Microfluïdische apparaat voor het herstellen van een tumor micro-omgeving In vitro

Het algemene doel van deze procedure is het demonstreren van de fabricage en werking van een microfluïdisch apparaat dat tumor-micro-omgevingen in vitro nabootst en gebruikt kan worden voor het testen van chemotherapeutische geneesmiddelen. Dit is het microfluïdische apparaat. Dit apparaat kan nuttig zijn in de volgende gebieden: het eenvoudig in vitro testen van chemotherapeutische geneesmiddelen.

Het levert consistente en nauwkeurige resultaten voor het testen van driedimensionaal tumorweefsel, en dit apparaat biedt een zeer accurate weergave van tumoren in vivo. Tumoren bestaan in 3D-micro-omgevingen en de mogelijkheid om in een dergelijke omgeving te testen is van groot belang. De eerste stap van de procedure is het assembleren van het apparaat, wat bestaat uit de fabricage van een microfluidische chip middels soft lithografie, het ponsen van gaten bij de in- en uitlaten, het hechten aan een glazen objectglas en het aansluiten van slangjes voor de instroom- en uitstroomopeningen.

Vervolgens worden uniforme multicellulaire tumorsferoïden gegenereerd voor gebruik in het apparaat middels de hanging drop-methode. De sferoïden worden daarna in het apparaat gebracht, gevolgd door apoptose-detectiemiddelen en chemotherapeutische geneesmiddelen. Ten slotte wordt time-lapse microscopie uitgevoerd, gevolgd door een wiskundige schatting van de diffusiecoëfficiënten van de geneesmiddelen om het penetratievermogen van het chemotherapeutische middel te kwantificeren.

Uiteindelijk kunnen resultaten worden behaald die weefselgroei in het apparaat, de vorming van heterogene micro-omgevingen binnen het weefsel en drugdiffusie in het weefsel aantonen door middel van time-lapse fluorescentiemicroscopie. Beperkte penetratie van kankermedicijnen in solide tumoren is een belangrijke oorzaak van hun falen. De meeste huidige modellen voor het testen van kankermedicijnen bootsen de driedimensionale aard van solide tumoren niet na.

We hebben een microfluïdisch apparaat ontwikkeld dat bestaat uit continu geperfuseerde driedimensionale tumorweefsels. Dit model geeft een nauwkeuriger weergave van de toediening van geneesmiddelen aan solide tumoren en de systemische klaring daarvan. Multicellulaire tumorsferoïden zijn een goed gevestigd model voor driedimensionale tumorweefsels.

In deze procedure wordt de hanging drop-methode gebruikt om organoïden te creëren voor gebruik in het microfluïdische apparaat. Deze methode maakt de vorming van consistente organoïden in een korte tijd mogelijk. Het in vitro testen van chemotherapeutische geneesmiddelen in driedimensionaal weefsel kan helpen bij het efficiënter screenen van medicijnen in vergelijking met monoculturen van cellen.

Meng de PDMS en het uithardingsmiddel van het siliconen elastomeer in een gewichtsverhouding van negen op één. Giet dit mengsel vervolgens over de master om een vier millimeter dikke laag te vormen. Ontgas om luchtbellen te verwijderen en laat uitharden bij 60 °C gedurende vijf uur.

Pel het uitgeharde PDMS van de mal om een stempel van stroomkenmerken op het elastomeer te verkrijgen. Gebruik vervolgens een biopsietpons van anderhalf millimeter gemonteerd op een boormachine om ponsgaten voor de in- en uitlaten te maken. Verwijder alle resten.

Stel de functionele zijde van de stempel en een schoon objectglas acht minuten lang bloot aan zuurstofplasma. Breng de behandelde oppervlakken in een zuurstofplasma-etser onmiddellijk met elkaar in contact om een binding tussen beide te vormen. Houd de assemblage gedurende ten minste vijf uur op 60 °C op een objectglasverwarmer.

Om de verbinding te versterken, sluit PTFE-buisjes met een binnendiameter van 0.032 inches aan op de in- en uitlaten van het microfluïdische apparaat. Er wordt gebruikgemaakt van een interface van male lure lock-connectoren bevestigd aan female lure lock-connectoren met ribbels; deze specifieke connectoren worden gebruikt om een eenvoudige passage mogelijk te maken zonder dat er breuken ontstaan. Stel vervolgens de doorstroomopstelling samen met behulp van afsluiters en een Y-connector, en monteer het apparaat op de microscoop. Sluit na montage van het apparaat de buisjes aan op de juiste in- en uitlaten om de doorstroomopstelling te voltooien.

