Name: Microtiter Dish biofilm vorming Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-30T18:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 57 s
Description: Leer hoe je biofilmen vormt en kwantificeert in een microtiterplaat met kristalvioletkleuring. Deze methode maakt snelle analyse van bacteriële en fungale biofilmvorming mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Mijn dank aan Sherry Koetsjma, Pete Newell en Robert Shanks voor het leveren van de beelden in figuur 1. Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie ​​R01AI083256 naar GAO

1. Telen van een biofilm <ol><li> Grow een cultuur van het wild-type Pseudomonas aeruginosa of mutant stam 's nachts in een rijk medium (dat wil zeggen LB) </li><li> Verdun het 's nachts cultuur 1:100 in de frisse medium voor biofilm assays. Een standaard biofilm voedingsbodem voor P. aeruginosa is M63 minimaal medium aangevuld met magnesium-sulfaat, glucose en casamino zuren (zie tabel). Als alternatief biofilm-bevorderende medium dat minder plankton groei en een meer robuuste biofilm, de glucose en casamino zuren stimuleert kan worden vervangen door arginine als enige koolstof-en energiebron. </li><li> Voeg 100 ul van de verwatering per putje in een 96 goed gerecht. Voor kwantitatieve assays, wij gebruiken meestal 4-8 repliceren putten voor elke behandeling. </li><li> Incubeer de microtiterplaat voor 4-24 uur bij 37 ° C. </li></ol> 2. Kleuren van de biofilm <ol><li> Na incubatie, dump die cellen door het draaien van de plaat over en schudden uit de vloeistof. </li><li> Voorzichtig onderdompelen de plaat in een klein bad van water (dat wil zeggen, gebruik maken van de bodems van pipetpunt dozen voor P1000 pipetmen als het bad). Schud uit water. Herhaal dit proces een tweede keer. Deze stap helpt bij het verwijderen losse cellen en media componenten die kunnen worden gekleurd in de volgende stap, en aanzienlijk verlaagt achtergrondkleuring. </li><li> Voeg 125 ul van een 0,1% oplossing van kristalviolet in het water aan elk putje van de microtiterplaat. Draag handschoenen en een laboratoriumjas tijdens het maken van de oplossing. Wees voorzichtig bij het afwegen van de CV als het poeder is hygroscopisch en gemakkelijk vlekken kleding, huid, enz. </li><li> Incubeer de microtiterplaat bij kamertemperatuur gedurende 10-15 minuten. </li><li> Spoel de plaat 3-4 keer met water door onderdompeling in een bad van water, zoals hierboven beschreven, schud uit en dep krachtig op een stapel papieren zakdoekjes om de plaat van alle overtollige cellen en kleurstof te ontdoen. </li><li> Draai de microtiterplaat ondersteboven en droog voor een paar uur of 's nachts. </li><li> Voor de kwalitatieve bepalingen, kan de putten worden gefotografeerd bij het droog. </li></ol> 3. Kwantificering van de biofilm <ol><li> Voeg 125 ul van 30% azijnzuur in water aan elk putje van de microtiterplaat om het CV te lossen. </li><li> Incubeer de microtiterplaat bij kamertemperatuur gedurende 10-15 minuten. </li><li> Overdracht 125 pi van het opgeloste CV naar een nieuwe flat bodem microtiterplaten schotel. </li><li> Kwantificeren absorptie in een plaat reader bij 550 nm met behulp van 30% azijnzuur in water als de blanco. </li></ol> 4. Representatieve resultaten: <img src="/files/ftp_upload/2437/2437fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Toont een representatief resultaat voor biofilmvorming testen uitgevoerd voor Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens en Staphylococcus aureus. (A) Een zijaanzicht van de put met een biofilm van P. aeruginosa (8 uur, 37 ° C). (B) Een zijaanzicht van de put met een biofilm van P. fluorescens (6 uur, 30 ° C). (C) Een top-down view van de biofilm gevormd door S. aureus in een vlakke bodem microtiterplaat (twee putten, 24 uur, 37 ° C). P. aeruginosa en P. fluorescens zijn zowel beweeglijk organismen en vormen een biofilm op de lucht-water grensvlak. S. aureus is niet-beweeglijke en vormt een biofilm op de bodem van de put.

