Name: Microfluïdische apparaat voor het herstellen van een tumor micro-omgeving In vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 18 s
Description: Leer hoe u een microfluïdische chip fabriceert om tumor-microomgevingen in vitro te recreëren voor het testen van chemotherapeutica. Deze methode simuleert 3D-tumorweefsel en kwantificeert apoptose en medicijndiffusie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Health subsidie ​​# 1R01CA120825-01A1, de Collaborative Biomedical Research (CBR) Program aan de Universiteit van Massachusetts Amherst, en de Isenberg Scholarship voor Bhushan J. Toley. We dankbaar erkennen de waardevolle bijdrage van James Schafer, de videograaf, verteller, en redacteur van deze video.

1. Device Fabrication Replicatie van microfluïdische functies in elastomeren was gebaseerd op de methode beschreven door Duffy et al. 1. <ol><li> Mix elastomeer (polydimethylsiloxaan, PDMS) en verharder uit de siliconelastomeerfase Kit (Dow Corning, Midland, MI) in een 9:1 gewichtsverhouding en giet het over de master op een 4 mm dikke laag te vormen. Ontgassen om luchtbellen te verwijderen en uitharding van het mengsel bij 60 ° C gedurende 5 uur. Schil uitgeharde PDMS van de vorm om een ​​stempel van stroming functies van het elastomeer te verkrijgen. </li><li> Perforaties voor-en afvoeren met een 1,5 mm biopsie punch (Miltex, York, PA) op een kolomboormachine. Trek eventueel vuil. </li><li> Onderwerp De kenmerken zijde van de stempel en een schoon glasplaatje aan zuurstofplasma gedurende 8 minuten in een zuurstofplasma etser. Onmiddellijk Breng de behandelde oppervlakken in contact om een ​​band tussen hen te vormen. Handhaaf het samenstel bij 60 ° C op een dia warmer ten minste 5 uurs om de band te versterken. </li><li> Sluit 0.032 "ID PTFE-buis (Cole Parmer, Vernon Hills, IL) om de in-en uitgangen met behulp van een interface van mannelijke luer-lock aansluitingen aan prikkeldraad vrouwelijke luer-lock connectoren (Qosina, Edgewood, NY). </li><li> Stel de stroom montage met behulp van afsluiters en een Y-connector (Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA, figuur 1). Monteer het apparaat op de microscoop. Bevestig spuiten om buizen met behulp van 20G 1,5 "naalden (BD Bioscience, Rockville, MD). </li></ol> 2. Vorming van Uniform sferoïden Sferoïden gevormd door de opknoping neerzetten 2,3. <ol><li> Trypsinize cellen onder een steriele celkweek kap. </li><li> Centrifugeer getrypsiniseerde cellen bij 2000 rpm gedurende 5 minuten en resuspendeer in 6 ml vers medium. Verdun de stamoplossing tot een gewenste eindconcentratie (tabel 1). </li><li> Verwijder het deksel van een 48 well plaat en plaats het ondersteboven in de sterilized kap. Circulaire gebieden die corresponderen met elk putje zijn zichtbaar op het deksel. Vul elk putje van de plaat met 1 ml gesteriliseerd water aan vocht behouden. Plaats een 20 ul druppel van de verdunde oplossing in elke cel cirkelvormig gebied met een micropipet. Voorzichtig omkeren het deksel en plaats het over de plaat, zodat de druppels niet de randen van de putjes te raken. </li><li> Incubeer de puts plaat bij 37 ° C gedurende een bepaald aantal dagen (tabel 1). Een sferoïde vormen in elke opknoping druppel. </li></ol> 3. Introductie van sferoïden in Device Zie tabel 1 en figuur 2 van deze sectie. <ol><li> Steriliseer het apparaat door te spoelen met 70% ethanol ingebracht door het stromingsinlaatpunt. Vervolgens spoelen met PBS gevolgd door HEPES gebufferd celkweekmedium. Laat het medium spuit S F aan de slang. </li><li> Teken twee tot drie sferoïden in P spuit S, tikt spuit om luchtbellen te verwijderen, enhechten aan de verpakking inlaat van het apparaat. </li><li> Open inlaatklep V Pin en dicht V Fin. Open uitlaatklep V Pout en dicht V Fout. Houd de verpakking spuit verticaal met de naald naar beneden; kijken als sferoïden naar de bodem van de spuit af te wikkelen in de luer-lock aansluiting van de naald. Duw de zuiger op de verpakking spuit en kijken sferoïden voer de slang en de stroom in het apparaat. Omdat alleen de verpakking uitlaatklep open is, een bolvormige voer de kamer van