Name: Mechanische stimulatie van stamcellen Met behulp van Cyclische uniaxiale Strain (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 25 min 12 s
Description: Leer mechanische stimulatie van stamcellen met cyclische uniaxiale rek voor weefselengineering. Dit protocol gebruikt een aangepaste bioreactor om celgedrag te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dag 0 - Sterilisatie voor de dag van het experiment <ol><li> Zet materialen in plastic kuip en steriliseren met alcohol 70% gedurende 2 uur: <ul><li> Kamers </li><li> Deksels </li><li> Frames (alle 3 stuks) </li><li> Schroeven </li><li> Rubberen dichtingen </li><li> Pincet </li><li> Schaar </li><li> Hex sleutels </li></ul></li><li> Schone membranen met Aquet zeep en gedestilleerd water. </li><li> Ultrasone trillingen membranen in 70% alcohol gedurende 10 minuten. </li><li> Plaats de schone membranen in plastic vierkant gerechten. Bij gebruik van patronen membranen, ervoor zorgen dat de patroon zijde naar boven (spray alcohol op een zijde van het membraan en horloge voor de vloeistof af te rennen de groeven). </li><li> Laat membranen bedekt met alcohol 70% gedurende 2 uur. </li><li> Pakket handschoenen in aluminium folie voor autoclaaf morgenochtend. </li><li> Maak 2% (gewicht / volume) gelatine-oplossing (2g/100mL) in gedestilleerd water voor autoclaaf morgen. </li><li> Na de 2 uur sterilisatie in 70% alcohol, plaats alle polymere materialen en membranen (niet autoclaveerbaar materialen) in de kap voor de overnachting UV: <ul><li> Kamers </li><li> Deksels </li><li> Frames (alle 3 stuks) </li><li> Membranen </li></ul></li><li> Voor resterende materialen in autoclaveerbaar zak: <ul><li> Schroeven </li><li> Rubberen dichtingen </li><li> Pincet </li><li> Schaar </li><li> Hex sleutels </li></ul></li></ol> Dag 1 - Montage van stretch kamers <ol><li> Autoclaaf tang, schaar, hex sleutels, schroeven, pakkingen, handschoenen, en gelatine met behulp van kleine autoclaaf bij 240 ° C gedurende 20 minuten in totaal </li><li> Verwijder de membranen van UV en behandelen met O 2 plasma (een patroon naar boven) voor ~ 1 minuut. </li><li> In TC kap, te dekken patroon gebied van plasma behandeld membranen met gelatine. Coat 30 voor minuten onder UV. </li><li> Was elk membraan met PBS 2X. Na de 2e wassen, laat wat PBS op de membranen te houden gladde, voor eenvoudiger assemblage in de kamers. (Moet ook gebruik maken van dit PBS om de dichtingen te smeren voor eenvoudiger montage). </li><li> Assembleren membranen in kamers (draag handschoenen geautoclaveerd tijdens de montage) <ol><li> Sluit de twee belangrijkste stukken van het frame met een enkele schroef. </li><li> Flip de frame over en plaats een membraan op de top, zodat de gelatine-gecoate zijde gezichten in de richting van het frame (het patroon gebied moet worden in het midden). </li><li> Bevestig de membraan aan het frame met behulp van een pakking aan beide kanten. </li><li> Druk op de afdichtingen in, met behulp van zachte, gelijkmatige druk, om niet aan het membraan rippen. </li></ol></li><li> Bevestig gemonteerd frame om T-bar. </li><li> Flip het frame en plaats in de kamer op zijn kop. UV achterkant van het frame en membraan gedurende 30 minuten </li><li> Weer flip het frame, en schroef in kamers (geen verandering voor de controle kamer, maar voor stretch kamer, moeten twee schroeven te gebruiken om het eindstuk van het frame aan de onderkant van de kamer hechten, en de noodzaak om de enkele schroef die is te verwijderen die de twee stukken van het frame samen). UV voorkant gedurende 30 minuten. Zorg ervoor dat de membranen volledig droog zijn voordat u doorgaat naar de volgende stap, of anders de cel oplossing kan off slip tijdens het zaaien. </li><li> Zaad cellen. Oppervlakte van een plaat = Ruimte van 3 membranen, dus gebruik 1 / 3 van een confluente plaat per membraan. Gebruik 1 ml oplossing per cel membraan. Nog meer dan 1,5 ml zal het moeilijk zijn om de oplossing te houden. Zet cel oplossing alleen op patronen gebied, en gebruik de pipet tip om de oplossing rond te verspreiden. Cover kamers en laat cellen hechten gedurende 30 minuten RT in de motorkap. </li><li> Verhuizen kamers te incubator en laat de cellen hechten voor een meer uren. Wees ZEER voorzichtig het verplaatsen van de kamers om te voorkomen dat mobiele oplossing afglijden! De cellen in die kamer zal worden geruïneerd als de oplossing valt op dit punt. </li><li> Keer terug naar kamer kap en voeg 20 ml media. </li><li> Plaats kamers in alcohol gereinigd kuip die is afgedekt met aluminiumfolie (ook bespoten met alcohol). Verhuizen kamers te incubator (10% CO 2) stretch. </li><li> Veilige kamers in stretch machine. Laat &#39;s nachts verder cellen hechten, en start languit op de volgende dag. (Opmerking: Als de kamers in de rekken machine, vergeet niet om de machine te vergrendelen in de &quot;nul&quot; positie voor het plaatsen van kamers, en vervolgens de rubberen band rond de versnellingen draai Vergeet niet om de tandwielen te ontgrendelen voordat u de machine.). </li></ol>