<ol><li>O'Toole, G. A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+biofilm+formation+in+Pseudomonas+fluorescens+WCS365+proceeds+via+multiple%2C+convergent+signalling+pathways%3A+a+genetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis.</a> Mol. Microbiol. 28, 449-461 (1998).</li>
<li>O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aO%27Toole%2C+GA+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. Doyle, R. J. , Academic Press. San Diego, CA. 91-109 (1999).</li>
<li>Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+basis+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance.</a> Nature. 426, 306-310 (2003).</li>
<li>Kuchma, S. L., Connolly, J. P., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-component+regulatory+system+regulates+biofilm+maturation+and+type+III+secretion+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">A three-component regulatory system regulates biofilm maturation and type III secretion in Pseudomonas aeruginosa.</a> J Bacteriol. 187, 1441-1454 (2005).</li>
<li>Caiazza, N. C., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SadB+is+required+for+the+transition+from+reversible+to+irreversible+attachment+during+biofilm+formation+by+Pseudomonas+aeruginosa+PA14%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">SadB is required for the transition from reversible to irreversible attachment during biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa PA14.</a> J Bacteriol. 186, 4476-4485 (2004).</li>
<li>Shanks, R. M., Sargent, J. L., Martinez, R. M., Graber, M. L., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catheter+lock+solutions+influence+staphylococcal+biofilm+formation+on+abiotic+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrol+Dial+Transplant%22%5BJournal%5D)">Catheter lock solutions influence staphylococcal biofilm formation on abiotic surfaces.</a> Nephrol Dial Transplant. 21, 2247-2255 (2006).</li>
<li>Caiazza, N. C., Merritt, J. H., Brothers, K. M., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverse+regulation+of+biofilm+formation+and+swarming+motility+by+Pseudomonas+aeruginosa+PA14%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Inverse regulation of biofilm formation and swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14.</a> J. Bacteriol. 189, 3603-3612 (2007).</li>
<li>Hinsa, S. M., Espinosa-Urgel, M., Ramos, J. L., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+from+reversible+to+irreversible+attachment+during+biofilm+formation+by+Pseudomonas+fluorescens+WCS365+requires+an+ABC+transporter+and+a+large+secreted+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Transition from reversible to irreversible attachment during biofilm formation by Pseudomonas fluorescens WCS365 requires an ABC transporter and a large secreted protein.</a> Mol Microbiol. 49, 905-918 (2003).</li>
<li>Mack, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+transposon+mutants+of+biofilm-producing+Staphylococcus+epidermidis+impaired+in+the+accumulative+phase+of+biofilm+production%3A+genetic+identification+of+a+hexosamine-containing+polysaccharide+intracellular+adhesin%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Characterization of transposon mutants of biofilm-producing Staphylococcus epidermidis impaired in the accumulative phase of biofilm production: genetic identification of a hexosamine-containing polysaccharide intracellular adhesin.</a> Infect. Immun. 62, 3244-3253 (1994).</li>
<li>Vidal, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+an+Escherichia+coli+K-12+mutant+strain+able+to+form+biofilms+on+inert+surfaces%3A+involvement+of+a+new+ompR+allele+that+increases+curli+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression.</a> J. Bacteriol. 180, 2442-2449 (1998).</li>
<li>Junker, L. M., Clardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screens+for+small-molecule+inhibitors+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">High-throughput screens for small-molecule inhibitors of Pseudomonas aeruginosa biofilm development.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51, 3582-3590 (2007).</li>
</ol>

Deze methode kan worden aangepast voor gebruik met een breed scala van micro-organismen. Beweeglijk microben meestal aan de wanden en / of onderkant van de putten, terwijl niet-beweeglijke microben meestal zich te houden aan de bodem van de putten. De optimale omstandigheden voor biofilmvorming (dat wil zeggen, de groei medium, temperatuur, tijd van incubatie) dient empirisch te worden bepaald voor elke microbe. Ik raad het uitvoeren van meerdere herhalingen voor elke stam of conditie (4-8), met inbegrip van een positie...

<table><tbody><tr><td>1 X M63</td><td></td><td></td><td>Bereid een 5X M63-stamoplossing door 15 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 35 g K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; en 10 g (NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; in 1 L water. Deze voorraadoplossing d&amp;#8211;hoeft niet geautoclaveerd te worden en kan bij kamertemperatuur worden bewaard. Verdun de 5X-stockoplossing 1:5, autoclaveer, laat afkoelen en voeg vervolgens de gewenste componenten toe.</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P288-500</td><td></td></tr><tr><td>(NH₄)₂SO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;Het is niet mogelijk om een vertaling te maken omdat er geen brontekst is verstrekt. Voeg s.v.p. de Engelse tekst toe die u vertaald wilt hebben.&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5132</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfaat</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td>Voeg toe tot een eindconcentratie van 1 mM. Bereid als een 1 M voorraadoplossing in water en autoclaveer.</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-3</td><td>Voeg toe tot een eindconcentratie van 0,2%. Bereid dit voor als een 20% voorraadoplossing in water en autoclaveer deze.</td></tr><tr><td>Casaminozuren</td><td>BD Biosciences</td><td>223050</td><td>Toevoegen tot een eindconcentratie van 0,5%. Bereid dit als een voorraadoplossing van 20% in water en autoclafeer.</td></tr><tr><td>Arginine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5131</td><td>Toevoegen tot een eindconcentratie van 0,4%. Bereiden als een 20% voorraadoplossing in water en filtersteriliseren. Deze alternatieve koolstof-/energiebron kan glucose en casaminozuren vervangen.</td></tr><tr><td>Microtiterplaten</td><td>BD Biosciences</td><td>353911</td><td>Falcon 3911, Microtest III, Flexibele assayplaten, 96 wells, U-bodem, niet-steriel, niet behandeld voor weefselkweek.</td></tr><tr><td>Microtiterplaatdeksels</td><td>BD Biosciences</td><td>353913</td><td>De deksels kunnen worden hergebruikt door ze te reinigen met 95% ethanol in water.</td></tr><tr><td>Kristalviolet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>229641000</td><td>Bereid dit voor als een 0,1% oplossing in water.</td></tr></tbody></table>

