Hyperinsulinemische-Euglycemic Klem in de Conscious Rat

Het algemene doel van deze procedure is het evalueren van de insulinegevoeligheid bij de bewuste, onbeperkte rat. Dit wordt bereikt door eerst de linker arteria carotis te catheteriseren. Vervolgens wordt de rechter vena jugularis gecatheteriseerd om optimale resultaten te garanderen.

De katheters worden dagelijks gespoeld om de doorgankelijkheid te behouden gedurende een postoperatieve herstelperiode van vijf dagen. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen uit de hyperinsulinemische-euglycemische klem die de glucose-infusiesnelheden van het hele lichaam laten zien. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat directe metingen van de glucose-afvoersnelheden van het hele lichaam kunnen worden verkregen bij hoge fysiologische insulinespiegels.

Arteriële en veneuze katheters moeten voorafgaand aan de chirurgische procedure worden voorbereid. De katheter moet stompe uiteinden hebben, gevuld zijn met gehepariniseerde zoutoplossing en gesteriliseerd zijn met ethanol, waarbij een fixatieband stevig is bevestigd op respectievelijk 2,7 of 3,2 centimeter vanaf één uiteinde voor arteriële en veneuze katheters. Voor deze procedure worden volwassen mannelijke spray SD-ratten van ongeveer 300 gram gebruikt.

Noteer het startgewicht van het dier en gebruik dit gewicht om de gewichtstoename na de operatie te bewaken. Werk in een aseptische chirurgische omgeving. Anestheseer de rat met 3% isofluraan door deze in een anesthesiebox te plaatsen.

Verplaats het dier weg van het chirurgische gebied en bereid de incisieplaats voor door het haar rond de nek en de schouders te verwijderen. Zodra het haar is verwijderd, plaatst u het dier in een neusconus om de anesthesie in stand te houden met ongeveer 2% isofluorine. Zet het dier vast op de operatietafel.

Bevestig dat de rat volledig is geanestheseerd door te controleren op de aanwezigheid van voet- en/of oogreflexen. Reinig de incisieplaats met 70%ethanol, gevolgd door een Betadine-scrub en vervolgens opnieuw met 70%ethanol. De eerste stap van de procedure is het maken van een kleine verticale midline-incisie 10 millimeter superieur aan het sternum.

Gebruik gebogen micro-dissectiepincetten om het weefsel via botte dissectie te verwijderen en de linker m. sternomastoideus bloot te leggen. Verschuif deze spier om ongeveer één centimeter van de linker arteria carotis zichtbaar te maken. Plaats de micro-dissectiepincetten onder de arteria carotis om deze op zijn plaats te houden, terwijl het bindweefsel voorzichtig wordt weggepeld.

Het is belangrijk om de nervus vagus te isoleren van de slagader zonder de slagader of de zenuw te beschadigen. Gebruik steriele 4-0 zijde sutuur om het cefale uiteinde af te binden. Klem het vat af met gekartelde micro-dissectiepincetten.

Puncteer het geligeerde vat. Gebruik hiervoor een 21 gauge ven eject multisample luer-adapter. Verwijder de roestvrijstalen plug uit de katheter en gebruik een steriele katheterintroducer om deze in de slagader te geleiden.

Gebruik een pincet om te controleren of de katheter stevig vastzit. Laat het micro-dissectiepincet gedeeltelijk los, terwijl de slagader wordt afgeklemd, en schuif de katheter verder in tot aan het kraaltje. Op dit punt moet de punt van de katheter zich in de aortaboog bevinden.

Zet twee hechtingen onder de kraal en één erboven, en spoel de lijn door met 10 units per milliliter hepariniseerde zoutoplossing. Om te bevestigen dat de katheter bemonsteren kan, wordt het externe uiteinde van de katheter opnieuw afgesloten met een roestvrijstalen dop. Voer vervolgens een botte dissectie van het weefsel uit om de rechter vena jugularis externa bloot te leggen, isoleer de vene zorgvuldig en ligeer de vena cephalica.

Beëindig met zijden hechtdraad. Puncteer de ader met een naald van 21 gauge. Verwijder de adapter van de multisample-luer.

