Mechanische stimulatie van stamcellen Met behulp van Cyclische uniaxiale Strain

Hoi, ik ben Song Li. Ik ben associate professor aan de afdeling Bio Engineering aan UC Berkeley. En ik ben Kyle Kapinsky, PhD-kandidaat, eveneens in bioengineering aan UC Berkeley.

Vandaag presenteren we een protocol voor mechanische stimulatie van stamcellen met behulp van cyclische uniaxiale rek. Het onderzoek in ons laboratorium richt zich op cel- en weefseltechnologie, in het bijzonder binnen het cardiovasculaire systeem. We zijn geïnteresseerd in de mechanische biologie van stamcellen vanwege een aantal potentiële toepassingen.

Ten eerste willen we het effect van mechanische factoren op de ontwikkeling begrijpen, bijvoorbeeld de embryonale ontwikkeling. Ten tweede zijn we geïnteresseerd in het beheersen van de differentiatie van stamcellen in vitro of in bioreactoren. En ten derde zijn we geïnteresseerd in hoe stamcellen in vivo reageren op cardiovasculaire mechanische factoren, bijvoorbeeld na transplantatie.

Om al deze zaken te onderzoeken, maken we gebruik van een speciaal ontworpen bioreactor waarin we cellen op elastische membranen kunnen zaaien en deze membranen vervolgens axiaal kunnen rekken gedurende een gedefinieerde tijd, met een gedefinieerde rek en een gedefinieerde reksnelheid. We zullen u nu door alle processen leiden die nodig zijn om dit protocol op te zetten. Gebruik hiervoor een laboratoriumzeep; elk detergent is geschikt. Breng zeep aan op beide zijden van het membraan en schrob dit grondig, zodat eventuele resten vuil op het membraan worden verwijderd. Alles wat de cellen zou kunnen beïnvloeden, moet worden verwijderd.

Dit doe ik gewoon met de hand. Zodra ik het gevoel heb dat beide zijden voldoende schoon zijn, spoel ik het nogmaals af met water. Daarna wil ik er zeker van zijn dat het echt steriel is en dat alle micropartikels zijn verwijderd.

Ik plaats dit membraan nu in een bekerglas met 70% alcohol. Zorg dat het membraan volledig is ondergedompeld. Vervolgens plaatst u het volledige bekerglas in een sonicator en laat u dit 10 minuten soniseren.

Nu we het micropatroonmembraan in een vierkante schaal hebben, willen we controleren of de zijde met het patroon inderdaad naar ons toe is gericht. Ik gebruik hiervoor een plantenspuit met alcohol om de bovenkant van dit membraan te besproeien. Je kunt nu zien dat de vloeistof naar beneden loopt, waardoor de groeven zichtbaar worden.

Hiermee is bevestigd dat de patroonzijde naar boven is gericht en dat we de juiste oriëntatie hebben. De overnight UV-stap is nu voltooid en u ziet dat alle kamers, alle frames voor de kamers en de membranen zelf in de zuinige kast staan, waar ze de hele nacht onder UV-licht hebben gestaan. Dit is onze laatste sterilisatiestap.

Wat ik nu ga doen, is alle membranen behandelen met plasma. Ik haal telkens één of twee membranen tegelijk uit hun steriele schaaltjes en transporteer ze naar het plasmatoestel. De vacuümdruk is nu weggevallen, dus ik kan de kamer verwijderen. Nogmaals, dit is niet volledig steriel, maar we zullen het later opnieuw steriliseren.

Werk relatief snel zodat het plasma op de membraan blijft en gebruik hiervoor een pincet. Nogmaals, dit is zeer kritisch: zorg ervoor dat u de membraan niet laat vallen of de oriëntatie ervan verandert.

Op dit moment is alleen het bovenoppervlak plasmabehandeld en ik ga het terugplaatsen in mijn relatief steriele schaal met de plasmabezidelde zijde naar boven, het deksel terugplaatsen en het vervolgens naar de zuurkast transporteren. Nu het membraan is plasmabehandeld, plaats ik het terug in de zuurkast en behandel ik het met 2% gelatine. Dit is het gewicht per volume.

U kunt zien dat de oplossing nog steeds in lijn met het patroon stroomt. Bovendien is het zeer hydrofiel omdat het met plasma is behandeld. De oplossing verspreidt zich dus in plaats van op te bollen; als u het membraan per ongeluk zou omdraaien, zou de oplossing opbollen en wist u dat u de verkeerde zijde gebruikte.