microtiter dish biofilm vorming assay

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Biofilms zijn gemeenschappen van microben aan oppervlakken, die kan worden gevonden in de medische, industriële en natuurlijke omgeving. In feite is het leven in een biofilm is waarschijnlijk de overhand modus van de groei van microben in de meeste omgevingen. Ouder biofilms hebben een paar duidelijke kenmerken. Biofilm microben worden meestal omgeven door een extracellulaire matrix die structuur en bescherming aan de gemeenschap biedt. Microben groeien in een biofilm hebben ook een karakteristieke architectuur in het algemeen bestaat uit macrocolonies (met duizenden cellen), omringd door met vloeistof gevulde kanalen. Biofilm-grown microben zijn ook berucht om hun verzet tegen een reeks van antimicrobiële middelen met inbegrip van klinisch relevante antibiotica. De microtiterplaat schotel test is een belangrijk instrument voor de studie van de vroege stadia van biofilmvorming, en is vooral toegepast voor de studie van bacteriële biofilms, hoewel deze test is ook gebruikt om schimmelinfecties te biofilmvorming te bestuderen. Omdat deze test gebruik maakt van statische, batch-groei-omstandigheden, is het niet mogelijk voor de vorming van de volwassen biofilms doorgaans geassocieerd met flow cell-systemen. Echter, de test is effectief bij het identificeren van vele factoren die nodig zijn voor aanvang van de biofilmvorming (dat wil zeggen, flagellen, pili, adhesinen, enzymen die betrokken zijn bij cyclisch-di-GMP binding en metabolisme) en ook genen die betrokken zijn bij extracellulaire polysaccharide productie. Bovendien, gepubliceerd werk geeft aan dat biofilms gekweekt in microtiterplaten gerechten sommige eigenschappen van volwassen biofilms te ontwikkelen, bijvoorbeeld een antibiotica tolerantie en de weerstand tegen het immuunsysteem effectoren. Deze eenvoudige microtiterplaat gerecht test maakt de vorming van een biofilm op de muur en / of onderkant van een microtiter schotel. De hoge doorvoer aard van de test maakt het nuttig voor genetische screens, evenals het testen van biofilmvorming door meerdere stammen onder verschillende groeiomstandigheden. Varianten van deze test zijn gebruikt om vroegtijdig biofilm vorming te evalueren voor een breed scala van microben, met inbegrip van maar niet beperkt tot, Pseudomonaden, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterokokken, mycobacteriën en schimmels. In het protocol beschreven, zullen we ons richten op het gebruik van deze test voor het biofilmvorming studie van het modelorganisme Pseudomonas aeruginosa. In deze test, is de mate van biofilmvorming gemeten met behulp van de kleurstof kristalviolet (CV). Er zijn echter een aantal andere colorimetrische en metabole vlekken gemeld voor de kwantificering van biofilmvorming het gebruik van de microtiterplaat test. Het gemak, lage kosten en flexibiliteit van de microtiterplaat test heeft het een instrument van cruciaal belang voor de studie van biofilms.

De test beschrijft een snelle wijze te vroeg biofilmvorming in bacteriën en schimmels te meten. Deze methode maakt gebruik van een microtiterplaat als substraat voor microbiële biofilm en de vorming van biofilm wordt gevisualiseerd met behulp van kristalviolet stam. De test geeft zowel een kwalitatieve of kwantitatieve test voor de vroege biofilmvorming.

Microtiter Dish biofilm vorming Assay

Biofilms zijn gemeenschappen van microben die aan oppervlakken gehecht zijn en die voorkomen in medische, industriële en natuurlijke omgevingen. In feite is het leven in een biofilm ...