Verwijder de roestvrijstalen plug uit de katheter en gebruik een steriele katheterinbrenger om deze tot aan het kraaltje in te brengen. Zet twee hechtingen onder het kraaltje en één erboven. Spoel de lijn vervolgens met heparin-ijskoud saline (10 units per milliliter).

Om te bevestigen dat de katheter monsters zal nemen, wordt het externe uiteinde van de katheter opnieuw afgesloten met een plug van roestvrij staal met behulp van een stompe naald van 14 gauge, die onder de huid wordt getunneld, waarna een incisie in de rug tussen de schouderbladen wordt gemaakt. Rijg vervolgens de katheters door de naald zodat ze uit de rug van de rat komen. Er moeten ongeveer vier centimeter van elke katheter zichtbaar zijn.

Knip 0,5 centimeter Tigon S 50 HL medische slang af en plaats deze rond beide geëxterioriseerde katheters. Bevestig met blauwe tape voor de venen en rode tape voor de arteriën. Test de katheters opnieuw om de doorgankelijkheid te controleren, spoel ze vervolgens door en vul ze met hepariniseerde zoutoplossing (150 units per milliliter) om stolling te voorkomen.

Sluit alle incisies met 3-0 zijden hechtdraad. Plaats de rat in buikligging in een vooraf verwarmde schone kooi waarbij voedsel gemakkelijk toegankelijk is. Zodra de rat zijn volledige mobiliteit en alertheid heeft herwonnen, kan deze worden teruggeplaatst in de thuiskooi.

Laat de rat drie tot vijf dagen herstellen, waarbij dagelijks wordt gecontroleerd op infectie, pijn en veranderingen in het gewicht. Het is belangrijk dat de doorgankelijkheid van de katheter gedurende de gehele studie behouden blijft. Vul elke dag na de operatie spuiten met een slip tip van één milliliter met 150 units per milliliter hepariniseerde zoutoplossing en sluit deze af met een stompe naald van 22 gauge.

De stompe naald wordt ingebracht in 20 centimeter PE 50-slang met een roestvrijstalen slangkoppeling van 23 gauge aan het andere uiteinde. Zorg ervoor dat alle luchtbellen uit de lijn worden verwijderd. Klem de uit de rat naar buiten geleide arteriële lijn af met hemostaten, net onder de plug.

Verwijder de stalen catheterstop met een ander paar hemostaten. Plaats de slangkoppeling die aan de spuit is verbonden in de arteriële lijn en laat de hemostaten los die de geëxternaliseerde arteriële catheter afsluiten. Aspireer vervolgens het arteriële bloed uit de catheter in de spuit.

Als de katheter niet gemakkelijk opzuigt, kan het nodig zijn om zeer voorzichtig een kleine hoeveelheid oplossing via de katheter in te spuiten om de punt los te maken. De katheter wordt dan als vrij beschouwd. Zodra het bloed de spuit bereikt, wordt de P 50-slang vlakbij de spuit van 1 mL afgeklemd en wordt de spuit weggegooid.

Vervang deze door een nieuwe spuit gevuld met verse heparine-ijskoelsaline. Ontklem de slang en tik, terwijl u de nieuwe spuit rechtop houdt, tegen de spuit om luchtbellen naar boven en weg van de lijn te verplaatsen. Injecteer heparine-saline totdat de katheterlijn helder is en vrij van bloed.

Klem de arteriële lijn net onder de slangkoppeling af. Verwijder de spuitenconnector van de arteriële katheterlijn en vervang deze door de roestvrijstalen slangplug. Laat de hemostaten los die de geëxternaliseerde arteriële katheter occluderen.

Herhaal deze procedure voor de veneuze lijn. Vanwege de lage veneuze druk is afname mogelijk niet mogelijk. In het algemeen is het waarschijnlijk dat de katheter goed in de vene is geplaatst als de gehepariniseerde zoutoplossing met minimale weerstand kan worden geïnfundeerd.

Voordat de procedure wordt gestart, moeten de dieren worden gewogen, de oplossingen worden bereid en de klemapparatuur worden gemonteerd. Nadat het dier is gewogen en de doorgankelijkheid van de katheter is bevestigd, wordt het in een kleine bak met stro bedding geplaatst die de beweging beperkt maar niet volledig insnoert. De ratten die in deze studie worden gebruikt, hebben minimaal vijf uur gevast en voldoen aan de eisen voor postoperatieve gewichtstoename. Het gewicht van de rat bepaalt de benodigde hoeveelheid insuline in deze stap.