Zorg er dus voor dat de oplossing gelijkmatig wordt verdeeld. Zodra u dit voor alle membranen heeft gedaan, sluit u simpelweg de zuurkast en schakelt u de UV-lamp voor 30 minuten in. Op dit punt is het membraan een half uur lang aan UV-straling blootgesteld met gelatine op het oppervlak, wat voldoende tijd is om de gelatine in het oppervlak te laten absorberen.

Op dit punt wil ik het membraan twee keer wassen met steriele PBS. Meestal breng ik ongeveer 10 ml aan in een vierkante schaal en was ik het membraan door deze voorzichtig met de hand te bewegen; probeer daarbij het oppervlak van het membraan niet aan te raken, en aspireer vervolgens de PBS weg. Ik zal dit nog één keer doen, en na de tweede keer laat ik het membraan in de PBS liggen. Dit helpt om het membraan te smeren, waardoor het gemakkelijker in de kamer te plaatsen is. Als u het membraan laat uitdrogen, is de kans groter dat het scheurt of op een andere manier beschadigt.

Dit is de tweede wasbeurt. Aspireer opnieuw één keer om er zeker van te zijn dat alle gelatine van het membraan is verwijderd. Laat het membraan vervolgens in ongeveer 10 milliliters steriele PBS staan.

En als u met meer dan één membraan werkt, herhaalt u dit proces voor elk membraan. Daarna bent u klaar voor de assemblage. Neem een van de frames; dit bestaat eigenlijk uit twee delen, maar deze zijn meestal vooraf geassembleerd.

Eén onderdeel is hier het T-stuk, en het andere onderdeel is een deel van het frame, waarin het membraan zelf wordt geplaatst. Er is een tweede deel van het frame dat er zo uitziet. En u kunt zien dat dit een gleuf heeft.

Daar wordt de pakking geplaatst om het membraan op zijn plaats te houden. Het tweede deel heeft een tweede gleuf voor een andere pakking, zodat beide zijden van het membraan worden vastgehouden. Plaats dit deel als volgt op het frame, draai het frame om en pak een van de autoclaafschroeven.

Plaats de schroef bovenin; u kunt deze eerst een beetje met de hand aandraaien en vervolgens een van de inbussleutels gebruiken om hem volledig vast te draaien. Op dit punt heb ik dus een geassembleerd frame en het membraan komt aan de onderzijde, zoals ik nu met mijn hand demonstreer. Dat betekent dat ik de zijde wil gebruiken die gepatrooneerd en/of plasmabehandeld en gelatinebehandeld is.

Ik wil dat het die kant op wijst. Als ik het per ongeluk omdraai en de gelatinezijde naar beneden komt te liggen, zal dat een groot probleem vormen voor het experiment. Daarom wil ik bij de assemblage de zijde met het patroon naar boven gericht hebben, maar ik ga het ondersteboven assembleren.

Wanneer ik het membraan eruit haal, moet ik ervoor zorgen dat de zijde met het patroon naar beneden ligt. Ik neem dus één membraan, en onthoud dat de zijde met het patroon nu naar boven is gericht. Ik haal het uit de PBS en leg het als zodanig over het frame.

Beide zijden zijn nu dus ongeveer gelijk. Het is geen probleem om de randen van het membraan met de vingers aan te raken, maar probeer de tegenoverliggende zijde niet aan te raken. Nu ik het zo heb omgedraaid, is de kant met het patroon naar beneden gericht, wat de assemblage vergemakkelijkt; neem twee pakkingen en plaats deze in de PBS.

Ik rol het meestal heen en weer. Ik maak de hele pakking nat, waardoor de pakking gesmeerd wordt, net zoals ik het membraan in PBS heb gesmeerd. Als u droge pakkingen bij een droog membraan gebruikt, is de kans veel groter dat er iets gaat verschuiven.

Ik begin door één zijde iets verder door te trekken dan de andere zijde, want bij het plaatsen van de pakking wordt het membraan naar deze kant getrokken, waardoor deze zijde iets korter wordt. Begin dus met een iets korter uiteinde hier. Neem één pakking en leg deze eroverheen, zodat deze aan beide kanten vrij gelijkmatig ligt.

Druk vervolgens met gelijkmatige druk naar beneden; gebruik hiervoor uw duimen of de tips van uw duimen, maar niet uw nagels, omdat u anders per ongeluk door het membraan kunt snijden en het kunt scheuren. Zodra het is ingevoegd, gebruik ik de achterkant van mijn pincet om naar beneden te drukken. Wees hierbij opnieuw voorzichtig dat u niet te hard drukt of uitglijdt en het membraan raakt, want u kunt het op dit punt per ongeluk doorsnijden of scheuren, waardoor u een nieuw membraan moet pakken en opnieuw moet beginnen.