Zoals in deze figuur wordt getoond, maakt deze configuratie het eenvoudig en veelzijdig mogelijk om een sferoïde in het apparaat te plaatsen of om een stroom medium door het apparaat te creëren voor het inbrengen. Open de inlaatklep voor het inbrengen VPN en de uitlaatklep voor het inbrengen VP uit een tumor. OID kan vervolgens via de inlaat passeren en in de kweekkamer stromen, waar de post in deze kamer de tumor op zijn plaats houdt tijdens de doorstroming van het medium.

Sluit de pakkingkleppen en open de instroomklep VF in en de uitstroomklep VF out om de vorming van uniforme PHE te initiëren. Trypsineer de ijs-cellen onder een cultuurkap met de hangende-druppelmethode. Neem de resulterende getrypsineerde cellen uit de centrifuge.

Verdun de stamoplossing tot de gewenste concentratie aan de hand van tabel één. Verwijder vervolgens het deksel van een 48-wellplaat en plaats deze ondersteboven. Vul in een steriele zuurkast elke well van de plaat met één milliliter gesteriliseerd water.

Om de vochtigheid te behouden, wordt in elk cirkelvormig gebied op de afdekplaat een druppel van 20 µL van de verdunde celoplossing geplaatst. Keer de afdekplaat met een micropipet voorzichtig om en plaats deze op de plaat, waarbij u ervoor zorgt dat de druppels de randen van de wells niet raken. Incubeer de plaat bij 37 °C.

Raadpleeg tabel één voor de incubatieduur op basis van de gebruikte cel; in elke hangende druppel zal zich een steroïde vormen. Begin met het steriliseren van het apparaat door het via de stroominlaat door te spoelen met 70% ethanol. Volg dit op met een spoeling van PBS en vervolgens met HEPES-gebufferd celkweekmedium.

Laat de spuit met medium staan en bevestig deze aan de slang. Trek vervolgens twee tot drie keer Steroids op in de tapspuit. Om luchtbellen te verwijderen, bevestigt u de spuit aan de pakkinginlaat van het apparaat.

Open de inlaatklep VPN en sluit VFN, open de uitlaatklep VP out en sluit VF out. Houd de vulspuit verticaal met de naald naar beneden gericht. Wacht tot het steroïd naar de bodem van de spuit zakt, in de luer-lock connector van de naald.

Druk op de zuiger van de vulspuit en observeer hoe PHE de slang binnengaat en naar het apparaat stroomt, aangezien alleen het vuluitlaatventiel openstaat. Een steroïde zal de kamer van het apparaat binnengaan en worden vastgehouden door pinnen aan de achterzijde. Eenmaal in de kamer neemt de S-sferoïde de vorm van de kamer aan en verkrijgt een rechthoekige geometrie.

Sluit de inlaatklep VPN en de uitlaatklep VP out en monteer de stroomspuit SF op de spuitenpomp. Deze pomp wordt aangestuurd door een computer met behulp van syringe pump pro; open de inlaatklep VFN en de uitlaatklep VF out. Start de stroom van medium in het apparaat bij 3 µL per minuut.

Na een incubatie van de sferoïde gedurende 24 uur worden de middelen voor de detectie van apoptose toegediend. Laat de sferoïde vóór de toevoeging van detectie- of therapeutische middelen voor apoptose tot 24 uur equilibreren om nutriëntgradiënten en micro-omgevingen te laten ontstaan. Sluit vervolgens klep VFN.

Stop de spuitpomp. Verwijder de spuit uit de pomp en vervang deze door de spuit met medium dat 0,25 µL/ml CASP glow red actieve Caspase-3 marker bevat. Spoel het apparaat met de oplossing door handmatig 0,7 ml ervan door het apparaat te spoelen.

Bevestig vervolgens de spuit op de pomp. Start de flow opnieuw en open klep VFN. Gedurende een periode van vijf tot acht uur zal cask glove red active cph phase three in het weefsel diffunderen en helderder fluoresceren in apoptotische regio's. Het apoptose-detecterende agens wordt in alle daaropvolgende flow-oplossingen in deze concentratie gehandhaafd.