<ol><li>Banes, A. J., Gilbert, J., Taylor, D., Monbureau, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+vacuum-operated+stress-providing+instrument+that+applies+static+or+variable+duration+cyclic+tension+or+compression+to+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A new vacuum-operated stress-providing instrument that applies static or variable duration cyclic tension or compression to cells in vitro.</a> J Cell Sci. 75, 35-42 (1985).</li>
<li>Park, J. S., Chu, J. S., Cheng, C., Chen, F., Chen, D., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+equiaxial+and+uniaxial+strain+on+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Differential effects of equiaxial and uniaxial strain on mesenchymal stem cells.</a> Biotechnol. Bioeng. 88, 359-368 (2004).</li>
<li>Kurpinski, K., Chu, J., Hashi, C., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+mechanosensing+by+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Anisotropic mechanosensing by mesenchymal stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 103, 16095-16100 (2006).</li>
</ol>

Banes et al.. eerst gemeld van het gebruik van een systeem voor mechanische stimulatie van de cellen in vitro met behulp van een flexibele elastomeer substraat om mechanische kracht te leveren aan cellen 1. Sinds die tijd zijn er veel variaties op dit ontwerp is bedacht en benut. Verschillende mechanische stretch-systemen zijn commercieel verkrijgbaar onder de naam &quot;Flexercell&quot; (Flexcell International Corp), terwijl sommige laboratoria gebruiken custom-built-apparaten. In deze video protocol hebben we beschreven de setu...

Opmerkingen over media: Deze eenassige stretch experimenten zijn vatbaar voor besmetting als gevolg van de complexiteit van de bioreactor setup. Om dit tegen te gaan, hebben we geprobeerd diverse combinaties van antibiotica en antischimmelmiddelen. De 1% fungizone meestal niet nodig, samen met een combinatie van antibiotica. Of gebruik maken van een Pen / Strep combinatie, of een combinatie van Kanamycine en Gentamicine (maar probeer niet met behulp van een combinatie / cocktail van drie of meer antibiotica samen als het kan leiden tot resistente mutant bacteriën, en kan ook schadelijk zijn voor de cellen) .

