Micropatterned Oppervlakken aan hyaluronzuur Interacties met kanker cellen te bestuderen

Kankerinvasie en -progressie omvatten een modaal celfenotype, dat onder complexe regulatie staat door groeifactoren, cytokinen en componenten van de extracellulaire matrix binnen de tumoromgeving. Hyaluronzuur of HA is een stromale component van de extracellulaire matrix waarvan bekend is dat het de tumorprogressie faciliteert door invasiegroei en angiogenese te bevorderen via de interactie van HA met zijn celoppervlaktereceptor. CD 44 induceert signaleringsgebeurtenissen die de groei, overleving en migratie van tumorcellen stimuleren, waardoor de metastatische verspreiding toeneemt; om de adhesie, migratie en groei van kankercellen op exogeen HA te bestuderen.

Standaard fotolithografie wordt gebruikt om een elastomere stempel met een micropatroon te vervaardigen, die vervolgens wordt gebruikt om een gepatroneerde array van amino-silaanmoleculen op glassubstraten te creëren. Vervolgens wordt carbodiïmidechemie toegepast om HA covalent aan het micropatroon van amino-silaan te binden. Hierdoor ontstaan micropatronen van HA. Gekweekte kankercellen kunnen vervolgens op de HA-micropatronen worden geplaatst, waarna interacties van kankercellen met exogeen hyaluronzuur kunnen worden gevisualiseerd met behulp van lichtmicroscopie, hoge resolutie beeldtechnieken zoals scanning elektronenmicroscopie of immunofluorescentiemicroscopie.

De methode voor het creëren van micropatroon HA-oppervlakken die in dit videoartikel wordt gepresenteerd, kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het kankeronderzoek, zoals het verder verduidelijken van de rol van exogeen hyaluronzuur bij de progressie van kanker. Om een micropatroon Polymethyl Zane- of PDMS-stempel te vervaardigen, die gebruikt zal worden voor het impregneren van glazen objectglazen met HA, begint u met het oppakken van een nieuwe siliciumwafer met een pincet.

Vervolgens boven een laboratoriumspoelbak. Gebruik een spoelfles om de wafer te spoelen met ethanol en droog deze vervolgens met een luchtstroom. Schakel de kamerverlichting uit.

Breng vervolgens met een pincet de wafer over naar een spin-coater. Gebruik een overdrachtspipet om ten minste 80% van het waferoppervlak te bedekken met SU 2025 negatieve fotolak. Voer de spin-coating uit gedurende 10 seconden bij 600 RPM. Draai vervolgens 30 seconden bij 3000 RPM. Breng de met fotolak gecoate wafer over naar een warmteplaat en voer een soft bake uit bij 95 °C gedurende drie minuten. Neem de wafer daarna van de warmteplaat en laat deze één minuut afkoelen.

Plaats een prefab masker met het gewenste patroon bovenop de met fotolak bedekte wafer en bestraal deze 20 seconden met uv-licht. Plaats de wafer vervolgens op een warmteplaat en voer een hard bake uit bij 110 °C gedurende zes minuten.

Zet de lampen aan en haal de wafer van de warmteplaat. Op dit punt moeten er duidelijke patronen zichtbaar zijn met een transferpipet. Spoel de wafer zorgvuldig met SU eight fotolakontwikkelaar na drie spoelbeurten met ontwikkelaaroplossing, en spoel vervolgens met ethanol.

Indien er witte residuen aanwezig zijn, herhaal dan het spoelen met de fotoresist-ontwikkelaarsoplossing of dompel de wafer simpelweg gedurende twee minuten onder in de ontwikkelaarsoplossing en spoel opnieuw met ethanol, was met water en droog met een luchtstroom in een grote whey-boot. Meng de PDMS-elastomeeroplossing en het uithardingsmiddel in een gewichtsverhouding van 10 op 1; voor de hier getoonde wafer is 22 gram voldoende. Giet dit in een centrifugebuis en centrifugeer 5 minuten bij 900 RPM.