de inrichting wordt bijgehouden door posten aan de achterzijde (Fig. 2). </li><li> Sluiten inlaatklep V Pin en uitlaatklep V Pout. Monteer de spuit S F op een injectiepomp. Open de afsluiter V Fin en klep V Fout. Stromingsmedium in het apparaat bij 3 gl / min. </li></ol> 4. Introductie van Apoptosis detecteren Agent (CaspGLOW) Na het inpakken kamers met sferoïden, zodat evenwicht voor up 24 uur aan voedingsstoffen gradiënten en micromilieus stellen, alvorens apoptose detecteren of therapeutische middelen. Omdat de weefsels in kamers zijn in contact met ondoordringbare wanden van boven en onder, er geen voedingsstoffen hellingen langs de dikte (0,15 mm) van het weefsel. Na 24 uur incubatie alle cellagen langs de dikte van het weefsel zijn dus gelijk en de enige heterogeniteit in een richting weg van het stromingskanaal. <ol><li> Schakel V Fin, de spuit pomp te stoppen, verwijder spuit S F van de pomp en vervang deze door een spuit met medium dat 0,25 ul / ml CaspGLOW Red actief caspase-3 marker (Red-DEVD-FMK, BioVision, Mountain View, CA). </li><li> Handmatig leegmaken 0,7 ml van deze oplossing door de inrichting om verplaatsing van ouder medium waarborgen. Monteer de spuit op de pomp, start stroom, en open V Fin. Over een periode van 5-8 uur, de apoptose detectiemiddel diffundeert tHij weefsel en fluoresceert helderder in apoptotische regio's. Apoptose detectiemiddel bij deze concentratie wordt gehandhaafd in alle volgende oplossingen stroom in het apparaat. </li></ol> Opmerking: <ol class="lroman"><li> Weefsel heterogeniteit kan worden bevestigd door het verkrijgen van lineaire intensiteit profielen van de fluorescentie, zoals beschreven in hoofdstuk 6. De profielen moeten tonen ruimtelijke gradiënten in apoptose, wat bevestigt dat het weefsel is heterogeen met betrekking tot levensvatbaarheid van de cellen. </li><li> CaspGLOW Green actief caspase-3 marker (fluoresceïne-DEVD-fmk, BioVision) kan ook worden gebruikt om apoptose te detecteren. Deze markering bevat het groene fluorofoor fluoresceïne in plaats van de rode fluorofoor rhodamine. </li></ol> 5. Invoering van het therapeutische middel <ol><li> Volg de procedure in stappen 4.1-4.2 tot 10 uM doxorubicine hydrochloride (Dox, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) invoeren die apoptose detectiemiddel. </li><li> Ga door stroming van de therapeutic middel oplossing voor een vaste periode van tijd. Afsluitklep V Fin en zet de injectiepomp. Vervang de behandeling spuit met een vers medium spuit met apoptose detectiemiddel. Laat toevoer van verse medium voor 24 -36 uur, terwijl continue monitoring van het weefsel onder een microscoop. </li></ol> 6. Time-lapse microscopie en Raming van de Drug diffusiviteit coëfficiënten Voor het verkrijgen van schoonste fluorescentie gegevens, verwerven alle beelden door zich te richten de microscoop op de onderste lagen van de weefsels. Omdat er geen voedingsstof gradiënten in de verticale richting (zie paragraaf 4), de onderste lagen van cellen zijn goed vertegenwoordigers van alle andere lagen boven. <ol><li> Het gehele overnameproces werd geautomatiseerd met een aangepaste script in IPLab (BD Bioscience, Rockville, MD). Verwerven doorgelaten licht en fluorescentiebeelden van verpakte bolvormige bij 10x vergroting elke 30 minuten (Fig. 3A). Acquire een beeld van de achtergrond fluorescentie voorafgaand aan het inbrengen van Dox. Ruimte maken voor de grootte van de kamer (1000 urn x 300 um), in twee aangrenzende beelden en ze samen tegel 4. </li><li> Voor wiskundige schatting van drug diffundeerbaarheid coëfficiënten, de eerste stap is het genereren gemiddelde lineaire intensiteitsprofielen van Dox fluorescentie met ImageJ. Selecteer een rechthoekig gebied van belang (ROI) omvat het weefsel in de kamer. Gebruik de Plot Profile opdracht om een ​​profiel van gemiddelde intensiteiten als functie van de afstand tot het stromingskanaal genereren. Herhaal dit voor maximaal 3 verschillende tijdstippen. </li><li> Zorg voor een achtergrond fluorescentie beeld vóór de invoering van Dox te autofluorescentie meten van het weefsel. Trek de gemiddelde achtergrond fluorescentie