Name: Respirometrische oxidatieve fosforylering Assessment in Saponin-gepermeabiliseerde Cardiac Vezels (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-28T18:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Leer hoe je saponine-gepermeabiliseerde hartvezels bereidt voor respirometrische OXPHOS-metingen. Deze methode maakt nauwkeurige beoordeling van mitochondriale functie in situ mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd ondersteund door de Canadese Institutes of Health Research en Genome Canada. JS houdt salaris ondersteuning awards van de Alberta Heritage Foundation voor Medisch Onderzoek, Hart en Stroke Foundation van Canada en de Canadese Diabetes Association. Het laboratorium wil de technische bijstand van Oroboros Instruments te erkennen tijdens de overname van de saponine-gepermeabiliseerde glasvezel techniek.

<ol><li>Saks, V. A., Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilized+cell+and+skinned+fiber+techniques+in+studies+of+mitochondrial+function+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo.</a> Mol Cell Biochem. 184, 81-100 (1998).</li>
<li>Gnaiger, E., Kuznetsov, A. V., Schneeberger, S. Mitochondria in the cold. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGnaiger%2C+E+%22Life+in+the+Cold%22">Life in the Cold</a>. Heldmaier, G., Klingenspor, M. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York. 431-442 (2000).</li>
<li>Rasmussen, H. N., Rasmussen, U. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+solubilities+of+media+used+in+electrochemical+respiration+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Oxygen solubilities of media used in electrochemical respiration measurements.</a> Anal Biochem. 319, 105-113 (2003).</li>
<li>Visscher, G. D. e, Rooker, S., Jorens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pentobarbital+fails+to+reduce+cerebral+oxygen+consumption+early+after+non-hemorrhagic+closed+head+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Pentobarbital fails to reduce cerebral oxygen consumption early after non-hemorrhagic closed head injury in rats.</a> J Neurotrauma. 22, 793-806 (2005).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., Veksler, V., Gellerich, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function+in+situ+in+permeabilized+muscle+fibers%2C+tissues+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells.</a> Nat Protoc. 3, 965-976 (2008).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+conformance+of+cellular+respiration.+A+perspective+of+mitochondrial+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Oxygen conformance of cellular respiration. A perspective of mitochondrial physiology.</a> Adv Exp Med Biol. 543, 39-55 (2003).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacity+of+oxidative+phosphorylation+in+human+skeletal+muscle%3A+new+perspectives+of+mitochondrial+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology.</a> Int J Biochem Cell Biol. 41, 1837-1845 Forthcoming.</li>
<li>Sena, S., Hu, P., Zhang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+insulin+signaling+accelerates+cardiac+mitochondrial+dysfunction+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Impaired insulin signaling accelerates cardiac mitochondrial dysfunction after myocardial infarction.</a> J Mol Cell Cardiol. 46, 910-918 (2009).</li>
<li>Boudina, S., Sena, S., O'Neill, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+mitochondrial+oxidative+capacity+and+increased+mitochondrial+uncoupling+impair+myocardial+energetics+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Reduced mitochondrial oxidative capacity and increased mitochondrial uncoupling impair myocardial energetics in obesity.</a> Circulation. 112, 2686-2695 (2005).</li>
<li>Lenaz, G., Genova, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+organization+of+mitochondrial+respiratory+complexes%3A+a+new+understanding+of+an+old+subject%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Structure and organization of mitochondrial respiratory complexes: a new understanding of an old subject.</a> Antioxid Redox Signal. 12, 961-1008 Forthcoming.</li>
<li>Lemieux, H., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in the human heart.</a> J Bioenerg Biomembr. 41, 99-106 (2009).</li>
<li>O, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retarded+diffusion+of+ADP+in+cardiomyocytes%3A+possible+role+of+mitochondrial+outer+membrane+and+creatine+kinase+in+cellular+regulation+of+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Retarded diffusion of ADP in cardiomyocytes: possible role of mitochondrial outer membrane and creatine kinase in cellular regulation of oxidative phosphorylation.</a> Biochim Biophys Acta. 1144, 134-148 (1993).</li>
<li>Endo, M., Kitazawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-C+coupling+studies+in+skinned+cardiac+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Aspects+of+Cardiac+Muscle%22%5BJournal%5D)">E-C coupling studies in skinned cardiac fibers.</a> Biophysical Aspects of Cardiac Muscle. Morad, M. , Academic. New York. 307-327 (1978).</li>
<li>Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V., Sharov, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+parameters+in+cardiac+tissue%3A+a+novel+method+of+assessment+by+using+saponin-skinned+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory parameters in cardiac tissue: a novel method of assessment by using saponin-skinned fibers.</a> Biochim Biophys Acta. 892, 191-196 (1987).</li>
<li>Bangham, A. D., Horne, R. W., Glauert, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+of+saponin+on+biological+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Action of saponin on biological cell membranes.</a> Nature. , 196-952 (1962).</li>
<li>Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipids+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Lipids of mitochondria.</a> Biochim Biophys Acta. 822, 1-42 (1985).</li>
<li>Milner, D. J., Mavroidis, M., Weisleder, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desmin+cytoskeleton+linked+to+muscle+mitochondrial+distribution+and+respiratory+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Desmin cytoskeleton linked to muscle mitochondrial distribution and respiratory function.</a> J Cell Biol. 150, 1283-1298 (2000).</li>
<li>Skladal, D., Sperl, W., Schranzhofer, R. Preservation of mitochondrial functions in human skeletal muscle during storage in high energy preservation solution (HEPS). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSkladal%2C+D+%22What+is+Controlling+Life%3F%22">What is Controlling Life?</a>. Skladal, E., Gellerich, F., Wyss, M. , Univ. Press. Vol 3. Modern Trends in BioThermoKinetics 268-271 (1994).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., Wiedemann, F. R., Winkler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+saponin-permeabilized+muscle+fibers+for+the+diagnosis+of+mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biofactors%22%5BJournal%5D)">Use of saponin-permeabilized muscle fibers for the diagnosis of mitochondrial diseases.</a> Biofactors. 7, 221-223 (1998).</li>
<li>Gnaiger, E. Polarographic oxygen sensors, the oxygraph and high-resolution respirometry to assess mitochondrial function. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGnaiger%2C+E+%22Drug-Induced+Mitochondrial+Dysfunction%22">Drug-Induced Mitochondrial Dysfunction</a>. Dykens, J., Will, Y. , John Wiley & Sons, Inc. 327-352 (2008).</li>
</ol>