mechanische stimulatie van stamcellen met behulp van cyclische uniaxiale strain

Mechanical Stimulation of Stem Cells Using Cyclic Uniaxial Strain

De rol van mechanische krachten in de ontwikkeling en het onderhoud van de biologische weefsels is goed gedocumenteerd, waaronder een aantal mechanisch geregeld fenomenen zoals botremodellering, spierhypertrofie, en de gladde spiercellen plasticiteit. Echter, de betrokken diensten zijn vaak zeer complex en moeilijk te controleren en in vivo controle. Om beter de effecten van mechanische krachten op cellen, hebben we een in-vitro-methode voor het toepassen van uniaxiale cyclische rek het aanhangend cellen gekweekt op elastische membranen. Deze methode maakt gebruik van een speciaal ontworpen bioreactor met een gemotoriseerde cam-rotor systeem om de gewenste kracht toe te passen. Hier presenteren wij een stap-voor-stap video-protocol laten zien hoe je de verschillende onderdelen van elke &quot;stretch kamer&quot;, met inbegrip van, in dit geval, een siliconen membraan met micropatterned topografie te oriënteren de cellen met de richting van de stam te monteren. We beschrijven ook de procedures voor het steriliseren van de kamers, zaaien cellen op het membraan, latching de kamer in de bioreactor, en het aanpassen van de mechanische parameters (dat wil zeggen de omvang en snelheid van stam). De procedures beschreven in dit protocol zijn specifiek voor het zaaien humane mesenchymale stamcellen op siliconen membranen met 10 micrometer brede kanalen gericht parallel aan de richting van de stam. Echter, de methodes en materialen die in dit systeem zijn flexibel genoeg om een ​​aantal variaties op dit thema biedt plaats aan: reksnelheid, omvang, duur, celtype, membraan topografie, membraan-coating, enz. allemaal worden afgestemd op de gewenste toepassing of resultaat. Dit is een robuuste methode voor het onderzoeken van de effecten van uniaxiale trekspanning toegepast op cellen in vitro.

Het is algemeen bekend dat mechanische krachten in het lichaam kan cel differentiatie en proliferatie beïnvloeden. Hier presenteren wij een video-protocol demonstreren het gebruik van een custom-built bioreactor voor het leveren van uniaxiale cyclische rek aan cellen gekweekt op flexibele substraten micropatterned steel.

Mechanische stimulatie van stamcellen Met behulp van Cyclische uniaxiale Strain

De rol van mechanische krachten bij de ontwikkeling en het behoud van biologische weefsels is goed gedocumenteerd, waaronder verschillende mechanisch gereguleerde ...

Hoi, ik ben Song Li. Ik ben associate professor aan de afdeling Bio Engineering aan UC Berkeley. En ik ben Kyle Kapinsky, PhD-kandidaat, eveneens in bioengineering aan UC Berkeley.Vandaag presenteren we een protocol voor mechanische stimulatie van stamcellen met behulp van cyclische uniaxiale rek. Het onderzoek in ons laboratorium richt zich op cel- en weefseltechnologie, in het bijzonder binnen het cardiovasculaire systeem. We zijn geïnteresseerd in de mechanische biologie van stamcellen vanwege een aantal potentiële toepassingen.Ten eerste willen we het effect van mechanische factoren op de ontwikkeling begrijpen, bijvoorbeeld de embryonale ontwikkeling. Ten tweede zijn we geïnteresseerd in het beheersen van de differentiatie van stamcellen in vitro of in bioreactoren. En ten derde zijn we geïnteresseerd in hoe stamcellen in vivo reageren op cardiovasculaire mechanische factoren, bijvoorbeeld na transplantatie.Om al deze zaken te onderzoeken, maken we gebruik van een speciaal ontworpen bioreactor waarin we cellen op elastische membranen kunnen zaaien en deze membranen vervolgens axiaal kunnen rekken gedurende een gedefinieerde tijd, met een gedefinieerde rek en een gedefinieerde

mechanical-stimulation-of-stem-cells-using-cyclic-uniaxial-strain

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De biosynthese van kraakbeenachtige extracellulaire matrix door chondrocyten kan worden beïnvloed door toepassing van mechanische stimuli. Deze methode beschrijft de technische uitvoering van dynamische druk-stammen chondrocyten ingekapseld in 3D constructen en de evaluatie van geïnduceerde veranderingen in chondrocyte metabolisme.