intensiteit van het verkregen intensiteitsprofielen en normaliseren elk profiel de overeenkomstige maximale intensiteit te verkrijgen <img src="/files/ftp_upload/2425/2425eq0.jpg" alt="c" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="c"> (X, t) (Fig. 3B). </li><li> De volgende stap is de effectieve diffusiecoëfficiënt D van Dox evalueren binnen tumorweefsel. Dox diffusie kan worden voorgesteld door de volgende vergelijking 5 <img src="/files/ftp_upload/2425/2425eq1.jpg" alt="Vergelijking 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Vergelijking 1"> waarbij FOUT.COMPLEMENT is de complementaire foutfunctie, x de afstand is in het weefsel van het kanaal, en t de tijd na introductie van Dox (zie Fig. 3). Gebruik de volgende iteratieve schema op elk beschouwd tijdstip: <ul><li> Guess een waarde voor D </li><li> Bereken rechterzijde van de vergelijking op elke locatie x </li><li> Bereken de som van de gekwadrateerde fouten (rest) tussen beide partijen </li><li> Wijzig D om de resterende minimaliseren </li></ul></li><li> Gemiddelde optimale waarden van D verkregen op elk tijdstip de gemiddelde effectieve diffusiecoëfficiënt van Dox in het weefsel te schatten. </li></ol> 7. Representatieve resultaten: &lt;p class = "jove_content"&gt; De microfluïdische inrichtingen 1mm x 0.3mm x 0.15mm optisch toegankelijk cultuur kamers voor de groei van de drie-dimensionale tumorweefsel. Meercellige tumor sferoïden werden gevlogen in deze kamers en werden vastgehouden door twee filter berichten aan de achterkant. De opknoping druppel methode toegestaan ​​snelle vorming van bolvormige deeltjes van consistente grootte en vorm van verschillende cellijnen. Sferoïden met succes gegroeid op het apparaat tot 3 dagen. Groei in de kamers werd geassocieerd met een reproduceerbare modificatie van micro-omgevingen in sferoïden. Apoptosis zich minder in cellen in de nabijheid van het stromingskanaal en hogere dieper in het weefsel. Het apparaat werd gebruikt om de diffusiecoëfficiënt van doxorubicine in tumorweefsel schatten. De verkregen waarde van 8,75 x 10 -7 cm 2 s -1 eens met de waarde van 9,1 x 10 -7 cm 2 s -1 eerder gerapporteerd 6 in humane borstkanker. <table border="1"><tbody><tr><td> Cell Line </td><td> Vereiste celconcentratie </td><td> Incubatie tijd </td></tr><tr><td> LS174T </td><td> 300 cellen / ul </td><td> 2-3 dagen </td></tr><tr><td> T47D </td><td> 750 cellen / ul </td><td> 3-4 dagen </td></tr><tr><td> MDA-MB-231 </td><td> 150 cellen / ul </td><td> 5-6 dagen </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Parameters voor Opknoping Drop sferoïden <table border="1"><tbody><tr><td> Deel </td><td> Beschrijving </td></tr><tr><td> S F </td><td> Flow Spuit </td></tr><tr><td> S P </td><td> Verpakking Spuit </td></tr><tr><td> V Fin </td><td> Flow inlaatklep </td></tr><tr><td> V Pin </td><td> Verpakking inlaatklep </td></tr><tr><td> V Fout </td><td> Stromingsuitlaatpunt Valve </td></tr><tr><td> V Pout </td><td> Verpakking Outlet Valve </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Spuiten en kleppen in Flow Setup <img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1 Schema van de stroom setup V Fin en V Fout:. Flow inlaat-en uitlaatkleppen, V Pin en V Pout: Verpakking-en uitlaatkleppen, S F en S P: Flow en verpakking spuiten. De verpakking spuit en verpakking en uitlaatkleppen worden gebruikt wanneer een bolvormige gevlogen in de kamer. De stroming spuit en stroom-en uitlaatkleppen worden vervolgens stromen medium. <img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Schematische voorstelling van een sferoïde opgesloten in een kamer op het apparaat. A sferoïde is gestroomd in de kamer op het apparaat en wordt geblokkeerd door twee filter posts aan de achterkant van de kamer. <img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Doxorubicine diffusie in tumorweefsel op het apparaat. A. Samengevoegd doorvallend licht en rode fluorescente beeld van weefsel, die de plaats en de concentratie van doxorubicine (in het rood). Scale balk vertegenwoordigt 250 pm. B. genormaliseerde lineaire intensiteit profiel van doxorubicine fluorescentie.