Nu is één zijde ingevoegd, maar de andere zijde is nog steeds los. Draai het om, neem de andere pakking, zorg dat deze nat is en plaats deze bovenop, net als hiervoor. Vervolgens gebruik ik doorgaans de pincet om dat membraan vast te pakken en een beetje uit te rekken, want als het te los zit, ontstaat er te veel speling in het membraan en zal het onmogelijk zijn om de cellen te zien.

Het moet dus strak staan, maar niet té strak zodat het uitrekt. Als het vooraf is uitgerekt, heeft dit invloed op het experiment omdat het membraan zelf dan al gespannen is en u het zou kunnen scheuren; u voegt namelijk een beetje spanning toe wanneer u de pakking naar beneden drukt. Op dit punt ziet het er redelijk strak uit.

Het zit misschien aan één kant een beetje los, maar dat zal ik zo oplossen. En druk vervolgens, met een vrij gelijkmatige druk, simpelweg aan met de toppen van uw duimen of uw vingertoppen. Op dit punt is te zien dat één kant vrij strak staat.

Het is helemaal recht tot aan de overkant. Er zit een klein beetje speling in het membraan op die plek, waardoor het een beetje omkrult. Wat ik nu ga doen, is deze kant helemaal naar binnen drukken, precies zoals voorheen; doe dit langzaam en gelijkmatig over de gehele breedte van de pakking.

En u kunt zien dat dit het meeste van de speling heeft weggenomen. We hebben zojuist de UV-bestraling van 30 minuten van de achterkant van de frames en de membranen voltooid, en nu willen we alle membranen omdraaien zodat de voorkant kan worden bestraald met UV, zodat alles volledig steriel is. Op dit punt gaan we ook bepaalde kamers aanwijzen als rek- of controlekamers.

Zoals u ziet, heb ik mijn kamers al gelabeld als controle stretch en controle stretch. De stretchkamers vereisen één extra schroef. Daarom heb ik de extra schroef voor de stretchkamer hier bovenop de onderkant van het deksel geplaatst.

Neem het frame en draai het om. Als het een rekkerkammer is, moeten er een paar schroeven worden gewisseld. Als het een controlekamer is, blijft alles ongewijzigd.

En wanneer deze staaf heen en weer beweegt, wordt het membraan zelf niet uitgerekt, maar beweegt het gewoon mee met de staaf. Als ik wil dat het membraan uitrekt, moet ik het tweede deel van het frame aan dit uiteinde bevestigen aan de bodem van de kamer zodat het stationair is. Wanneer de staaf vervolgens beweegt, zal alleen dit deel van het frame heen en weer bewegen.

Om dit te doen, neemt u de extra schroef en plaatst u deze in het schroefgat in dit deel van het frame. Gebruik de inbussleutel om de schroef aan te draaien. Draai deze niet te strak aan, omdat deze polysulfon-kamers enigszins fragiel zijn en u wilt voorkomen dat een kamer barst; draai de schroef slechts zo vast dat dit deel van het frame niet kan verschuiven.

Zodra de eerste schroef is geplaatst, kunt u deze schroef lossdraaien, die de twee delen van het frame bij elkaar hield; pas hierbij op dat u de schroef niet op het membraan laat vallen, omdat dit de gelatine die u daarop heeft gezaaid, kan beschadigen. Zodra deze voldoende loszit, pakt u de inbussleutel, pakt u de schroef met de pincet en plaatst u deze in het tweede schroefgat. Gebruik vervolgens opnieuw de inbussleutel om de tweede schroef vast te draaien.

Zodra dat deel van het frame met de twee schroeven is vastgezet, heb ik een kamer die klaar is voor rek. Wanneer deze stang heen en weer beweegt door de rekmachine, is te zien dat het membraan zelf daadwerkelijk wordt uitgerekt. Ik doe dit bij voorkeur een paar keer om er zeker van te zijn dat er niets mis is met mijn membraan.

Als er om welke reden dan ook een barst zou zitten en het membraan scheurt, dan weet ik dat nu vóór aanvang van het experiment en kan ik een ander membraan plaatsen. U schuift dit opzij, pakt de volgende, en in dit geval is deze gelabeld als controlekamer. Voor de controlekamer hoef ik hem alleen maar om te draaien.

Zodra het in de machine is geplaatst, zal het heen en weer bewegen zonder te rekken. Herhaal dit proces vervolgens voor alle kamers en membranen die u heeft. Controleer bij elk membraan de rek en sluit daarna de kap om de bovenkanten van de membranen gedurende 30 minuten met UV-licht te bestralen.