De saponine-gepermeabiliseerde cardiale fiber techniek biedt een uniek compromis tussen in vitro en in vivo evaluatie van de mitochondriale OXPHOS zuurstof verbruik. Voordelen van deze techniek zijn onder meer fysiologische relevantie in vergelijking met geïsoleerde mitochondria als cellulaire architectuur is bewaard gebleven. Terwijl de plasmamembraan is afgebroken, intracellulaire membraan structuren met inbegrip van mitochondria 12, 14, 14 sarcoplasmatisch reticulum, myofilamenten en het ...

<table><tbody><tr><td>100% Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>HC600</td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>HC-1000</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;#8242;-difosfaat monokaliumzout dihydraat (ADP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5285</td><td></td></tr><tr><td>Albumine uit runderserum, essentieel vetzuur&amp;#8211;vrij</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-6003</td><td></td></tr><tr><td>Antimycine A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbinezuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;#8242;-trifosfaat dinatriumzout hydraat (ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Atractyloside</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6882</td><td></td></tr><tr><td>Calciumcarbonaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4830</td><td></td></tr><tr><td>Carbonylcyanide p-(trifluoromethoxy)fenylhydrazon (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>Cytochroom c</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7752</td><td></td></tr><tr><td>Digitonine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreïtol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>Ethyleenglycol-bis-(2-amino&amp;#8211;ethylether)-N,N,N&amp;#8242;,N&amp;#8242;-tetraazijnzuur (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Glutaminezuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27647</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Pfizer Pharma GmbH</td><td></td><td>Ketaset</td></tr><tr><td>Lactobionzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>153516</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloride (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloride hexahydraat (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8729;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Appelzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1000</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-Tetramethyl-p-fenyleendiamine dihydrochloride (TMPD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3134</td><td></td></tr><tr><td>Oligomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4876</td><td></td></tr><tr><td>Fosfocreatine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumhydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumcyanide</td><td>Fluka</td><td>60178</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumfosfaat monobasisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Saponine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpentobarbital</td><td>Ceva Sante Animale</td><td>1715 138</td><td>Conc. 54.7 mg/ml</td></tr><tr><td>Natriumpyruvaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Barnsteenzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3674</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8691</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Bayer AG</td><td></td><td>Rompun</td></tr><tr><td>ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ijs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oroboros Oxygraph-2k</td><td>Oroboros Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>VWR international</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>15 ml polypropyleen centrifugebuizen</td><td>VWR international</td><td>89004-368</td><td></td></tr><tr><td>50 ml polypropyleen centrifugebuizen</td><td>VWR international</td><td>89004-364</td><td></td></tr><tr><td>Rechte juwelierspincet</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>160-50B</td><td></td></tr><tr><td>Gebogen juwelierspincet</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>160-57B</td><td></td></tr><tr><td>Rechte chirurgische schaar</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>105-402</td><td></td></tr><tr><td>Steriel chirurgisch scalpelmesje</td><td>VWR international</td><td>BD371610</td><td></td></tr><tr><td>0.45-&amp;mu;m spuitfilters</td><td>VWR international</td><td>CA28145-485</td><td></td></tr><tr><td>pH-meter</td><td>VWR international</td><td>CA11388-308</td><td></td></tr><tr><td>Glazen petrischalen</td><td>VWR international</td><td>89000-300</td><td></td></tr><tr><td>Polystyreen weefselkweekplaten met 12 putjes</td><td>VWR international</td><td>82050-926</td><td></td></tr><tr><td>Magnetroerder</td><td>VWR international</td><td>97042-594</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand magneetvisjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-511-67</td><td></td></tr><tr><td>Weegschaal</td><td>VWR international</td><td>CA11278-162</td><td></td></tr><tr><td>10&amp;mu;l Hamilton microspuit</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-815-1</td><td></td></tr><tr><td>25&amp;mu;l Hamilton microspuit</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-824-7</td><td></td></tr><tr><td>50&amp;mu;l Hamilton microspuit</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-824-5</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene knijpflesjes</td><td>Wilkem Scientific</td><td>LNA2407-1000</td><td></td></tr><tr><td>Polystyreen weegschaaltjes</td><td>VWR international</td><td>89106-750</td><td></td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

respirometrische oxidatieve fosforylering assessment in saponin-gepermeabiliseerde cardiac vezels

Respirometric Oxidative Phosphorylation Assessment in Saponin-permeabilized Cardiac Fibers

Onderzoek van mitochondriale functie is een belangrijke parameter van de cardiale fysiologie als mitochondriën betrokken zijn bij energie-metabolisme, oxidatieve stress, apoptose, veroudering, mitochondriale encephalomyopathies en drugs toxiciteit. Gezien deze, technologieën om cardiale mitochondriale functie te meten zijn in de vraag. Een techniek die een geïntegreerde benadering maakt gebruik van op maat mitochondriale functie is respirometrische oxidatieve fosforylering (OXPHOS) analyse. Het principe van respirometrische OXPHOS beoordeling is gecentreerd rond het meten van zuurstof met behulp van een Clark-elektrode. Omdat de gepermeabiliseerde vezelbundel verbruikt zuurstof, zuurstof-concentratie in de gesloten kamer af. Met behulp van geselecteerde substraat-remmer-ontkoppelrail titratie protocollen, worden elektronen verstrekt aan specifieke plaatsen van het elektron transport keten, waardoor de evaluatie van de mitochondriale functie. Voorafgaand aan respirometrische analyse van de mitochondriale functie, mechanische en chemische voorbereidende technieken worden gebruikt om de sarcolemma van spiervezels permeabilize. Chemische permeabilisatie heeft saponine om selectief te perforeren het celmembraan met behoud van mobiele architectuur. Dit document beschrijft uitvoerig de stappen die betrokken zijn bij de voorbereiding van saponine huid cardiale vezels voor zuurstofverbruik metingen om mitochondriale OXPHOS te evalueren. Bovendien, het oplossen van problemen advies evenals specifieke substraten, remmers en uncouplers die kunnen worden gebruikt om de mitochondriën functioneren vast te stellen op specifieke plaatsen van het elektron transport keten geleverd. Belangrijk is, kan de beschreven protocol eenvoudig worden toegepast op hart-en skeletspieren weefsel van verschillende diermodellen en menselijke monsters.