<ol><li>Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Prototyping+of+Microfluidic+Systems+in+Poly%28dimethylsiloxane%29%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane).</a> Anal. Chem. 70, 4974-4984 (1998).</li>
<li>Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+generation+of+homogeneous+multicellular+tumor+spheroids+applicable+to+a+wide+variety+of+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types.</a> Biotechnol. Bioeng. 83, 173-180 (2003).</li>
<li>Timmins, N. E., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+by+the+hanging-drop+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method.</a> Methods. Mol. Med. 140, 141-151 (2007).</li>
<li>Kasinskas, R. W., Forbes, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+typhimurium+specifically+chemotax+and+proliferate+in+heterogeneous+tumor+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Salmonella typhimurium specifically chemotax and proliferate in heterogeneous tumor tissue in vitro.</a> Biotechnol. Bioeng. 94, 710-721 (2006).</li>
<li>Walsh, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multipurpose+microfluidic+device+designed+to+mimic+microenvironment+gradients+and+develop+targeted+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">A multipurpose microfluidic device designed to mimic microenvironment gradients and develop targeted cancer therapeutics.</a> Lab. Chip. 9, 545-554 (2009).</li>
<li>Lankelma, J., Fernandez Luque, R., Dekker, H., Schinkel, W., Pinedo, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mathematical+model+of+drug+transport+in+human+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">A mathematical model of drug transport in human breast cancer.</a> Microvasc. Res. 59, 149-161 (2000).</li>
<li>Less, J. R., Skalak, T. C., Sevick, E. M., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+architecture+in+a+mammary+carcinoma%3A+branching+patterns+and+vessel+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Microvascular architecture in a mammary carcinoma: branching patterns and vessel dimensions.</a> Cancer. Res. 51, 265-273 (1991).</li>
<li>Brown, J. M., Giaccia, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unique+physiology+of+solid+tumors%3A+opportunities+%28and+problems%29+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Res%22%5BJournal%5D)">The unique physiology of solid tumors: opportunities (and problems) for cancer therapy.</a> Cancer. Res. 58, 1408-1416 (1998).</li>
<li>Thomlinson, R. H., Gray, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histological+structure+of+some+human+lung+cancers+and+the+possible+implications+for+radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The histological structure of some human lung cancers and the possible implications for radiotherapy.</a> Br. J. Cancer. 9, 539-549 (1955).</li>
<li>Minchinton, A. I., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+penetration+in+solid+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Drug penetration in solid tumours.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 583-592 (2006).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De bloedvaten in tumoren is schaars en slecht ontwikkelde 7,8. Er zijn regio&#39;s die ver gelegen (&gt; 100 um) van de bloedvaten die niet toegankelijk zijn voor voedingsstoffen en medicijnen geleverd hoewel het vaatstelsel 9. Het resulterende heterogene micro bijdraagt ​​tot de beperkte werkzaamheid van veel chemotherapeutica 10. Het microfluïdische apparaat hier ontwikkeld reconstrueert een heterogene tumor micro gekenmerkt door proliferatie, rustige en apoptotische of necrotische cel...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het reagens </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogusnummer </th><th> Reacties </th></tr><tr><td> Silicone elastomeer kit </td><td> Ellsworth Lijmen </td><td> 184 Sil Elast Kit </td><td></td></tr><tr><td> Miltex biopsie punch </td><td> MedexSupply </td><td> MTX-33-31aa </td><td> 1,5 mm </td></tr><tr><td> PTFE-buis </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06.417-31 </td><td> 0.032 &quot;ID </td></tr><tr><td> Mannelijke luer lock connector </td><td> Qosina </td><td> 65111 </td><td></td></tr><tr><td> Prikkeldraad vrouwelijke luer-lock connector </td><td> Qosina </td><td> 11556 </td><td></td></tr><tr><td> Afsluiter </td><td> IDEX Gezondheid en Wetenschap </td><td> P-721 </td><td></td></tr><tr><td> Y-connector </td><td> IDEX Gezondheid en Wetenschap </td><td> P-513 </td><td></td></tr><tr><td> 20G 1,5 &quot;naalden </td><td> BD Bioscience </td><td> 305176 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H-4034 </td><td></td></tr><tr><td> CaspGLOW Fluoresceïne </td><td> BioVision </td><td> K183-25 </td><td></td></tr><tr><td> CaspGLOW Rood </td><td> BioVision </td><td> K193-25 </td><td></td></tr><tr><td> Doxorubicinehydrochloride </td><td> Sigma </td><td> 44583 </td><td></td></tr><tr><td> LS174T </td><td> ATCC </td><td> CCL-188 </td><td> Human Colon carcinoom cellijn </td></tr><tr><td> T47D </td><td> ATCC </td><td> HTB-133 </td><td> Human ductaal carcinoma cellijn </td></tr><tr><td> MDA-MB-231 </td><td> ATCC </td><td> HTB-26 </td><td> Human adenocarcinoom cellijn </td></tr></tbody></table>