Mechanische stimulatie van Chondrocyten-agarose Hydrogelen

Dit manuscript presenteert een techniek om de krachten te passen of release op hechtende cellen of weefsels met behulp van unidirectionele stretching.

Stretching micropatterned Cellen op een PDMS membraan

We presenteren in dit artikel een nieuw strekken platform dat kan worden gebruikt om cel responsen op complexe anisotrope biaxiale mechanische vervorming onderzoeken en kwantificeren van de mechanische eigenschappen van biologisch weefsel.

A Novel Stretching platform voor toepassingen in de Cel en Weefsel Mechanobiology

Er werd een nieuw beeldvormingsprotocol ontwikkeld met behulp van een op maat gemaakte motorgestuurde mechanische actuator om de meting van realtime-responsen op mechanische spanning in levende cellen mogelijk te maken. Relevant voor mechanobiologie, kan het systeem spanningen tot 20% toepassen terwijl het realtime beeldvorming met confocale of atomaire krachtmicroscopie mogelijk maakt.

Live cell imaging tijdens Mechanical Stretch

Dit artikel introduceert een eenvoudige benadering aan het verstrekken van niet-continu verlopende statische spanningen op een concentrische cel-beladen hydrogel te reguleren celuitlijning voor weefselengineering.

Kleurovergang stam Chip voor de stimulerende cellulaire gedrag in cel-beladen Hydrogel

Hier presenteren we een protocol voor de opleiding van de bevolking van een cel met behulp van elektrische en mechanische stimuli emuleren cardiale fysiologie. Deze elektromechanische stimulatie verbetert het cardiomyogenic potentieel van de behandelde cellen en is een veelbelovende strategie voor verdere celtherapie, ziekte modellering en drug screening.

Gelijktijdige elektrische en mechanische stimulatie ter verbetering van de cellen Cardiomyogenic potentieel

Een driedimensionaal uniaxiale mechanische stimulatie bioreactorsysteem is een ideale bioreactor voor tenogeen-specifieke differentiatie van pees-afgeleide stamcellen en neo-peesvorming.

Toepassing van een drie-dimensionale uniaxiale mechanische stimulatie bioreactor systeem om tenogene differentiatie van pees-afgeleide stamcellen induceren

Dit artikel beschrijft een procedure om iTenocyten te produceren door iPSC-afgeleide mesenchymale stromale cellen te genereren met gecombineerde overexpressie van Scleraxis met behulp van een lentivirale vector en uniaxiale rek via een 2D-bioreactor.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide iTenocyten via gecombineerde scleraxis-overexpressie en 2D uniaxiale spanning

Hier presenteren we een nieuw apparaat dat isotrope en uniaxiale spanningsgolfvormen op cellen toepast, terwijl het cultuur ondersteunt op substraten met instelbare stijfheid en aanpasbare eiwitmatrices. Dit eenvoudige, economische platform stelt onderzoekers in staat te onderzoeken hoe mechanische signalen de cellulaire functie reguleren in zowel fundamentele studies als ziektegerelateerde contexten.

Een nieuw platform voor in vitro cellulaire stretching en beeldvorming

Dit protocol beschrijft de afleiding van transplanteerbare hematopoietische stamcellen uit muis embryonale stamcellen (ESC) en de daaropvolgende injectie in dodelijk bestraalde ontvangende muizen. In het kort, worden ESC gedifferentieerd embryoid lichamen, die vervolgens besmet zijn met retrovirale HoxB4 en co-gekweekt met OP9 stromale cellen en hematopoietische cytokines.

Afleiding van hematopoietische stamcellen van muriene embryonale stamcellen

Leer mechanische stimulatie van stamcellen met cyclische uniaxiale rek voor weefselengineering. Dit protocol gebruikt een aangepaste bioreactor om celgedrag te bestuderen.

Mechanische stimulatie van stamcellen Met behulp van Cyclische uniaxiale Strain

Meer video's verkennen