Saponine-gepermeabiliseerde vezels voorbereiding in combinatie met respirometrische oxidatieve fosforylering analyse geeft integratieve beoordeling van de mitochondriale functie. Mitochondriale ademhaling in fysiologische en pathologische toestanden kan weerspiegelen verschillende regelgevende invloeden waaronder mitochondriale interacties, morfologie en biochemie.

Respirometrische oxidatieve fosforylering Assessment in Saponin-gepermeabiliseerde Cardiac Vezels

Het onderzoek naar de mitochondriale functie vormt een belangrijke parameter van de cardiale fysiologie, aangezien mitochondria betrokken zijn bij het energiemetabolisme, ...

Het algemene doel van deze procedure is om saponine-permeabiliseerde hartvezels voorly polarografische metingen voor te bereiden. Dit wordt bereikt door eerst het hart uit de muis te excideren. De tweede stap van de procedure is het mechanisch prepareren van hartvezelbundels die maximaal zes tot acht losjes verbonden vezels bevatten.Vervolgens worden de hartbundels chemisch gepermeabiliseerd met saponine. De hartbundels worden daarna gewassen om saponine en eventuele resterende metabolieten te verwijderen. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die inzicht bieden in de mitochondriale oxidatieve fosforylering via polarigrafische metingen.Hoi, ik ben Curtis Huey van het laboratorium van Dr. Jane Sheer van de afdeling Biochemie en Moleculaire Biologie aan de Universiteit van Calgary. Vandaag laten we u een procedure zien voor het prepareren van saponine-gepermeabiliseerde hartvezels. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de in situ mitochondriale oxidatieve fosforylering te beoordelen.Laten we beginnen. Om met deze procedure te starten, verwijdert u een marien hart en plaatst u dit in een Petrischaal met RP-oplossing op ijs. Verwijder met behulp van een dissectiemicroscoop voorzichtig al het bindweefsel en of vet.Snijd het hart in tweeën langs het septum en exciseer 10 tot 25 milligram nat gewicht aan weefsel door te snijden vanaf het endocardiumoppervlak van de linker ventrikel. Zorg ervoor dat de incisie in de richting van de vezeloriëntatie verloopt om mechanische schade aan het myocard te minimaliseren. Plaats het gedisseceerde weefselmonster in een aparte Petrischaal met de RP-oplossing op ijs.Snijd het hart in longitudinale stroken langs de vezelrichting met een diameter van 1 tot 1,5 millimeter. Verkort de stroken met een scalpel tot een lengte tussen 2 en 4 millimeter, waarbij u uiterste zorgvuldigheid en scherpe pincetten gebruikt. Scheid de vezelbundels mechanisch.De uiteindelijke vezelbundels moeten maximaal zes tot acht vezels bevatten die met elkaar verbonden zijn door kleine contactoppervlakken en een nat gewicht hebben tussen één en drie milligram. Visueel gezien moet het hartweefsel veranderen van de oorspronkelijke rode kleur naar een bleekroze kleur. Begin de preparatie van de hartvezelbundels door een 12-wells plaat op ijs te plaatsen.Spoel de putjes met RP-oplossing om calciumcontaminatie te minimaliseren. Voeg drie milliliter ijskoude RP-oplossing met 50 micrograms per milliliter saponine toe aan een van de putjes. Draag vervolgens de mechanisch geprepareerde vezelbundels over naar het putje.Incubeer de vezelbundels 20 minuten op ijs onder milde menging. Spoel een nieuw wel weg met mirror five-oplossing en pipetteer 10 milliliters ijskoud mirror five in het nieuwe wel. Breng de cardiale bundels over naar het wel en incubeer deze 10 minuten op ijs onder milde menging.Herhaal