microfluïdische apparaat voor het herstellen van een tumor micro-omgeving<em&gt; in vitro</em

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We hebben een microfluïdische apparaat dat de levering en de systemische klaring van geneesmiddelen voor heterogene driedimensionale tumorweefsels in vitro nabootst. Voedingsstoffen die door vasculatuur niet alle delen van tumoren te bereiken, die tot heterogene micromilieus bestaande uit levensvatbare, rustige en necrotische celtypen. Veel kanker drugs niet effectief doordringen en behandelen alle soorten cellen hierdoor heterogeniteit. Monolagen van kankercellen niet bootsen deze heterogeniteit, waardoor het moeilijk om kanker farmaca met een geschikt in vitro model. Onze microfluïdische apparaten werden vervaardigd uit PDMS met behulp van zachte lithografie. Multicellulaire tumor sferoïden gevormd door de opknoping neerzetten, werden ingevoegd en beperkt tot rechthoekige kamers van het apparaat en onderhouden met continue perfusie medium aan een zijde. De rechthoekige vorm van de kamers van het apparaat lineaire gradiënten ontstaan ​​in weefsel. Fluorescerende vlekken werden gebruikt om e kwantificerene variabiliteit in apoptosis in weefsel. Tumoren van het apparaat werden behandeld met de fluorescerende chemotherapeuticum doxorubicine, time-lapse microscopie werd gebruikt om de verspreiding te controleren in weefsel en de effectieve diffusiecoëfficiënt geschat. De opknoping neerzetten toegestaan ​​snelle formatie van uniforme bolletjes van verschillende cellijnen. Het apparaat ingeschakeld groei van bolvormige deeltjes tot 3 dagen. Cellen in de nabijheid van vloeiend medium waren minimaal apoptotische en die ver van het kanaal waren apoptotisch, waardoor nauwkeurig regio tumoren naast bloedvaten nabootsen. De geschatte waarde van de doxorubicine diffusiecoëfficiënt overeengekomen met een eerder gerapporteerde waarde in de menselijke borstkanker. Omdat de penetratie en retentie van drugs in solide tumoren van invloed op hun werkzaamheid, zijn wij van mening dat dit apparaat is een belangrijk instrument in het begrijpen van het gedrag van drugs, en het ontwikkelen van nieuwe kankertherapieën.