Om eventuele luchtbellen te verwijderen, plaatst u de gestructureerde wafer in een Petri-schaal van passende grootte. Giet er voldoende PDMS-oplossing op om de wafer volledig te bedekken met een dikte van ongeveer een kwart inch. Als er bellen op het oppervlak van de wafer aanwezig zijn, plaatst u deze in een vacuümdesiccator tot ze verdwijnen.

Laat de laag een nacht uitharden bij kamertemperatuur om een complementaire elastomere stempel te vormen. Als de PDMS na 12 uur niet volledig is uitgehard, plaats de wafer dan gedurende 30 minuten in een oven bij 60 °C. Verwijder de PDMS voorzichtig van de wafer.

Snijd vervolgens met een scheermes de stempel op de gewenste grootte. Plaats de stempel in een glazen bekerglas met ethanol, bij voorkeur in een plastic houder, en soniciseer gedurende 15 minuten. Wafers kunnen meerdere keren worden gebruikt om nieuwe elastomere stempels te maken om ha covalent te immobiliseren op glazen oppervlakken in gedefinieerde patches.

Begin met het reinigen van alle te gebruiken objectglazen in een plasma-reinigingsapparaat volgens de instructies in de bijbehorende tekst. Nadat de objectglazen zijn gereinigd, worden ze met een pincet uit het plasma-reinigingsapparaat verwijderd. Plaats de objectglazen in een plastic petrischaal en zet deze apart voor later gebruik.

Bereid vervolgens in een polystyreen centrifugebuis van 15 milliliter de aminocline-oplossing voor die op de glazen objectglas wordt gestempeld om HA te binden. Maak een verse 3% volume/volume oplossing van aminopropyltrimethoxysilaan of A-P-T-M-S in 95% volume/volume ethanol voor een totaalvolume van vijf milliliter en laat de oplossing vijf minuten reageren bij kamertemperatuur.

Gedurende deze periode wordt A-P-T-M-S door hydrolyse omgezet in een silanol. Plaats vervolgens de PDMS-stempel met het patroon naar boven op de houder van een spin-coater, waarbij u alleen de zijkanten aanraakt. Gebruik een transferpipet om het patroonoppervlak te bedekken met A-P-T-M-S.

Breng vervolgens A-P-T-M-S via spin-coating aan op het oppervlak van de stempel bij 3.500 RPM gedurende 30 seconden. Nadat de PDMS-stempel uit de spin-coater is gehaald, wordt deze omgekeerd zodat de zijde met het patroon naar beneden is gericht. Plaats één uiteinde van de PDMS-stempel in het midden van de glazen objectglas en druk voorzichtig aan, zodat de gehele stempel gedurende één minuut in contact is met het objectglas. Verwijder vervolgens voorzichtig de PDMS-stempel en laat het met A-P-T-M-S gepatroneerde objectglas op kamertemperatuur rusten.

Spoel na 30 minuten het patroonoppervlak af met ethanol en droog het met een luchtstroom. Sonicate de PDMS-stempel gedurende 15 minuten om eventueel overtollig A-P-T-M-S te verwijderen. Plaats de objectglazen vervolgens gedurende één uur op een warmteplaat bij 115 °C om de oppervlakken te verhitten en overtollig water te verwijderen.

Spoel af met ethanol en droog met lucht aan de hand van een pincet. Verplaats de patroondia naar een glazen petrischaal. Gebruik een transferpipet om de glazen dia volledig te bedekken met een vers bereide polyethyleenglycol- of PEG-cline-oplossing, die zal dienen als een niet-adhesieve regio rondom de patronen.

Giet na een incubatie van 45 minuten bij 75 °C de overtollige peg-zoutoplossing af. Spoel vervolgens, terwijl u de glazen objectglasplaatjes met een pincet vasthoudt, het oppervlak van de gepatroneerde objectglasplaatjes af met tolueen en daarna opnieuw met water, en droog ze vervolgens met een luchtstroom. Plaats de plaatjes in een bevochtigde bewaarbox voor objectglasplaatjes.