na incubatie de mirror five. Was twee tot drie keer met verse mirror five. Breng de cardiale bundels elke keer over in 10 milliliters ijskoude mirror five.De herhaalde wasstappen dienen om de verwijdering van saponine A-T-P-A-D-P en eventuele resterende substraten uit de vezelbundels direct voorafgaand aan de respiratoire analyse te waarborgen. Bepaal het natte gewicht van de individuele vezelbundels door deze met een pincet op een absorberend oppervlak te blotten en de vezel vijf seconden lang, of totdat al het vocht is weggezogen, tegen het oppervlak aan te houden. Verwijder met een ander absorberend oppervlak het overtollige vocht van de pincet.Zet de weegschaal op nul en plaats het vezelbundeltje in een plastic weegbakje voor de massabepaling. Breng het hartvezelbundeltje over naar een nieuw putje met ijskoud near five. Het vezelbundeltje is nu klaar voor de bepaling van het zuurstofverbruik.De volgende validatietitraties worden uitgevoerd met een twee-kamer titratie-injectie XI-grafiek. Deze experimenten kunnen worden uitgevoerd als een individueel protocol of worden opgenomen in een titratieprotocol, afhankelijk van het experimentele en diagnostische doel van de respiratoire barometrie-studies. De hier gebruikte ERO GRA 2K kan de zuurstofconcentratie meten.Het apparaat is verbonden met een computer die is uitgerust met DAT lab-software, waardoor veranderingen in de zuurstofconcentratie gedurende het experiment kunnen worden gerapporteerd als real-time metingen van het zuurstofverbruik. Voordat de spiegelende hartvezels in de XI-transplantatiekamers worden geplaatst, worden 2,1 milliliters Mirror Five toegevoegd aan de behuizing van de kamers waarin de polariografische zuurstofsensoren of POS zich bevinden. Wanneer de kamers worden gesloten, bevindt zich 2 milliliters Mirror Five in de XI-transplantatiekamer.Geef voldoende tijd voor luchtzadiging en equilibratie van de mirror five bij 37 °C. Zodra de equilibratie is voltooid, worden de hartvezelmonsters in de mirror five geplaatst in de XI-transplantatiekamers, geroerd met polyodine-fluoride gecoate roerstaven.Verhoog de zuurstofconcentratie van de GRAT-kamers naar een waarde tussen 200 en 550 micromolair met een met zuurstof gevulde spuit. Laat de zuurstofconcentratie vijf tot 10 minuten stabiliseren met behulp van een Hamilton-spuit van 10 microliter. Voeg 10 microliter van twee molair glutamaat toe aan de kamer voor een eindconcentratie van 10 millimolair.Gebruik vervolgens een aparte Hamilton-spuit om vijf µL 800 mM malaat toe te voegen voor een eindconcentratie van twee mM in de kamer. Deze titratie wordt gebruikt om de basale door complex I ondersteunde respiratie te bepalen. De zuurstofflux zou binnen ongeveer vijf minuten na titratie moeten stabiliseren, waardoor de zuurstofconsumptie in state 2 kan worden bepaald, wat de zuurstofconsumptie is.Indien er na twee tot vijf minuten stabiel zuurstofverbruik geen DP optreedt, gebruik dan een Hamilton-microspuit van 25 µL om 20 µL van 500 mM A DP toe te voegen voor een uiteindelijke verzadigingsconcentratie van 5 mM. Deze concentratie wordt gebruikt om een verzadiging van meer dan 90% te bereiken, waardoor de maximale status kan worden bepaald. Drie. Mitochondriale respiratie via complex I laat een aanvullende twee tot vijf minuten stabiel zuurstofverbruik toe.Gebruik vervolgens een Hamilton-micropipet van 10 µL om 5 µL cytochrome C van 4 mM toe te voegen voor een eindconcentratie van 10 µM. De zuurstofconcentratie op dit punt wordt gebruikt om