We presenteren de procedure voor de productie en exploitatie van een microfluïdische apparaat dat heterogene tumor micro-omgevingen herschept<em&gt; In vitro</em&gt;. De variabiliteit in apoptose in tumorweefsel werd gekwantificeerd met behulp fluorescerende vlekken en effectieve diffusiecoëfficiënt van het chemotherapeuticum doxorubicine in tumorweefsel werd geëvalueerd.

Microfluïdische apparaat voor het herstellen van een tumor micro-omgeving<em&gt; In vitro</em

We hebben een microfluïdisch apparaat ontwikkeld dat de toediening en systemische klaring van geneesmiddelen naar heterogene driedimensionale tumorgewevens nabootst in ...

Het algemene doel van deze procedure is het demonstreren van de fabricage en werking van een microfluidisch apparaat dat tumor-micro-omgevingen in vitro nabootst en gebruikt kan worden voor het testen van chemotherapeutica. Dit is het microfluidische apparaat. Dit apparaat kan nuttig zijn in de volgende gebieden: eenvoudig testen van chemotherapeutica in vitro.Het levert consistente en nauwkeurige resultaten bij het testen van driedimensionaal tumorweefsel, en dit apparaat biedt een zeer getrouwe weergave van een tumor in vivo. Tumoren bestaan in 3D-micro-omgevingen, en de mogelijkheid om in een dergelijke omgeving te testen is van groot belang. De eerste stap van de procedure is het assembleren van het apparaat, wat het fabriceren van de microfluïdische chip via soft lithography omvat, het ponsen van gaten bij de in- en uitlaten, het hechten aan een glazen objectglas en het aansluiten van slangetjes voor de instroom en uitstroom.Vervolgens worden uniforme multicellular tumor spheroids gegenereerd voor gebruik in het device via de hanging drop-methode. De spheroids worden vervolgens in het device geïntroduceerd, gevolgd door apoptose, detectie-agentia en chemotherapeutische geneesmiddelen. Tot slot wordt time lapse-microscopie uitgevoerd, gevolgd door een wiskundige schatting van de diffusiecoëfficiënten van het geneesmiddel om het penetratievermogen van het chemotherapeutische agens te kwantificeren.Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die, door middel van time-lapse fluorescentiemicroscopie, weefselgroei in het apparaat, de vorming van heterogene micro-omgevingen binnen het weefsel en drugdiffusie in het weefsel aantonen. Beperkte penetratie van kankermedicijnen in solide tumoren is een belangrijke oorzaak van hun falen. De meeste huidige testmodellen voor kankermedicijnen bootsen de driedimensionale aard van solide tumoren niet na.We hebben een microfluïdisch apparaat ontwikkeld dat bestaat uit continu geperfuseerde driedimensionale tumorgewevens. Dit model geeft een nauwkeuriger weergave van de toediening van geneesmiddelen aan solide tumoren en de systemische klaring daarvan. Multicellulaire tumorsferoïden zijn een goed gevestigd model voor driedimensionale tumorgewevens.In deze procedure wordt de hanging-dropmethode gebruikt om organoïden te creëren voor gebruik in het microfluïdische apparaat. Deze methode maakt de vorming van consistente organoïden in een korte periode mogelijk. Het in vitro testen van chemotherapeutische geneesmiddelen in driedimensionaal weefsel kan helpen bij het efficiënter screenen van geneesmiddelen in vergelijking met monolagen van cellen.Meng de PDMS en het uithardingsmiddel van het siliconen elastomeer in een gewichtsverhouding van negen op één. Giet dit mengsel vervolgens over de master om een vier millimeter dikke laag te vormen. Ontgas om luchtbellen te verwijderen en hard uit bij 60 °C gedurende vijf uur.Pel het uitgeharde PDMS van de mal om een stempel van stroomkenmerken op het elastomeer te verkrijgen. Gebruik vervolgens een biopsietpons van anderhalf millimeter gemonteerd op een boor om gaten te ponsen voor de in- en uitlaten. Verwijder alle resten.Behandel de functionele zijde van de stempel en een schoon glazen objectglas acht minuten lang met zuurstofplasma. Breng de behandelde oppervlakken in een zuurstofplasma-etcher onmiddellijk met elkaar in contact om een verbinding tussen beide te vormen. Houd de assemblage gedurende ten minste vijf uur op 60 °C op een objectglasverwarmer.Om de verbinding te versterken, sluit PTFE-buisjes met een binnenste diameter (ID) van 0,032 inches aan op de in- en uitlaten van het microfluidische apparaat. Er wordt gebruikgemaakt van een interface van mannelijke lure-lock-connectoren die zijn bevestigd aan geribbelde vrouwelijke lure-lock-connectoren; deze specifieke connectoren worden gebruikt om doorgeven mogelijk te maken zonder dat er breuk ontstaat. Stel vervolgens de flow-assemblage samen met behulp van afsluiters en een Y-connector, en monteer het apparaat op de microscoop. Sluit na montage van het apparaat de buisjes aan op de juiste in- en uitlaten om de flow-opstelling te voltooien.Zoals in deze figuur wordt getoond, maakt deze configuratie het eenvoudig en veelzijdig mogelijk om een sferoïde in het device te plaatsen of een stroom medium door het device te creëren om te laden. Open de vulinlaatklep VPN en de vuluitlaatklep VP uit. Een tumor-OID kan vervolgens via de inlaat naar binnen stromen en in de kweekkamer terechtkomen, waar de post in deze kamer de tumor op zijn plaats houdt tijdens de doorstroming van het medium.Sluit de vulkleppen en open de toevoerklep VF in en de afvoerklep VF out om de vorming van uniforme PHE te initiëren. Gebruik de hanging drop-methode om trypsin-ijscellen onder een cultuurkap te verwerken. Neem de resulterende trypsin-cellen uit de centrifuge.Verdun de stamoplossing tot de gewenste concentratie aan de hand van tabel één. Verwijder vervolgens de afdekking van een 48-well plaat en plaats deze ondersteboven. Vul in een steriele laminaire flowkast elke well van de plaat met één milliliter gesteriliseerd water.Om de vochtigheid te behouden, plaatst u een druppel van 20 µL van de verdunde cellenoplossing in elk cirkelvormig gebied op de afdekplaat. Keer de afdekplaat met een micropipet voorzichtig om en plaats deze op de plaat, waarbij u erop let dat de druppels de randen van de wells niet raken. Incubeer de plaat bij 37 °C.Raadpleeg tabel één voor de incubatieduur op basis van de gebruikte specifieke cellen; in elke hangende druppel zal een steroïde worden gevormd. Begin met het steriliseren van het apparaat door 70% ethanol via de stroomingang