik omvatten van short interfering RNA's die de expressie van specifieke genen kunnen downreguleren of uitschakelen (knockdown), of u kunt specifieke genproducten direct overexpresseren. Beide sets experimenten kijken naar complementaire effecten op de hersenen in ontwikkeling. De doelmoleculen kunnen vrijwel alles omvatten dat betrokken is bij de vroege stadia van de hersenontwikkeling of zelfs later, wat betreft de stadia van synaptische ontwikkeling of rijping.De komst van deze techniek heeft al een grote invloed gehad op studies naar de hersenontwikkeling en belooft in de nabije toekomst een nog grotere impact te hebben. De cellen die de ventrikels bekleden en die uiteindelijk alle neuronen en gliacellen in de hersenen vormen, beginnen als neuro-epitheelcellen. Maar rond de tijd dat de neuronen zich beginnen te ontwikkelen, veranderen ze in of beginnen ze te transformeren naar een soort gliacel die bekendstaat als een radiale gliacel.Ze maken gespecialiseerde contacten met bloedvaten en sturen de migratie van jonge neuronen. Rond die tijd beginnen ze een interessante reeks verschillende typen delingen uit te voeren. Ze maken een soort symmetrische progenitor-deling wanneer ze meer kopieën van zichzelf produceren, wat betekent dat ze bij elke deling twee radiogliaalcellen produceren.Daarnaast maken ze asymmetrische neurogene delingen waarbij ze delen en zichzelf vernieuwen, en waarbij er bij elke celcyclus een dochtercel wordt gegenereerd die een neuron wordt. Maar het blijkt ook dat ze een zeer interessant derde type deling maken dat asymmetrisch is in die zin dat de dochtercellen verschillend zijn. De ene is een zelfvernieuwde radiale gliacel en de andere wordt een ander type progenitorcel.We noemen dit een intermediaire progenitor die wegmigreert van het ventrikel en vervolgens over het algemeen deelt in een andere proliferatieve zone, bekend als de subventriculaire zone. De methode van in utero electroporatie is een handige manier om deze knockdown- of overexpressie-DNA's in de radiogliaalcellen te introduceren tijdens de stadia waarin zij deze verschillende soorten delingen uitvoeren. We hebben ook gebruikgemaakt van een retrovirus dat groen fluorescent eiwit tot expressie brengt als lijnmarker, door dit retrovirus-marker in de ventrikels van embryo's van dezelfde leeftijd te injecteren, waarna we het lot van die individueel gelabelde cellen kunnen volgen terwijl ze delen en klonen van dochtercellen genereren.Met tijdmeting-beeldvorming (time-lapse imaging) die we uitvoeren in plakculturen, kunnen we vervolgens het uiteindelijke lot van deze cellen volgen of traceren terwijl ze naar de cortex migreren. Hoewel men een tijd lang heeft gedacht dat de ventriculaire zone de primaire bron van neurogenese was in de ontwikkelende hersenen, is de subventriculaire zone, ten minste in het embryo, steeds meer gewaardeerd als een bron voor aanzienlijke hoeveelheden neurogenese. Wat we hebben ontdekt is dat in de subventriculaire zone de intermediaire progenitors, die zelf voortkomen uit radialia glia in de ventriculaire zone, daarheen migreren en zich symmetrisch delen, óf om meer zelfvernieuwende intermediaire progenitors te produceren, óf in een symmetrische terminale deling om paren neuronen te produceren die vervolgens naar de cortex migreren.De subventriculaire zone blijkt een zeer belangrijke en interessante zone van neurogenese te zijn in het embryonale of ontwikkelende brein. Bovendien worden deze intermediaire progenitorcellen, terwijl ze in die subventriculaire zone verblijven, multipolaire cellen en lijken ze het vermogen te hebben om tangentieel binnen die zone te bewegen. Dat zou kunnen verklaren waarom er een verspreiding van celklonen is waargenomen in eerdere studies, bijvoorbeeld enige tijd geleden door Walsh en S Cepco in de ontwikkelende cortex, waarbij ook retrovirussen werden