een kwaliteitscontroleanalyse van de integriteit van het buitenste mitochondriale membraan uit te voeren. Na nog eens twee tot vijf minuten stabiele zuurstofconsumptie wordt 1 µL ACIN van 4 mg/mL toegevoegd om een TP-synthase te remmen.Deze titratiestap wordt gebruikt om de intactheid van het binnenste mitochondriale membraan te valideren. Verwijder na de repi metric oxphos-beoordeling het monster voor bepaling van het drooggewicht of mitochondriale markers. Verwijder vervolgens mirror five uit de glazen kamers van de XI Grat.Was de kamers ten minste drie keer met gedestilleerd water. Was de kamers vervolgens nog ten minste drie keer met 100% ethanol om ethanol-oplosbare inhibitoren, zoals oligomycine, te verwijderen.Volg dit met twee extra wasbeurten met 70% ethanol. Voeg vervolgens 70% ethanol toe en laat de XI-transplantatiekamers hierin 30 minuten weken om ze te steriliseren. Was ten slotte de kamers met het POS minstens vijf keer met dubbel gedestilleerd water. Het zuurstofverbruik in correct geprepareerde spiegelende hartvezels wordt geëvalueerd volgens het getoonde kwaliteitscontroleprotocol; de respiratoire controlratio of RCR vertegenwoordigt de koppeling tussen het zuurstofverbruik en de oxidatieve fosforylering in perme-vezelpreparaten.De RCR is de ademhalingssnelheid in toestand drie ten opzichte van toestand twee, of alternatief toestand drie gedeeld door toestand vier; goed gekoppelde permeabiliteit die cardiac preparaten weerspiegelt, levert een RCR op tussen drie en zes. De titratie van cytochroom C wordt gebruikt als validatie van een correcte weefselpreparatie. Cytochroom C is een eiwit dat zich in de intermembraanruimte bij het binnenste mitochondriale membraan bevindt.Wanneer het buitenmembraan van mitochondriën intact is, blijft het endogene cytochroom C zich in de intermembrane ruimte bevinden en heeft de titratie van exogeen cytochroom C een verwaarloosbaar effect op de respiratie. Omgekeerd, als het buitenmembraan van mitochondriën beschadigd is, kan het endogene cytochroom C uit de intermembrane ruimte vrijkomen en zal het de respiratie remmen tot aan de toevoeging van exogeen cytochroom C, wat een beoordeling mogelijk maakt van de invloed van pathologische of experimentele stressoren op de intactheid van het mitochondriale buitenmembraan. De toevoeging van CIN wordt gebruikt om veranderingen in de lekrespiratie te beoordelen, wat de zuurstofconsumptie is die niet bijdraagt aan een DP. Fosforyleringscontroles of wild-type vezels zouden gevoelig moeten zijn voor de toevoeging van CIN en een significante afname van de zuurstofstroom moeten vertonen.Een lage RCR en een verminderde gevoeligheid voor oligomycine, resulterend in een relatief verhoogde zuurstofflux, wijst op schade aan het binnenste mitochondriale membraan tijdens de preparatie. Het uitblijven van een respons op titraties met substraatremmende ontkoppelaars, zoals hier te zien is, kan duiden op te lange incubatieperioden van sasin en geskinde vezelbundels in RP- en mirror five-oplossingen. In volgende pogingen moeten de perioden tussen het offeren van het dier en de metingen van het zuurstofverbruik worden geminimaliseerd.We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u hartvezelbundels kunt prepareren voor polaire grafische metingen. Het is belangrijk om te onthouden dat u bij het uitvoeren van deze procedure uiterst voorzichtig moet zijn tijdens de mechanische scheiding van de hartvezels. Dat is alles.Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