door te spoelen. Volg dit met een spoeling van PBS en vervolgens HEPES-gebufferd celkweekmedium.Laat de spuit met medium staan en bevestig deze aan de slang. Trek vervolgens twee tot drie Steroids op in de spuit. Om luchtbellen te verwijderen, bevestigt u de spuit aan de pakkinginlaat van het apparaat.Open de inlaatklep VPN en sluit VFN, open de uitlaatklep VP out en sluit VF out. Houd de vulspuit verticaal met de naald naar beneden gericht. Wacht tot het steroid naar de bodem van de spuit zakt, in de luer-lock connector van de naald.Druk op de zuiger van de vulspuit en observeer hoe PHE de slang binnengaat en in het apparaat stroomt, aangezien alleen de uitlaatklep voor het vullen openstaat. Een steroïde zal de kamer van het apparaat binnengaan en worden vastgehouden door pinnen aan de achterzijde. Eenmaal in de kamer neemt de S-sferoïde de vorm van de kamer aan en krijgt deze een rechthoekige geometrie.Sluit de inlaatklep VPN en de uitlaatklep VP out en monteer de flowspuit SF op de spuitpomp. Deze pomp wordt door een computer aangestuurd met behulp van syringe pump pro; open de inlaatklep VFN en de uitlaatklep VF out. Start de stroom van medium in het apparaat met 3 µL per minuut.Incubatie van de sferoïde gedurende 24 uur wordt gevolgd door de toevoeging van agentia voor de detectie van apoptose. Laat de sferoïde vóór de toevoeging van detectie- of therapeutische agentia voor apoptose tot 24 uur equilibreren om nutriëntgradiënten en micro-omgevingen te laten ontstaan. Sluit vervolgens klep VFN.Stop de spuitpomp. Verwijder de spuit uit de pomp en vervang deze door de spuit die medium bevat met 0,25 µL/ml CASPglow red actieve Caspase-3-marker. Spoel het apparaat met de oplossing door handmatig 0,7 mL hiervan door het apparaat te spoelen.Bevestig vervolgens de spuit op de pomp. Start de vloeistofstroom opnieuw en open klep VFN. Gedurende een periode van vijf tot acht uur zal cask glove red active cph phase three diffunderen in het weefsel en feller fluoresceren in apoptotische regio's. Het apoptose-detectiemiddel in deze concentratie wordt gehandhaafd in alle daaropvolgende stroomoplossingen.Doxorubicine wordt vijf tot acht uur na de toevoeging van de middelen voor de detectie van apoptose geïntroduceerd. Deze behandeling wordt uit het systeem gespoeld. Om chemotherapeutische middelen toe te voegen, dient de procedure voor apoptosedetectie te worden gevolgd om 10 micromol doxorubicinehydrochloride toe te dienen.Vervang vervolgens de behandelspuit door de spuit met 0,7 milliliters medium. Laat de therapeutische stof gedurende een vaste periode doorstromen. Sluit daarna ventiel VFN en schakel de spuitenpomp uit.Verwijder de behandelspuit uit de spuitpomp en vervang deze door een spuit met 0,7 milliliters medium. Laat het verse medium gedurende 24 tot 36 uur doorstromen, terwijl het weefsel continu onder een microscoop wordt gemonitord. Het gehele acquisitieproces voor time-lapse microscopie werd geautomatiseerd met behulp van een aangepast script in IP lab, waarbij elke 30 minuten doorgeಲ್ಲen licht- en fluorescentiebeelden van de PAX Foid werden gemaakt bij een 10 x vergroting. Voor de wiskundige schatting van de diffusiecoëfficiënten van het geneesmiddel is de eerste stap het genereren van gemiddelde lineaire intensiteitsprofielen van de fluorescentie van het medicijn met behulp van Image J. Selecteer een rechthoekig interessegebied, of ROI, dat het weefsel in de kamer omvat.Gebruik het commando plot profile om een profiel van de gemiddelde intensiteiten te genereren als functie van de afstand tot het stroomkanaal. Herhaal dit voor maximaal drie verschillende tijdspunten. Trek vervolgens de gemiddelde achtergrondfluorescentie-intensiteit af van de verkregen intensiteitsprofielen en normaliseer elk profiel met behulp van de overeenkomstige maximale intensiteit om C als functie van X en T te verkrijgen. Hierbij is C de genormaliseerde concentratie doxorubicine, waarbij de waarde van C varieert tussen nul en één.De volgende stap is het evalueren van de effectieve diffusiecoëfficiënt van doxorubicine binnen het tumorweefsel. Diffusie kan worden weergegeven door de volgende vergelijking, waarbij ERFC de complementaire foutfunctie is. X is de afstand in het weefsel vanaf het kanaal, en T is de tijd na de toediening van doxorubicine.Gebruik het volgende iteratieve schema voor elk overwogen tijdstip. Schat een waarde voor D. Bereken de rechterkant van de vergelijking op elke locatie X. Bereken de som van de kwadratische fouten tussen de twee kanten en pas D aan om het gemiddelde residu te minimaliseren.De optimale waarden van D die op elk tijdstip zijn verkregen om de gemiddelde effectieve diffusiecoëfficiënt van doxorubicine in het weefsel te schatten. De microfluïdische apparaten boden optisch toegankelijke kweekkamers van één millimeter bij 0,3 millimeter bij 0,15 millimeter voor de groei van driedimensionaal tumorweefsel. De hanging-dropmethode maakte een snelle vorming mogelijk van tumor-PHE van consistente grootte en vorm uit verschillende cellijnen.PHE werden met succes gedurende maximaal drie dagen op het apparaat gekweekt. Groei in de kamers was geassocieerd met de reproduceerbare modificatie van micro-omgevingen. Binnen de PHE trad apoptose minder vaak op in cellen in directe nabijheid van het stroomkanaal en vaker en dieper in het weefsel.Het apparaat werd gebruikt om de diffusiecoëfficiënt van doxorubicine en tumorweefsel te schatten. De experimenteel verkregen waarde kwam overeen met de waarde die eerder werd gerapporteerd voor menselijke borstkanker. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om extra voorzichtig te zijn met het behouden van steriliteit bij het inbrengen van PHE in het apparaat, aangezien dit buiten de celkweek moet gebeuren.Besproei de spuiten in de zuurkast en de uiteinden van de slangen ruim met ethanol om steriliteit te waarborgen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van de rol van de beperkte penetratie van geneesmiddelen in tumoren. We hebben een techniek gedemonstreerd om de afgifte en systemische klaring van geneesmiddelen in driedimensionale tumorweefsels na te bootsen en hun penetratie te kwantificeren.Het elimineren van geneesmiddelen met een slechte penetratie zal het proces van de ontwikkeling van kanker-geneesmiddelen aanzienlijk stroomlijnen.