Vier millieenheden per kilogram per minuut wordt toegediend met een snelheid van twee µL per minuut. Bereid een 50% dextrose-oplossing en zorg ervoor dat er voldoende van beide oplossingen aanwezig zijn om ongeveer twee uur mee te kunnen; hiervoor worden spuiten van drie mL gebruikt. Nu bent u klaar om het klemmechanisme te assembleren.

Stel de lijnen en infusiepompen in zoals hier weergegeven. Plaats de glucose- en insulinespuiten op de spuitenpomp. Sluit de lijnen af en laat de rat 30 minuten rusten voordat het experiment wordt gestart.

Neem aan het begin van de procedure een nulmeting van de insuline en het hematocriet; hematocrietbepaling zorgt ervoor dat het bloedvolume gedurende het experiment constant blijft. Over het algemeen mogen de hematocrietwaarden niet meer dan 10% van de initiële waarde dalen. Neem een nulmeting van de glucose en bepaal het glucoseniveau dat geklampt moet worden.

Hier klemmen we op U-glycemie of 5 mM. Spoel na elk bloedmonster de arteriële lijn door met een klein volume hepatiniseerde zoutoplossing van 10 units/ml om stolling te voorkomen. Start de infusie van de insulineoplossing nadat het te klemmen glucoseniveau is vastgesteld.

Registreer de bloedglucosewaarden met intervallen van vijf tot 10 minuten en pas de glucosinfusiesnelheid naar behoefte aan totdat een stabiele toestand is bereikt. Dit is over het algemeen een proces van vallen en opstaan en kan variëren van 30 minuten tot meer dan twee uur. Het glucosenniveau dat nodig is om de glycemie te handhaven, is afhankelijk van het experimentele protocol.

Soorten en omstandigheden: om als geklempt te worden beschouwd, moeten drie opeenvolgende metingen binnen een gedefinieerd bereik vallen. Drie metingen die ongeveer één millimolair van elkaar verschillen, betekenen dat de glucosespiegels een stabiele toestand hebben bereikt. De glucosieinfusiesnelheid die nodig is om de glycemie gedurende een periode van 30 minuten te handhaven; tijdens deze tijd kunnen minimaal aanvullende bloedmonsters worden afgenomen.

Zodra de clamp-procedure is voltooid, dient een tweede monster van plasma, insuline en hematocriet te worden afgenomen. Dieren kunnen worden gebruikt voor verdere tests of worden geëuthanaseerd, waarbij weefsels worden verzameld voor verdere analyse. Afhankelijk van het dier kunnen de katheterlijnen vijf tot zeven dagen open blijven als de procedure correct is uitgevoerd.

Met de klemprocedure kan de insulinereactiviteit in steady state worden gemeten. Het is essentieel om de insuline- en glucosewaarden, evenals de glucose-infusiesnelheden en hematocrietwaarden, te registreren. De steady state is bereikt wanneer de glucosewaarden gedurende een periode van 30 minuten binnen één millimolar van elkaar blijven.

De glucosie-infusiesnelheid onthult de hoeveelheid exogeen glucose die nodig is om de glycemie te handhaven, waarbij de snelheid bij voorkeur over de tijd wordt uitgezet in plaats van als een enkel gemiddeld tijdstip. Zowel de nuchtere als de geklemde insulinewaarden moeten worden gerapporteerd. Deze metingen bevestigen dat de insuline succesvol is toegediend en maken eventuele verschillen in de insulinereactie tussen de behandelingsgroepen detecteerbaar. Het meten van de hematocrietwaarden bij de nulmeting en opnieuw na de procedure waarborgt dat de waarden gedurende het experiment niet met meer dan 5% ten opzichte van de nulmeting zijn gedaald na uitvoering van deze procedure.

Andere methoden, zoals het toedienen van isotopische tracers, kunnen worden gebruikt om de glucosebenutting in het gehele lichaam en in specifieke weefsels te evalueren.