gebruikt om het lot van die cellen te markeren.Er zijn bijvoorbeeld een aantal interessante genen betrokken bij zowel neurogenese als neuronale migratie. In ons laboratorium hebben we de gap junction-eiwitten bestudeerd, de verbindingen die ten grondslag liggen aan de vorming van bekende gap junction-kanalen. Interessant genoeg hebben we ontdekt dat de cellen die langs radiale glia migreren deze gap junctions niet gebruiken als communicatiekanalen, maar feitelijk als adhesiemoleculen om deze neuronen en migrerende cellen fysiek te laten hechten aan de radiale vezels.En die studies werden feitelijk uitgevoerd met gebruik van siRNAs die de expressie van specifieke verbindingen onderdrukten. Bijvoorbeeld verbinding 43, die zeer sterk tot expressie komt door radiale glia en ook door hun dochterneuronen en hun intermediaire progenitorcellen. Veel van de zogenaamde volwassen stamcellen die afkomstig zijn uit het foetale brein, zijn in feite waarschijnlijk radiale glia die in kweek kunnen worden uitgebreid wanneer ze worden behandeld met de juiste groeifactoren, zoals bijvoorbeeld bFGF.Maar naast die radialia glia kunnen de intermediaire progenitorcellen een zeer interessant doelwit blijken te zijn voor stamcelonderzoek, omdat we geloven dat zij in feite neuronen van een zeer beperkt celtype produceren. Wanneer een strategie bijvoorbeeld gericht is op het creëren van grote aantallen van een zeer specifiek type neuronale cellen, zou het identificeren en isoleren van de intermediaire progenitorcellen die verantwoordelijk zijn voor het genereren van dat specifieke celtype waarschijnlijk een veel betere aanpak zijn dan, bijvoorbeeld, het uitbreiden van aantallen radialia glia, die een hele verscheidenheid aan verschillende celtypen kunnen produceren. In feite blijkt uit in vitro studies, waarbij embryonale stamcellijnen worden uitgebreid en vervolgens individuele neuronen uit die embryonale stamcelbronnen worden gegenereerd, dat de meeste van die lijnen een stadium doorlopen dat mogelijk zelfs een verplichte epitheliale of radialia glia-achtig fase is voordat er daadwerkelijk neuronen worden gegenereerd.Zo zijn bijvoorbeeld de protocollen die door Austin Smith zijn gebruikt om neuronen of neurale stamcellen te genereren, eigenlijk zeer vergelijkbaar met radiale glia. Ze ondergaan kinetische nucleaire migratie. Ze vertonen expressie van radiale gliale transcriptiefactoren en markers, en ze genereren neuronen en astrocyten op vrijwel dezelfde wijze als radiale glia dat doen.En op soortige wijze hebben Loren Ser en anderen menselijke embryonale stamcellen gebruikt en ontdekt dat deze rozetten vormen; ze assembleren zichzelf in vitro tot een neuro-epitheliale structuur voordat ze daadwerkelijk neuronen genereren. En ook daar zijn die rozetten samengesteld uit cellen die sterk lijken op radialia glia. Het idee dat deze radialia glia een soort neurale stamcel zijn, wordt naar mijn mening ondersteund door dat soort in vitro bewijs.Voor het begin van de neurogenese vindt er al een regionale patroonvorming plaats in de gehele ventriculaire zone van alle ventrikels en zelfs door het gehele ruggenmerg. De patroonvormingsgenen die in specifieke regio's tot expressie komen, beperken waarschijnlijk al het lot van de dochtercellen die daar worden geproduceerd. Als u bijvoorbeeld excitatoire pyramidale cellen wilt genereren, produceert de dorsale corticale radiale glia dat celtype; als u interneuronen wilt produceren, moet u mogelijk de cellen in de ganglion eminence gebruiken, aangezien deze die interneuronen of oligodendrocyten en dergelijke produceren.Wanneer uw strategie in het stamcelonderzoek voor de behandeling van een ziekte dus het creëren van grote hoeveelheden cellen van een specifiek type betreft, zoals een bepaald soort interneuron of een bepaalde soort excitatoire projectiecel, dan zullen ontwikkelingsstudies