Plaats de doos vervolgens in een biologische veiligheidskabinet en schakel de UV-lamp één uur in om kiemdodende bestraling uit te voeren. Werk vanaf dit punt verder in de biologische veiligheidskabinet. Om buiten de kap steriliteit te behouden, bereidt u één milliliter steriele waterige HA-oplossing voor met een concentratie van 10 millimolair.

1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide of EDC 5 mM en hydroxy CIN aide 50 µg/mL. Steriele fluoresceïne-gelabelde HA EDC is een cross-linking agent met nul lengte die reageert met HA-carboxylgroepen om amine-reactieve intermediairen te vormen. Omdat dit intermediair gevoelig is voor hydrolyse, wordt NHS toegevoegd om de efficiëntie van de carbodiïdereactie te verhogen.

Breng vervolgens aliquots van 200 µL steriele HA-oplossing aan op het gepatroonde glas totdat het gepatroonde gebied bedekt is. Sluit daarna de objectglaasjesdoos om de glaasjes tegen licht te beschermen. De gepatroonde substraten moeten ongestoord gedurende 16 tot 24 uur in de zuurkast blijven, terwijl de HA-oplossing interageert met het micropatroonde A-P-T-M-S-A, waarbij een stabiele MI-binding wordt gevormd tussen het HA-intermediair en de primaire amine van A-P-T-M-S.

Gebruik de volgende dag een APA-pasteurpipet om de HA-oplossing af te zuigen. Was de glaasjes met PBS en bedek het oppervlak vervolgens gedurende één uur met 1% BSA in PBS. Het oppervlak is nu klaar voor celkweek.

Plaats HA-micropatroonoppervlakken in een steriele petrischaal om te cultiveren op HA-micropatroonoppervlakken. Zaai enkelcel-suspensies van kankercellen met dichtheden tussen 0,4 en 1 × 10⁶ kankercellen per 18,75 cm² glasoppervlak in 1 mL celmedium om het oppervlak van het glazen objectglas te bedekken; plaats de cellen vervolgens voorzichtig in een bevochtigde incubator bij 37 °C met 5% CO2. Let erop dat het medium niet overstroomt; celadhesie vindt doorgaans binnen 24 uur plaats en kan worden waargenomen met een omgekeerde lichtmicroscoop.

Celcultuuroppervlakken kunnen tot vijf dagen worden onderhouden. Vervang onder standaard incubatorcondities om de dag het medium. De celmorfologie en groei kunnen worden waargenomen met een omgekeerde lichtmicroscoop.

Aanvullende cellulaire assays kunnen vervolgens worden toegepast om de respons op het HA-oppervlak in het hier getoonde voorbeeld te analyseren. HA-patroonoppervlak gevisualiseerd met een fluorescentiemicroscoop en afbeelding. J fluorescentie-intensiteitsanalyse demonstreert de demobilisatie van het patroon van ha.

De HA-micropatroonoppervlakken maken het mogelijk om de interacties van kankercellen met exogeen HA te bestuderen. Hier wordt de adhesie van kankercellen op HA-micropatroonoppervlakken getoond. Zowel colon- als borstcarcinoomcellen hechtten na 24 uur cultuur bij voorkeur aan de HA-patches. Hoogresolutie-beeldvorming met behulp van scanningelektronenmicroscopie kan worden gebruikt om de interacties van gecultiveerde cellen met geïmmobiliseerde HA-oppervlakken te analyseren.

In deze scanning-elektronenmicrografie is de interactie van dikkedarmkankercellen met HA te zien; rechts wordt een hogere vergroting getoond. Borstkankercellen gekweekt op HA-oppervlakken worden hier opnieuw getoond, waarbij rechts wederom een hogere vergroting te zien is. Deze analyse demonstreert duidelijk de aanwezigheid van adhesieve uitstulpingen die de spreiding van kankercellen op HA-micropatronen bevorderen.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u HA micro-patroonservices voorbereidt en toepast om de respons van kankercellen te bestuderen.