Microfluïdische apparaat voor het herstellen van een tumor micro-omgeving In vitro
November 20th, 2011
We presenteren de procedure voor de productie en exploitatie van een microfluïdische apparaat dat heterogene tumor micro-omgevingen herschept In vitro. De variabiliteit in apoptose in tumorweefsel werd gekwantificeerd met behulp fluorescerende vlekken en effectieve diffusiecoëfficiënt van het chemotherapeuticum doxorubicine in tumorweefsel werd geëvalueerd.
Het algemene doel van deze procedure is om de fabricage en werking van een microfluïdisch apparaat te demonstreren dat tumormicro-omgevingen in vitro recreëert en kan worden gebruikt voor het testen van chemotherapeutische geneesmiddelen. Dit is het microfluïdische apparaat. Dit apparaat kan nuttig zijn op de volgende gebieden, gemakkelijk testen voor chemotherapeutische geneesmiddelen in vitro.
Het biedt consistente en nauwkeurige resultaten voor het testen van driedimensionaal tumorweefsel, en dit apparaat biedt een zeer nauwkeurige weergave van in vivo tumor. Micro-omgevingen tumoren bestaan in 3D-micro-omgevingen en de mogelijkheid om in een te testen is significant. De eerste stap van de procedure is om het apparaat te assembleren, wat het maken van een microfluïdische chip met behulp van zachte litografie inhoudt, het ponsen van gaten bij de inlaten en uitlaten, het verlijmen op een glasplaat en het aansluiten van slangen voor de instroom en uitstroom.
Vervolgens worden de uniforme multicellulaire tumorsteroïden gegenereerd voor gebruik in het apparaat met behulp van de hangende druppelmethode. De sferen worden vervolgens in het apparaat gebracht, gevolgd door apoptose, detectiemiddelen en chemotherapeutische geneesmiddelen. Ten slotte wordt time-lapse microscopie uitgevoerd, gevolgd door wiskundige schatting van geneesmiddeldiffusiecoëfficiënten om de penetratievermogen van het chemotherapeutische middel te kwantificeren.
Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die weefselgroei in de apparaatvorming van heterogene micro-omgevingen binnen het weefsel en geneesmiddeldiffusie in het weefsel tonen door gebruik van time-lapse fluorescentiemicroscopie. Beperkte penetratie van kankergeneesmiddelen in vaste tumoren is een belangrijke oorzaak van hun falen. De meeste huidige kankergeneesmiddeltestmodellen bootsen de driedimensionale aard van vaste tumoren niet na.
We hebben een microfluïdisch apparaat ontwikkeld dat bestaat uit continu geperfundeerde driedimensionale tumorweefsels. Dit model vertegenwoordigt nauwkeuriger de aflevering van geneesmiddelen aan vaste tumoren en hun systemische klaring. Multicellulaire tumorsteroïden zijn een goed gevestigd model van driedimensionale tumorweefsels.
In deze procedure wordt de hangende druppelmethode gebruikt om steroïden te maken voor gebruik in het microfluïdische apparaat. Deze methode maakt de vorming van consistente steroïden in een korte periode mogelijk. Het testen van chemotherapeutische geneesmiddelen in vitro in driedimensionaal weefsel kan helpen bij het screenen van geneesmiddelen op een efficiëntere manier vergeleken met celmonolagen.
Meng het PDMS en de verharder van de siliconenelastomeer in een gewichtsverhouding van negen tot één. Giet vervolgens dit mengsel over de master om een vier millimeter dikke glans te degasseren. Om luchtbellen te verwijderen, houdt u deze vijf uur op 60 graden Celsius.
Trek het uitgeharde PDMS van de mal om een stempel van stromingskenmerken op de elastomeer te verkrijgen. Druk vervolgens met behulp van een ander halve millimeter biopsiepomp gemonteerd op een boor, ponsgaten voor inlaten en uitlaten. Verwijder eventueel puin.