We hebben zojuist alle kamers en de bovenkanten van de frames in de membranen gedurende 30 minuten met uv-licht bestraald. Alles is nu gesteriliseerd en geassembleerd, en we zijn klaar om de cellen uit te zaaien. In dit geval zaai ik mesenchymale stamcellen uit, die ik uit 10 centimeter schalen haal.

Voor elk membraan, vooral bij het gebruik van een patroonmembraan zoals in dit geval, kunt u de vierkante oppervlakte waar het patroon zich bevindt, zaaien. Ik wil alleen op dat gepatroonde gebied zaaien. Als u een membraan zonder patroon gebruikt, wilt u nog steeds in ongeveer hetzelfde gebied zaaien, om te voorkomen dat de vloeistof te dicht bij de randen komt.

Als de vloeistof te dicht bij de randen staat, kan deze overstromen, waardoor de cellen afsterven voordat ze daadwerkelijk kunnen hechten. In het gebied waar u de cellen plaatst, wilt u de juiste hoeveelheid cellen aanbrengen. Wanneer ik het experiment uitvoer, streef ik naar een behoorlijke confluentie in dat gebied.

Als ik dus een schaal van 10 centimeter gebruik, wil ik ongeveer een derde van een confluente plaat op dat oppervlak. In dit geval, voor mesenchymale stamcellen, is dat ongeveer 250.000 cellen. Dit zal variëren afhankelijk van het celtype dat u gebruikt.

Ik heb mijn cellen inmiddels van de plaat gehaald en opgesuspendeerd in het juiste volume. Ik wil één ml van de celoplossing op elk membraan aanbrengen. In dit geval heb ik ongeveer 250.000 mesenchymale stamcellen per ml oplossing.

Ik gebruik daarom een P 1000 en zorg dat de oplossing homogeen is. Ik pipetteer een paar keer op en neer om 1 mL in de pipet te krijgen, en ik wil ervoor zorgen dat ik alleen op dat gebied zaai. Daarom zaai ik zeer langzaam en gebruik ik kleine druppeltjes op dat gepatronde gebied.

En u kunt daadwerkelijk zien dat dit, omdat het een patroon is, kleine ovalen in deze richting vormt, omdat het die groeven daadwerkelijk waarneemt. Het zijn dus geen volledige cirkels. In dit geval zijn ze meer ovaalvormig.

Vervolgens bekijk ik het hele gebied, maar ik kom nog niet te dicht bij de randen. Ik wil niet te ver gaan en alle oplossing uit mijn pipet verbruiken. Daarna gebruik ik de pipet om de oplossing daadwerkelijk vlakbij de randen te verspreiden, waarbij ik probeer niet over de rand te gaan.

Ik wil geen cellen op het gebied dat niet is be behandeld, en het is lastig om de rand die het dichtst bij u ligt te bereiken. Daarom draai ik dit normaal gesproken voorzichtig rond om die laatste rand te behandelen. Dit zou de cellen vrij gelijkmatig moeten verspreiden.

En nu zijn ze allemaal neergestreken. Let er wel op dat u geen cellen morst. Wees dus voorzichtig dat u uw hand er niet overheen beweegt en dat u deze niet te snel verplaatst.

Daarna schuif ik het weer opzij. Ik wil dit afdekken en de cellen er simpelweg bovenop zaaien. Om dit af te dekken, gebruikt u dit deksel, waarop zich overigens twee verschillende openingen bevinden.

Aan deze zijde bevindt zich een dieper gat en aan deze zijde een ondieper gat waardoor gassen kunnen binnenkomen. Zorg ervoor dat het diepere gat uitlijnt met dit T-stuk hier. Als u het ondiepe gat gebruikt, zal het anders te strak zitten.

Door het op deze manier te plaatsen, wordt de gehele kamer bedekt. Herhaal dit proces vervolgens voor alle resterende kamers en laat dit 30 minuten in de laminaire flowkast staan, zodat de cellen naar de bodem kunnen zakken en zich aan de membranen kunnen hechten. Daarna plakken we alle kamers af en plaatsen we ze in de flowkast of in de incubator, zodat ze daar nog een uur kunnen staan om volledig aan de membranen te hechten.

Oké, de cellen hebben nu een half uur op de membranen kunnen rusten. Nu wil ik de cellen blootstellen aan 37 °C en 5% CO2, wat in de incubator zelf is. Ik moet ze dus overzetten van de zuiverkast naar de incubator.

Om dit te doen, moet u er zeer zorgvuldig op toezien dat u de kamers in geen enkele richting kantelt, anders kan de celoplossing wegglijden. In dat geval moet u in principe opnieuw beginnen. Nu de cellen een uur in de incubator in de kamer hebben gezeten, zijn ze stevig aan het oppervlak gehecht.