Doxorubicine wordt vijf tot acht uur na de toevoeging van de middelen voor de detectie van apoptose geïntroduceerd. Deze behandeling wordt uit het systeem gespoeld. Om chemotherapeutische middelen toe te voegen, volgt u de procedure voor apoptosedetectie om 10 micromolar doxorubicinehydrochloride toe te dienen.

Vervang vervolgens de behandelspuit door de spuit met 0,7 milliliters medium. Laat het therapeutische middel gedurende een vaste periode doorstromen. Sluit daarna ventiel VFN en schakel de spuitenpomp uit.

Verwijder de spuit met de behandeling uit de spuitpomp en vervang deze door de spuit met 0,7 milliliters medium. Laat het verse medium gedurende 24 tot 36 uur doorstromen, terwijl het weefsel continu onder een microscoop wordt gemonitord. Het volledige acquisitieproces voor time-lapse microscopie werd geautomatiseerd met behulp van een aangepast script in IP lab; er werden elke 30 minuten doorlatend licht- en fluorescentiebeelden van de PAX Foid gemaakt bij een 10 x vergroting. Voor de wiskundige schatting van de diffusiecoëfficiënten van het geneesmiddel is de eerste stap het genereren van gemiddelde lineaire intensiteitsprofielen van de fluorescentie van het geneesmiddel met behulp van ImageJ. Selecteer een rechthoekig interessegebied, of ROI, dat het weefsel in de kamer omvat.

Gebruik het commando plot profile om een profiel van de gemiddelde intensiteiten te genereren als functie van de afstand tot het stroomkanaal. Herhaal dit voor maximaal drie verschillende tijdspunten. Trek vervolgens de gemiddelde achtergrondfluorescentie-intensiteit af van de verkregen intensiteitsprofielen en normaliseer elk profiel met behulp van de overeenkomstige maximale intensiteit om C te verkrijgen als functie van X en T. Hierbij is C de genormaliseerde concentratie van doxorubicine, waarbij de waarde van C varieert tussen nul en één.

De volgende stap is het evalueren van de effectieve diffusiecoëfficiënt van doxorubicine binnen het tumorweefsel. Diffusie kan worden weergegeven door de volgende vergelijking, waarbij ERFC de complementaire foutfunctie is. X is de afstand in het weefsel vanaf het kanaal, en T is de tijd na de toediening van doxorubicine.

Gebruik het volgende iteratieve schema voor elk overwogen tijdstip. Schat een waarde voor D. Bereken de rechterkant van de vergelijking op elke locatie X. Bereken de som van de kwadratische fouten tussen de twee kanten en pas D aan om het gemiddelde residu te minimaliseren.

De optimale waarden van D die op elk tijdstip zijn verkregen om de gemiddelde effectieve diffusiecoëfficiënt van doxorubicine in het weefsel te schatten. De microfluïdische apparaten boden optisch toegankelijke kweekkamers van één millimeter bij 0,3 millimeter bij 0,15 millimeter voor de groei van driedimensionaal tumorweefsel. De hanging drop-methode maakte een snelle vorming mogelijk van tumor PHE met een consistente grootte en vorm vanuit verschillende cellijnen.

PHE werden gedurende maximaal drie dagen succesvol gekweekt op het apparaat. Groei in de kamers was geassocieerd met de reproduceerbare modificatie van micro-omgevingen. Binnen de PHE trad apoptose minder vaak op in cellen in directe nabijheid van het stroomkanaal en vaker en dieper in het weefsel.

Het apparaat werd gebruikt om de diffusiecoëfficiënt van doxorubicine en tumorweefsel te schatten. De experimenteel verkregen waarde kwam overeen met de waarde die eerder is gerapporteerd bij menselijke borstkanker. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om extra voorzichtig te zijn met het handhaven van de steriliteit bij het inbrengen van PHE in het apparaat, omdat dit buiten de celkweek moet worden uitgevoerd.

Spuit de spuiten en de uiteinden van de slangen in de zuurkast royaal in met ethanol om steriliteit te waarborgen. Na het bekijken van deze video zou u inzicht hebben in de rol van de beperkte penetratie van geneesmiddelen in tumoren. We hebben een techniek gedemonstreerd om de afgifte en systemische klaring van geneesmiddelen in driedimensionale tumorweefsels na te bootsen en hun penetratie te kwantificeren.

Het elimineren van geneesmiddelen met een slechte penetratie zal het proces van de ontwikkeling van kankermedicijnen aanzienlijk stroomlijnen.