respirometric-oxidative-phosphorylation-assessment-saponin

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Methoden voor biopsie van vastus lateralis, de voorbereiding van gezuiverde mitochondria, en respirometrische profilering worden beschreven. Het gebruik van kleine spiermassa maakt deze techniek geschikt voor onderzoekstoepassingen.

Voorbereiding en Respirometrische Beoordeling van Mitochondriën geïsoleerd van spierweefsel Verkregen door percutane naaldbiopsie

De gepresenteerde methoden bieden stapsgewijze instructies voor het uitvoeren van een verzameling respirometrische assays op basis van microplates met behulp van geïsoleerde mitochondriën uit minimale hoeveelheden muisskeletspier. Deze assays kunnen mechanistische veranderingen/aanpassingen in het mitochondriale zuurstofverbruik meten in een veelgebruikt diermodel.

Met behulp Isolated Mitochondriën van geringe hoeveelheden van de muis skeletspieren voor High throughput Microplate Respiratory Metingen

Het volgende protocol beschrijft de voorbereiding en het gebruik van buffers voor de kwantitatieve meting van de snelheid van glucose en vetzuuroxidatie in het geïsoleerde werkende rattenhart. De methoden die worden gebruikt voor monsteranalyse en gegevensinterpretatie worden ook besproken.

