Detection of Fish Pathogens Using Variable Number Tandem Repeat (VNTR) Analysis
JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologie
0 weergaven • 3:01 min • November 28th, 2025
Begin with a PCR plate containing a formamide-based denaturing solution.
Add the diluted PCR amplicons derived from a fish-pathogenic bacterium into each well.
These amplicons contain fluorescently tagged variable number tandem repeats (VNTRs), short repetitive sequences used as genetic markers for bacterial identification.
Seal the plate and centrifuge to eliminate air bubbles.
Heat the plate in a thermal cycler to denature the double-stranded VNTRs.
Formamide enhances strand separation and inhibits re-annealing.
Cool the plate rapidly to stabilize the single-stranded DNA.
Centrifuge to collect the sample volume.
Remove the seal, and secure the plate with a frame.
Place the capillary tube and perform capillary electrophoresis.
During electrophoresis, VNTR fragments migrate through the capillary under an electric field and separate by size.
A laser excites the fluorescent tags on each fragment, producing color-coded signals.
The resulting electropherogram shows VNTR peak patterns that correspond to the pathogenic bacterium.
Following confirmation of PCR amplicons, use new PCR strips or plates to dilute PCR products 1 to 10 in purified water. Vortex and centrifuge briefly. While working in a fume cupboard, prepare a master mix in a centrifuge tube consisting of formamide and reference-size standard solution.
According to the number of PCR products to be analyzed, use reagent volumes as detailed in the manuscript. Allow a 10% surplus volume. Vortex briefly and distribute 9.5 microliters into individual wells on a PCR plate appropriate for the available capillary electrophoresis system.
Then, add 0.5 microliters of diluted PCR product. Seal and centrifuge briefly. Then, load the plate containing the samples into a PCR thermo cycler and denature the samples at 95 degrees Celsius for three minutes before cooling to 4 degrees Celsius indefinitely.
Centrifuge at 1000 g for one minute, carefully remove the seal, and load the plate onto a calibrated capillary electrophoresis system according to the manufacturer's instructions. Run fragment analysis capillary electrophoresis, using reagents as appropriate for the apparatus of choice, and adjust the run conditions according to the description in the manuscript.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het analyseren van variabele aantal tandemherhalingen (VNTR's) in PCR-amplicons afkomstig van vispathogene bacteriën. Het proces maakt gebruik van capillaire elektroforese om deze genetische markers te scheiden en te identificeren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Microbiologie
- Genetica
- Moleculaire biologie
Achtergrond
- Variabele aantal tandemherhalingen (VNTR's) dienen als genetische markers voor bacteriële identificatie.
- Capillaire elektroforese is een techniek die wordt gebruikt om DNA-fragmenten op basis van grootte te scheiden.
- Fluorescente markering verbetert de detectie van VNTR's tijdens de analyse.
- Formamide wordt gebruikt om DNA te denatureren en de scheidingsefficiëntie te verbeteren.
Doel van de studie
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor de analyse van VNTR's in bacteriële monsters.
- Om de effectiviteit van capillaire elektroforese aan te tonen bij het identificeren van pathogene bacteriën.
- Om reproduceerbaarheid en nauwkeurigheid bij genetische analyse te waarborgen.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van PCR-platen met een denatureringsoplossing op basis van formamide.
- Gebruik van fluorescentie-gelabelde VNTR's voor de identificatie van genetische markers.
- Capillaire elektroforese voor grootte-gebaseerde scheiding van DNA-fragmenten.
- Analyse van electroferogrammen om bacteriële stammen te identificeren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle scheiding van VNTR-fragmenten middels capillaire elektroforese.
- Duidelijke identificatie van pathogene bacteriën op basis van VNTR-piekpatronen.
- Reproduceerbare resultaten die de betrouwbaarheid van de methode aantonen.
- Effectief gebruik van formamide ter verbetering van de DNA-analyse.
Conclusies
- De beschreven methode biedt een robuuste benadering voor bacteriële identificatie.
- Capillaire elektroforese is een waardevol instrument bij genetische analyse.