microfluidic-device-for-recreating-a-tumor-microenvironment-in-vitro

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Een methode om cultuur een endotheelcel monolaag het gehele inwendige oppervlak van een 3D microfluïdische apparaat met microvasculaire grootte kanalen (&lt;30 pm) beschreven.

Endothelialized Microfluidics voor het bestuderen van microvasculaire Interacties in Hematologische ziekten

In this video, we generate microtumors from patient-derived tumor cells using 3D human biogel. These microtumors closely resemble the in vivo tumor microenvironment and serve as potential platforms for drug testing.

Generation of Microtumors: An In Vitro Culture Technique to Culture 3D Microtumors to Analyze Response to Drug Treatment

Methoden om menselijke 3D tumorweefsels maken als testsystemen worden beschreven. Deze technologieën zijn gebaseerd op een van cellen ontdane biologische Gevasculariseerd Steiger (BioVaSc), primaire humane cellen en tumor cellijn, die kan worden gekweekt in statische als onder dynamische omstandigheden in een stroom bioreactor.

Tissue Engineering van een Menselijke 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Tumor Test System

We hebben een permeabele microporeuze membraaninzet aangepast om het tumormicro-omgeving (TME) te imiteren. Het model bestaat uit een gemengde celcultuur, maakt een vereenvoudigde generatie van sterk verrijkte individuele celpopulaties mogelijk zonder het gebruik van fluorescente markering of celsortering, en maakt het mogelijk om intercellulaire communicatie binnen het TME te bestuderen onder normale of stressomstandigheden.

Een Mimic van de tumor micro: Een eenvoudige methode voor het genereren van verrijkte celpopulaties en Onderzoeken intercellulaire communicatie

We presenteren een microfluïdische Cancer-on-chip-model, de "Evolution Accelerator"-technologie, die een controleerbaar platform biedt voor langdurige realtime kwantitatieve studies van kanker dynamiek binnen goed gedefinieerde omgevingscondities op de eencellige Niveau. Deze technologie wordt verwacht te werken als een in vitro model voor fundamenteel onderzoek of pre-klinische ontwikkeling van de drug.

Generatie van heterogene drugs gradiënten over kanker populaties op een Microfluïdische evolution Accelerator voor real-time observatie

Hier presenteren we een protocol voor het voorbereiden en kweken van een bloed-hersenbarrière gemetastaseerde tumor micro-omgeving en vervolgens kwantificeren van de toestand met behulp van confocale beeldvorming en kunstmatige intelligentie (machine learning).

Kwantificeren van de Brain Gemetastatische Tumor Micro-Environment met behulp van een Organ-On-A Chip 3D Model, Machine Learning en Confocal Tomography

We presenteren een microfluïdisch systeem voor studies met hoge doorvoer op complexe levensmachines, dat bestaat uit 1500 kweekeenheden, een reeks verbeterde peristaltische pompen en een on-site mengmodulus. De microfluïdische chip maakt de analyse van de zeer complexe en dynamische micromilieuomstandigheden in vivo mogelijk.

Generatie van dynamische omgevingsomstandigheden met behulp van een microfluïdisch apparaat met hoge doorvoer

In het tijdperk van immunotherapie en eencellige genomische profilering vereist kankerbiologie nieuwe in vitro en computationele hulpmiddelen voor het onderzoeken van de tumor-immuuninterface in een juiste spatiotemporale context. We beschrijven protocollen om tumor-immuun microfluïdische co-culturen te exploiteren in 2D- en 3D-instellingen, compatibel met dynamische, multiparametrische monitoring van cellulaire functies.

Microfluïdische co-cultuurmodellen voor het ontleden van de immuunrespons in in vitro tumormicro-omgevingen

Hier bieden we een microfluïdische chip en een automatisch gecontroleerd, zeer efficiënt circulatiemicrofluïdisch systeem dat de initiële micromilieu van neovascularisatie samenvat, waardoor endotheelcellen (EC's) tegelijkertijd kunnen worden gestimuleerd door hoge luminale schuifspanning, fysiologisch niveau van transendotheliale stroom en verschillende vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) distributie tegelijkertijd.

Microfluïdisch model om de eerste gebeurtenis van neovascularisatie na te bootsen

Dit protocol presenteert een fysiologisch relevant tumor-on-a-chip-model om basis- en translationeel kankeronderzoek bij mensen met een hoge doorvoer uit te voeren, het screenen van geneesmiddelen, ziektemodellering en gepersonaliseerde geneeskundebenaderingen te bevorderen met een beschrijving van laad-, onderhouds- en evaluatieprocedures.

Opzetten van een fysiologisch menselijk gevasculariseerd microtumormodel voor kankeronderzoek

Hier presenteren we protocollen met gedetailleerde instructies voor het implementeren van 3D-celculturen met behulp van collageen- en collageen-agarosematrices in een microfysiologisch systeem. Deze protocollen ondersteunen de co-cultuur van spheroïden in de nierproximale tubulus en niercelcarcinoom, waardoor in vivo omstandigheden worden gesimuleerd en geavanceerd onderzoek naar interacties tussen nierkankercellen mogelijk wordt.

Microfluïdische co-cultuur van gezond nier- en tumorepitheel om de progressie van nierkanker te modelleren

Leer hoe u een microfluïdische chip fabriceert om tumor-microomgevingen in vitro te recreëren voor het testen van chemotherapeutica. Deze methode simuleert 3D-tumorweefsel en kwantificeert apoptose en medicijndiffusie.

Microfluïdische apparaat voor het herstellen van een tumor micro-omgeving

Meer video's verkennen