Methoden voor de bepaling van de prijs van glucose en vetzuuroxidatie in het geïsoleerde hart Working Rat

Hoge-resolutie respirometrie wordt gebruikt om mitochondriale zuurstofconsumptie bepalen. Dit is een eenvoudige techniek om mitochondriale ademhalingsketen complexen (I-IV) ademhalingssnelheid, maximale mitochondriale elektronentransport systeemcapaciteit en buitenste mitochondriale membraan integriteit te bepalen.

High-resolution respirometrietest aan mitochondriale functie beoordelen in gepermeabiliseerde en intacte cellen

Dit protocol beschrijft calorespirometry, de directe en gelijktijdige meting van zowel warmteafvoer en ademhaling, waarmee een noninvasive aanpak om te beoordelen van de energie-stofwisseling. Deze techniek wordt gebruikt ter beoordeling van de bijdrage van zowel aerobe en anaerobe emissieroutes naar energie gebruik door toezicht op de totale cellulaire energiestroom.

Calorespirometry: Een krachtige, Noninvasive benadering onderzoeken van cellulaire energiemetabolisme

Het beoordelen van oxidatieve fosforylering met behulp van respirometers met hoge resolutie is een integraal onderdeel geworden van de functionele analyse van mitochondriën en cellulair energiemetabolisme. Hier presenteren we protocollen voor de analyse van cellulair energiemetabolisme met behulp van kamer- en microplaatgebaseerde respirometers met hoge resolutie en bespreken we de belangrijkste voordelen van elk apparaat.

Respirometrie met hoge resolutie om bio-energetica in cellen en weefsels te beoordelen met behulp van respirometers op basis van kamer en platen

Hier beschrijven we een gedetailleerde methode voor mitochondriale isolatie van de skeletspieren van muizen en de daaropvolgende analyse van ademhaling door oxygen consumption rate (OCR) met behulp van op microplaten gebaseerde respirometrische assays. Deze pijplijn kan worden toegepast om de effecten van meerdere omgevings- of genetische interventies op het mitochondriale metabolisme te bestuderen.

Isolatie van mitochondriën uit de skeletspieren van muizen voor respirometrische assays

Hoge resolutie respirometrie gekoppeld aan fluorescentiesensoren bepaalt mitochondriaal zuurstofverbruik en reactieve zuurstofsoorten (ROS) generatie. Het huidige protocol beschrijft een techniek om mitochondriale ademhalingssnelheden en ROS-productie in de gepermeabiliseerde heupzenuw te beoordelen.

Beoordeling van mitochondriale functie in heupzenuw door middel van hoge resolutie respirometrie

Paarden hebben een uitzonderlijke aërobe inspanningscapaciteit, waardoor paardenskeletspieren een belangrijk weefsel zijn voor zowel de studie van paardeninspanningsfysiologie als de mitochondriale fysiologie van zoogdieren. Dit artikel beschrijft technieken voor de uitgebreide beoordeling van de mitochondriale functie in de skeletspieren van paarden.

Hoge resolutie fluorrespirometrie van equine skeletspieren

De analyse van de mitochondriale functie van sperma door middel van respirometrie met hoge resolutie maakt het mogelijk om het zuurstofverbruik van vrij bewegende spermatozoa in een gesloten kamersysteem te meten. De techniek kan worden toegepast om de ademhaling in menselijke spermatozoa te meten, wat informatie geeft over de mitochondriale kenmerken en integriteit van sperma.

Respirometrie met hoge resolutie om de mitochondriale functie in menselijke spermatozoa te beoordelen

Hier beschrijven we een uitgebreide methode voor het meten van mitochondriale oxidatieve fosforylering in verse gepermeabiliseerde skeletspiervezels van menselijke of muizenspieren. Deze methode maakt de real-time kwantificering van de mitochondriale ademhaling en de beoordeling van brandstofvoorkeur en metabole flexibiliteit mogelijk, met behoud van bestaande mitochondriale netwerken en membraanintegriteit.

Meting van mitochondriale ademhaling in skeletspiervezels van mens en muis door middel van respirometrie met hoge resolutie

Leer hoe je saponine-gepermeabiliseerde hartvezels bereidt voor respirometrische OXPHOS-metingen. Deze methode maakt nauwkeurige beoordeling van mitochondriale functie in situ mogelijk.

Respirometrische oxidatieve fosforylering Assessment in Saponin-gepermeabiliseerde Cardiac Vezels

Meer video's verkennen