die de verschillen tussen neurogenese in deze verschillende hersengebieden beginnen te onthullen, waarschijnlijk aanwijzingen verschaffen die uiteindelijk bruikbaar zijn voor het ontwerpen van strategieën om neuronen van een specifiek celtype uit te breiden, bijvoorbeeld voor vervangende celtherapieën. De terminologie van regeneratie of regeneratieve geneeskunde suggereert in feite het vermogen om organen te regenereren, en ik denk dat het grote publiek stamcellen ziet als een methode voor het vervangen van cellen in beschadigde weefsels.Maar in werkelijkheid denk ik dat de eerste behandelingen die waarschijnlijk voortkomen uit stamcelonderzoek het gebruik van stamcellen op andere, wellicht creatievere manieren zullen omvatten. Denk bijvoorbeeld aan het gebruik van stamcelonderzoek en een laboratorium waarin u middels high-throughput methoden kunt screenen op geneesmiddelen door ziekten te modelleren met menselijke cellen in plaats van bijvoorbeeld muiscellen in het laboratorium. En wat betreft celtherapieën denk ik dat dit grotendeels, sterker nog, ik denk dat het al is begonnen, zal worden ingezet als transportmiddel; door bijvoorbeeld gebruik te maken van het vermogen van bepaalde stamcellen om naar gebieden met letsel of ziekte te migreren en daar een payload af te leveren, zoals een gen, een genproduct of een ontbrekend enzym, enzovoort.Ik denk dat de toepassing waarbij de cellen niet integreren in reeds bestaande orgaanstructuren makkelijker te realiseren is. Sommige van de vroegere voorbeelden van celtherapieën zullen waarschijnlijk die aanpak gebruiken in plaats van daadwerkelijke celvervanging. De huidige federale beperkingen op het gebruik van NIH-fondsen voor slechts een klein aantal menselijke embryonale stamcellen hebben een dempend effect gehad op het vakgebied.Het heeft enkele jonge onderzoekers uit het vakgebied gehouden en anderen verhinderd om de potentiële bruikbaarheid van deze embryonale stamcellen in het laboratorium daadwerkelijk te onderzoeken. Er zijn pogingen gedaan om deze beperkingen te liberaliseren. Zoals de meeste van uw kijkers waarschijnlijk weten, heeft de president één wetsvoorstel veto's en, sorry, hij staat op het punt om een ander te vetoën.Onze hoop is dat deze richtlijnen zullen veranderen en dat het mogelijk wordt om NIH-financiering te gebruiken voor het bestuderen van een breed scala aan nieuw ontwikkelde stamcellijnen, waarvan vele voordelen hebben ten opzichte van de oorspronkelijke lijnen die vóór 2001 zijn gecreëerd. Maar zelfs als dat financieringsverbod wordt opgeheven, zou dat waarschijnlijk niet onmiddellijk leiden tot een toename van de financiering voor dat type onderzoek. En omdat dit wetsvoorstel, dat bijvoorbeeld in het Congres is voorgesteld, geen financierings- of budgetwet is, zal het een impact hebben in de zin dat het voor onderzoekers zoals wij makkelijker wordt om werk met zogenaamde goedgekeurde en niet-goedgekeurde lijnen in dezelfde onderzoeksruimte, in hetzelfde laboratorium, met gebruik van dezelfde apparatuur of door het delen van dezelfde middelen, te integreren.Dat alles zou een grote verbetering zijn, maar het is onwaarschijnlijk dat dit zal leiden tot een grote instroom van feitelijke ondersteuning in de vorm van onderzoeksgelden voor dat soort activiteiten. Daarvoor denk ik dat we nog steeds aangewezen zullen zijn op private bronnen, inclusief staatsfinanciering, wat hier in Californië echt een zegen is voor onderzoekers in het veld van stamcellen. Naast Californië volgen andere staten zoals New York, Connecticut en Massachusetts dit voorbeeld en zullen zij binnenkort hun eigen staatsinitiatieven voor stamcelonderzoek financieren.En ik denk dat dit een belangrijke motor zal zijn voor het stimuleren van onderzoek in dit veld voor de voorzienbare toekomst, ongeacht of het beleid van de NIH nu snel verandert of niet.