Onderwerp de kenmerkende zijde van de stempel en een schone glasplaat gedurende acht minuten aan zuurstofplasma. Breng in een zuurstofplasma-etcher de behandelde oppervlakken onmiddellijk in contact om een binding tussen hen te vormen. Houd de montage gedurende minstens vijf uur op 60 graden Celsius op een schuifverwarming.
Om de binding te versterken, verbindt u 0,032 inch ID PTFE-slangen met de inlaten en uitlaten van het microfluïdische apparaat. Met behulp van een interface van mannelijke lure lock-connectors die zijn bevestigd aan vrouwelijke lure lock-connectors met borstels, worden deze specifieke connectoren gebruikt om er gemakkelijk doorheen te gaan zonder te breken. Stel ten slotte de stromingsmontage in met behulp van afsluitkleppen en een Y-connector, monteer het apparaat op de microscoop Na montage van het apparaat, sluit u slangen aan op de juiste inlaten en uitlaten om de stroomopstelling te voltooien.
Zoals getoond in deze figuur, maakt deze configuratie het gemakkelijk en veelzijdig om een sfeer in het apparaat te plaatsen of een stroom van medium door het apparaat te creëren om te verpakken. Open de pakklep van de inlaat VPN en de pakklep van de uitlaat VP out een tumor. OID kan vervolgens door de inlaat stromen en in de kweekkamer stromen waar de post in deze kamer de tumor op zijn plaats zal houden om medium te stromen.
Sluit de pakkleppen en open de stromingsinlaatklep VF in en de stromingsuitlaatklep VF out om de vorming van uniforme PHE te initiëren. Gebruik de hangende druppelmethode trypsine ijscellen onder een kweekkap. Neem de resulterende trypsinecellen uit de centrifuge.
Verdun de stockoplossing tot de gewenste concentratie door tabel één te raadplegen. Verwijder vervolgens het deksel van een 48-well plate en plaats het ondersteboven. Vul in een gesteriliseerde kap elk putje van de plaat met één milliliter gesteriliseerd water.
Om de luchtvochtigheid te behouden, plaatst u een druppel van 20 microliter verdunde celoplossing in elk cirkelvormig gebied op het deksel. Draai de deksel voorzichtig met een micropipet om en plaats het over de plaat, zodat de druppels de randen van de putjes niet raken. Incubeer de plaat op 37 graden Celsius.
Raadpleeg tabel één voor de duur van de incubatie op basis van de specifieke cel die wordt gebruikt, een steroïd zal zich in elke hangende druppel vormen. Begin door het apparaat te steriliseren door het met 70% ethanol via de stromingsinlaat te spoelen. Volg met een spoeling van PBS, vervolgens H-E-P-E-S gebufferd celkweekmedium.
Laat de mediumspuit aan de slang bevestigen. Trek vervolgens twee tot drie steroïden in de spuit in de spuit. Om luchtbellen te verwijderen, bevestigt u de spuit aan de pakkinginlaat van het apparaat.
Open de inlaatklep VPN en sluit VFN open uitlaatklep VP out en sluit VF out. Houd de pakkingspuit verticaal met de naald naar beneden gericht. Kijk hoe de steroïd naar de bodem van de spuit zakt in de lure lock-connector van de naald.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een procedure voor de fabricage en werking van een microfluïdisch apparaat dat is ontworpen om heterogene tumormicro-omgevingen in vitro te herscheppen. Het apparaat maakt het mogelijk om chemotherapeutische geneesmiddelen te testen en biedt een nauwkeurigere weergave van in vivo tumoromstandigheden.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Microfluidica
- Oncologie
- Geneesmiddelentesten
Achtergrond
- Microfluïdische apparaten kunnen complexe biologische omgevingen simuleren.
- Heterogene tumormicro-omgevingen zijn cruciaal voor nauwkeurig geneesmiddelentesten.
- Het begrijpen van geneesmiddeldiffusie in tumoren is essentieel voor een effectieve behandeling.
- Fluorescente kleuring kan cellulaire processen zoals apoptose kwantificeren.
Doel van de studie
- Om de fabricage van een microfluïdisch apparaat te demonstreren.