- Verdere toepassingen van VNTR-analyse kunnen de microbiële diagnostiek verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor het management
Multi-locus VNTR-analyse met capillaire elektroforese maakt nauwkeurige genetische profilering van vispathogene bacteriën mogelijk, wat bijdraagt aan de identificatie van pathogenen in een vroeg stadium en risicobeoordelingen binnen biopharma R&D. Deze workflow vergroot het voorspellend vertrouwen bij het opsporen van microbiële bronnen en informeert portfoliobeslissingen voor de ontwikkeling van vaccins of therapieën gericht op aquatische pathogenen. De reproduceerbaarheid en kwantitatieve resultaten van de methode maken het een robuust instrument voor translationeel onderzoek en pipelines voor assay-ontwikkeling.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt genetische differentiatie van pathogene stammen mogelijk voor functionele targetvalidatie.
- Ondersteunt mechanische risicoreductie door de identiteit en diversiteit van pathogenen te verduidelijken.
- Faciliteert portfoliotriage door het leveren van betrouwbare gegevens voor microbiële identificatie.
Screening & assay-ontwikkeling
- Bereidt gevalideerde bacteriële profielen voor voor downstream screening-workflows.
- Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare en kwantitatieve VNTR-electropherogramuitgangen.
- Maakt schaalbare en platformcompatibele pathogenen-detectieassays mogelijk.
- Ondersteunt betrouwbare evaluatie van kandidaatverbindingen tegen genetisch gedefinieerde stammen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt de identificatie van pathogenen uit met ziekterelevante aquatische modellen.
- Waarborgt continuïteit van de ontdekking tot de preklinische validatie van anti-infectieve strategieën.
- Vermindert het biologische risico door stam-specifieke specificiteit te bevestigen in translationele studies.
Integratie van Pipeline & Workflow
VNTR-analyse via capillaire elektroforese integreert in het continuüm van ontdekking naar preklinisch onderzoek en biedt een mogelijkheid voor genetische vingerafdrukken voor de validatie van microbiële targets en de gereedheid van assays.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en biologische risicovermindering door de identiteit van pathogenen te bevestigen.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve VNTR-profielen voor assay-standaardisatie.
- Analytiek: Biedt grootte-specifieke electropherogram-outputs voor comparatieve analyse tussen verschillende condities.
- Translationeel onderzoek: Maakt afstemming van pathogeendetectie met ziekterelevante aquatische modellen mogelijk.
- Bedrijfsbrede hergebruik: Biedt een herbruikbaar platform voor genetische analyse van diverse microbiële doelwitten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert ambiguïteit bij de identificatie van pathogenen.
- Operationele waarde: Standaardiseert workflows en waarborgt reproduceerbaarheid tussen R&D-teams.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen en optimaliseert de toewijzing van middelen voor anti-infectieve portfolio's.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk van kandidaat-interventies gericht op aquatische pathogenen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in PCR, capillaire elektroforese en fragmentanalyse.
- Toegang tot gekalibreerde capillaire elektroforese-instrumentatie en fluorescentiedetectiesystemen is noodzakelijk.
- Vereist cross-team standaardisatie van protocollen voor monsterpreparatie en datainterpretatie.
- Aanpasbaar aan verschillende bacteriële soorten met een passende selectie van VNTR-markers.
- Afhankelijk van de kwaliteitscontrole van reagentia en instrumentkalibratie voor reproduceerbaarheid.
Veelgestelde vragen over biofarmacie
Laboratorium Protocol voor genetische Analyses van de inhoud van de Gut van aquatische Macroinvertebrates gebruiken groepsspecifieke rDNA Primers
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Detectie van Tilapia Lake Virus met behulp van conventionele rechts-PCR en SYBR groene RT-qPCR
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Multi-Locus variabele-nummer tandem-herhaling analyse van de vis-pathogene bacterie Yersinia ruckeri door multiplex PCR en capillaire elektroforese
Gerelateerde video's
0 Bekeken
DNA-gebaseerde Vissoorten Identification Protocol
Gerelateerde video's
0 Bekeken
DNA-vingerafdrukken van Mycobacterium leprae Stammen Met behulp van variabel aantal Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Lengte Analyse (FLA)
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Snelle en efficiënte zebravis Genotyping Met behulp van PCR met een hoge resolutie Melt Analyse
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Verbeterde Polymerase Chain Reaction-restrictiefragmentlengtepolymorfisme Genotypering van Toxic Pufferfish door vloeistofchromatografie / massaspectrometrie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
High-throughput detectie van respiratoire pathogene in dierlijke specimens door nanoschaal PCR
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Digitale PCR-gebaseerde competitieve index voor high-throughput analyse van de geschiktheid in salmonella
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Reverse Transcription Loop-Bemiddelde Isothermale Versterking (RT-LAMP) Assay voor de specifieke en snelle detectie van Tilapia Lake Virus
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026