cortical-neurogenesis-transitioning-from-advances-laboratory-to-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Neurale stamcellen geoogst uit de volwassen hersenen worden steeds gebruikt in toepassingen, variërend van het fundamenteel onderzoek van de ontwikkeling van het zenuwstelsel aan het verkennen van potentiële klinische toepassingen in de regeneratieve geneeskunde. Dit maakt strenge controle op de isolatie en kweekomstandigheden gebruikt om deze cellen cruciaal voor experimentele resultaten goed groeien.

Groeiende neurale stamcellen uit Conventionele en Niet-conventionele Regio&#39;s van de Adult knaagdierhersenen

Fenotypisch wild-type astrocyten en neurale stamcellen die zijn geoogst uit muizen die zijn gemodificeerd met gefloxte, conditionele oncogeen allelen en getransformeerd via virale Cre-gemedieerde recombinatie, kunnen worden gebruikt om de pathogenese van astrocytomen in vitro en in vivo te modelleren door orthotopische injectie van getransformeerde cellen in hersenen van syngene, immuuncompetente nestgenoten.

Modeling Astrocytoom Pathogenese In Vitro En In Vivo Met behulp van corticale Astrocyten of neurale stamcellen uit Conditional, genetisch gemanipuleerde muizen

Deze studie beschrijft een experimenteel platform om snel gemanipuleerde stamcellen en hun gedrag te karakteriseren voordat ze worden toegepast in langetermijn in vivo transplantatiestudies voor redding en herstel van het zenuwstelsel.

Hoge doorvoer analyse van volwassen stamcellen ontwikkeld voor toediening van therapeutische factoren voor Neuroprotective Strategies

Levende imaging is een krachtig hulpmiddel om te studeren van cellulaire gedrag in real-time. Hier beschrijven we een protocol voor time-lapse video-microscopie van primaire hersenschors cellen waarmee een gedetailleerd onderzoek van de fasen die onder de progressie van de bloedlijn van primaire neurale stamcellen gedifferentieerde neuronen en glia werden.

Live beeldvorming van primaire hersenschors cellen met behulp van een systeem van 2D cultuur

Directe neuronale herprogrammering genereert neuronen die de leeftijd van de begincel van somatische handhaven. Hier beschrijven we een enkele vector-gebaseerde methode voor het genereren van geïnduceerde neuronen van dermale fibroblasten van volwassen menselijke donors verlangde.

Eenvoudige generatie van de cultuur van een hoog rendement van geïnduceerde neuronen van menselijke volwassen huid fibroblasten

Het doel van dit protocol is om een aanpak te beschrijven voor het analyseren van gedrag van volwassen neurale stam/voorlopercellen in reactie op chemogenetische manipulatie van een specifiek lokaal neuraal circuit.

Asgezegde circuit specifieke regulering van volwassen Hippocampal neurale precursor cellen

Hier presenteren we een protocol, ontworpen om gebruik te maken van chemogenetische hulpmiddelen om de activiteit van corticale Interneuron voorlopercellen getransplanteerd in de cortex van vroege postnatale muizen te manipuleren.

Transplantatie van Chemogenetisch gemanipuleerde corticale Interneuron progenitors in vroege postnatale Muizenhersenen

We beschrijven een protocol om menselijke huid-afgeleide fibroblasten te herprogrammeren in geïnduceerde Neuronal Progenitor Cells (iNPC's), en hun daaropvolgende differentiatie in geïnduceerde Astrocyten (iA's). Deze methode leidt tot een snelle en reproduceerbare generatie van iNPC's en iA's in grote hoeveelheden.

In vitro modellering voor neurologische ziekten met behulp van directe conversie van fibroblasten naar neuronale voorlopercellen en differentiatie in astrocyten

In deze studie bieden we een gedetailleerde techniek voor een eenvoudig maar robuust corticale organoïde kweeksysteem met behulp van standaard feedervrije hPSC-culturen. Dit is een snel, efficiënt en reproduceerbaar protocol voor het genereren van organoïden die aspecten van hersensenescentie in vitro modelleren.

Robuuste en zeer reproduceerbare generatie corticale hersenorganoïden voor het modelleren van neuronale senescentie in de hersenen in vitro

Dit protocol beschrijft organotypische culturen op lange termijn van de volwassen menselijke cortex in combinatie met ex vivo intracorticale transplantatie van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide corticale voorlopers, die een nieuwe methodologie presenteren om op stamcellen gebaseerde therapieën voor menselijke neurodegeneratieve aandoeningen verder te testen.

Organotypische culturen van volwassen menselijke cortex als een ex vivo model voor menselijke stamceltransplantatie en validatie

Hier beschrijven we een protocol voor de transplantatie en het volgen van gelabelde neurale cellen in menselijke cerebrale organoïden.

Een menselijk cerebraal organoïdemodel van neurale celtransplantatie

Leer in utero electroporatie voor corticale neurogenese en neuronmigratie. Deze methode maakt gain- en loss-of-function-experimenten mogelijk om genfunctie in neurale stamcellen te bestuderen.

Corticale Neurogenese: Overstappen van Vooruitgang in het Laboratorium voor Cell-gebaseerde therapieën

Meer video's verkennen