- Om tumormicro-omgevingen te herscheppen voor in vitro-testen.
- Om de diffusie van chemotherapeutische middelen zoals doxorubicine te evalueren.
Gebruikte methoden
- Fabricage van een microfluïdische chip met behulp van zachte litografie.
- Punsen van gaten voor vloeistofinlaten en -uitlaten.
- Het hechten van de chip aan een glasplaat.
- Aansluiten van buizen voor vloeistofstroom.
Belangrijkste resultaten
- Het apparaat levert consistente en nauwkeurige resultaten op voor geneesmiddelentesten.
- Het simuleert effectief de 3D-structuur van tumorweefsels.
- Kwantificering van apoptosevariabiliteit binnen tumorweefsel werd bereikt.
- De effectieve diffusiecoëfficiënt van doxorubicine werd geëvalueerd.
Conclusies
- Het microfluïdische apparaat is een waardevol hulpmiddel voor kankeronderzoek.
- Het verbetert het begrip van geneesmiddelinteracties binnen tumoren.
- Deze aanpak kan leiden tot verbeterde therapeutische strategieën.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Recreating the tumor microenvironment in vitro addresses a critical gap in oncology drug discovery by enabling predictive assessment of drug penetration and efficacy in heterogeneous, three-dimensional tissues. This microfluidic platform supports early de-risking of candidate compounds by modeling nutrient gradients and cellular heterogeneity that drive therapeutic resistance. Integrating such physiologically relevant models into the discovery pipeline enhances translational confidence and portfolio decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of drug penetration and retention in 3D tumor-like tissues.
- Supports functional validation of targets under physiologically relevant gradients.
- Facilitates mechanistic de-risking by modeling viable, quiescent, and necrotic cell zones.
- Improves predictive confidence for compound triage and prioritization.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible platform for quantitative drug diffusion and apoptosis assays.
- Standardizes 3D spheroid formation for consistent assay outputs across cell lines.
- Enables time-lapse microscopy and automated image analysis for high-content screening.
- Supports scalable evaluation of compound efficacy in complex tissue contexts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro drug response with in vivo tumor heterogeneity for translational continuity.
- Enables estimation of diffusion coefficients relevant to human tumor tissues.
- Supports risk-adjusted advancement by modeling drug clearance and microenvironmental effects.
- Facilitates biomarker discovery linked to spatial apoptosis patterns.
Pipeline & Workflow Integration
This microfluidic model bridges early discovery and preclinical validation by providing a physiologically relevant assay for drug penetration and efficacy. It is positioned for integration from target validation through lead identification and translational research.
- Discovery Biology: Quantifies drug diffusion and apoptosis gradients to clarify mechanistic barriers to efficacy.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound comparison in 3D tissue contexts.
- Analytics: Enables mathematical estimation of diffusion coefficients and spatial intensity profiles.
- Translational Research: Models clinically relevant microenvironments to inform preclinical decisions.
- Enterprise Reuse: Provides a standardized, reusable platform for oncology drug development workflows.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in drug response.
- Operational Value: Enhances assay standardization, reproducibility, and scalability for 3D models.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by modeling key resistance mechanisms early.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of oncology assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, 3D cell culture, and quantitative imaging.
- Needs access to soft lithography, time-lapse microscopy, and image analysis infrastructure.
- Demands rigorous sterility and cross-team standardization for reproducible results.
- Adaptation across cancer cell lines is supported by the hanging drop spheroid method.
- Practical limitations include device handling outside of sterile hoods and short-term culture duration.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:50
Introduction
2:52
Microfluidic Device Fabrication
5:45
Formation of Uniform Tumor Spheroids using the Hanging Drop Method
7:04
Introduction of Spheroids into the Microfluidic Device
9:18
Introduction of Apoptosis-detecting Agent into the Microfluidic Device
10:50
Introduction of Therapeutic Agents into the Microfluidic Device
11:59
Time Lapse Microscopy and Estimation of Drug Diffusivity Coefficients
14:25
Representative Results
15:30
Concluding Remarks