Op dit punt heb ik de kamer weer uit de incubator gehaald en voorzichtig teruggeplaatst in de zuinetkast, waarbij ik het transport zeer behoedzaam heb uitgevoerd, net als voorheen. Zo voorkomt u dat er medium van het membraan verspil wordt. U moet nu 20 ml medium aan de rekapparaatkamer toevoegen.

En in dit geval gebruik ik een speciale combinatie van media omdat het licht gevoelig is voor contaminatie; het is perfect ontworpen om contaminatie te voorkomen. Ik gebruik DMEM plus 10% FBS plus 1% penicilline, streptomycine en vervolgens een extra 1% fungizone om schimmels buiten te houden. Ik neem 20 mL medium en voeg dit voorzichtig toe aan de rek-kamer.

We kunnen zien dat het medium niet van het membraan zelf is afgeglipt en aan het uiteinde van de kamer is toegevoegd, zodat het medium eerst onder het membraan stroomt en vervolgens over de bovenkant van het membraan. Doe dit langzaam zodat u de cellen niet volledig verstoort. Dek het vervolgens weer af en plaats de afdekking stevig.

Op dit punt hoeft u zich geen zorgen meer te maken over het verstoren van de cellen of het loslaten ervan van het membraan. Daarom kunt u het iets minder voorzichtig behandelen. U moet de juiste hoeveelheid van de stam selecteren.

De werking van deze machine is als volgt: er is een draaiend wiel waaraan een arm is bevestigd, en de lengte van deze arm kan variëren afhankelijk van de inzet van het geprefabriceerde onderdeel dat in het midden van het wiel wordt geplaatst. Wanneer het wiel draait, beweegt deze arm heen en weer, waardoor dit platform vervolgens heen en weer beweegt. De kamers zijn hieraan bevestigd.

Daardoor bewegen zij op hun beurt ook heen en weer. Als ik dus een rek van 5% wil toepassen, gebruik ik een prefab onderdeel waarop 'vijf' staat; dit heeft een specifieke vooraf berekende lengte om deze arm in de juiste positie te brengen. Ik plaats dit in het midden van het wiel, bevestig vervolgens de arm, controleer of deze stevig vastzit en draai dit met de inbussleutel goed aan voor de definitieve bevestiging.

Zodra dit alles op zijn plaats staat, bevindt het zich in de nulpositie en is alles vergrendeld. Nu zijn we klaar om de kamers te plaatsen. Dit zijn de kamers die ik zojuist heb overgebracht.

Wanneer de cellen zich bovenaan bevinden, plaatst u deze zorgvuldig in één positie en zorg dat de stang vastklikt. Zorg ervoor dat deze in deze richting wordt geduwd, zodat hij in de nulpositie is vergrendeld. Duw hem niet helemaal terug, anders kunt u het membraan vooraf rekken.

Zet het vervolgens vast met deze bevestiger, zodat het niet kan verschuiven. Zet daarna de schakelaar om om het proces te starten. U kunt zien dat er aan het begin een kleine sprong was.

Soms gebeurt dat, het loopt vast, maar daarna verloopt het meestal vrij soepel. En alle balken bewegen nu heen en weer en het is 60 cycli per seconde. Hier beneden staat 600.

Dat zou eigenlijk 60,0 moeten zijn. En u kunt de frequentie wijzigen indien u dat wenst. Zodra de cellen in uw systeem daadwerkelijk mechanisch zijn belast, doen we dit doorgaans gedurende ongeveer twee tot vijf dagen, maar u kunt dit korter of langer doen als u dat wilt.

Zodra u klaar bent en er een bepaald eindpunt is bereikt, kunt u de kamers verwijderen en de cellen op deze membranen gebruiken om verschillende zaken te onderzoeken. Normaal gesproken passen we verschillende technieken toe, waaronder microarray en 2D-gelelektroforese. We kijken ook naar genexpressie met PCR of western blotting voor proteïnexpressie.

Naast het enkel lyseren van de cellen, kunt u ze ook direct op het membraan kleuren om bijvoorbeeld te zoeken naar immunofluorescentie van specifieke eiwitten, of u kunt de cellen zelfs van het membraan losmaken om ze vervolgens te kleuren en door een FACS-apparaat te analyseren. Er zijn dus veel verschillende mogelijkheden en zaken waarnaar u kunt zoeken. Natuurlijk zijn er ook verschillende variaties van het apparaat als u andere typen micropatroonmembranen, andere materialen of verschillende coatings wilt gebruiken; er zijn allerlei manieren om dit aan te passen.