Het algemene doel van deze procedure is het tot stand brengen en bestuderen van biofilms in een microtiterplaat. Dit wordt bereikt door eerst een bacteriële cultuur aan een 96-wellsplaat toe te voegen. Vervolgens wordt de cultuur geïncubeerd bij de juiste temperatuur en gedurende de juiste tijd, afhankelijk van de microbe, om de biofilm te kleuren.Kristalviolet wordt aan elke put met bacteriën toegevoegd, waarna de bacteriën worden gewassen. Ten slotte worden de putten gefotografeerd en worden de bacteriën gekwantificeerd. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de accumulatie en vorming van biofilms in de loop van de tijd aantonen via de meting van kristalviolet.Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat onderzoekers biofilmvorming in bacteriële en schimmelorganismen snel kunnen beoordelen. De methode kan ook worden geconfigureerd voor genetische high-throughput screenings, of om nieuwe therapeutische verbindingen te identificeren die biofilmvorming remmen. Bereid een overnight-cultuur van vijf milliliter voor van het wildtype Pseudomonas, aerogen, of de mutantstam.Verdun 10 µL cultuur in LB-medium in één milliliter vers M 63-minimaal medium, aangevuld met magn

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Beschrijven we een eenvoudige, snelle en robuuste methode voor de vorming...

Een 96 Goed microtiterplaat-gebaseerde methode voor de controle Formation en schimmelwerende gevoeligheid testen van Candida albicans Biofilms

This video demonstrates an assay for screening antimicrobial compounds that efficiently eliminate biofilms using a peg-plate. The methodology monitors the biofilm's metabolic state after treatment with antimicrobial compounds, facilitating the determination of the minimum biofilm eradication concentration.

A Peg Plate Biofilm Assay for Screening Antibacterial Agents

The video demonstrates a solid-phase adherence assay for assessing biofilm formation. In a multi-well plate, bacteria in bile salt-supplemented media adhere to solid surfaces, forming biofilms, which is confirmed by colorimetry through crystal violet staining and ethanol treatment.

A Solid Phase Adherence Assay to Assess Biofilm Formation

The video showcases a biofilm dispersion assay using a multi-well plate. Buffer and glucose treatment disassemble the biofilm, releasing bacteria, while bile salts induce stress, retaining bacteria in the protective extracellular polymeric substance. Higher dispersion with buffer and glucose confirms successful biofilm disassembly, estimated by colony forming units measurement.

Detection of Biofilm Disassembly Through a Dispersion Assay

De meeste bacteriële infecties produceren een biofilm. Vanwege hun omgeving zijn biofilm-geassocieerde bacteriën vaak fenotypisch resistent tegen geneesmiddelen. Nieuwe antibacteriële moleculen die bacteriën in biofilms doden, hebben dus een hoge prioriteit. We stellen een test op om snel te screenen op antimicrobiële verbindingen die effectief zijn bij het uitroeien van biofilms.

Gericht op biofilm geassocieerde<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Met behulp van Resazurin Gebaseerd Drug-gevoeligheid Assay

Deze studie presenteert de ontwikkeling van reproduceerbare methodologieën om biofilmremmers en hun effecten op Bacillus subtilis multicellulariteit te bestuderen.

Methodologieën voor het bestuderen<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biofilms als een model voor het karakteriseren van Small Molecule biofilminhibitoren

Biofilm-infecties vertonen een hoge tolerantie voor chemotherapie. Geen enkele test legt de complexiteit van biofilms vast. In plaats daarvan zijn aanvullende tests nodig. We presenteren een screeningsplatform (ontwikkeld voor S. aureus) dat assays voor levensvatbaarheid, biomassa en biofilmmatrix combineert. Het maakt ontdekking van anti-biofilm medicijnen mogelijk, inclusief de beoordeling van langdurige chemotherapeutische effecten.

Een platform van de Anti-biofilm Testen geschikt voor de exploratie van natuurlijke verbinding Bibliotheken

Dit protocol laat de lezer om te analyseren bile salt-geïnduceerde biofilm vorming in de darmen ziekteverwekkers met behulp van een veelzijdige aanpak om vast te leggen van het dynamische karakter van het bacteriële biofilms door beoordeling van de naleving, extracellulaire stof van polymere matrix vorming, en dispersie.

Bile Salt-geïnduceerde Biofilm vorming in de darmen pathogenen: technieken voor de identificatie en kwantificering

Dit protocol presenteert methodologie om biofilmgroei- en biomassametingen uit te voeren met behulp van zelfgeassembleerde pcr-plaatapparaten met diepe put voor statische biofilmscreening met hoge doorvoer en 96-well gekoppelde deksels.

Generatie van grotere bacteriële biofilmbiomassa met behulp van PCR-Plate Deep Well Microplate-apparaten

Een 96-well microtiter plaat-gebaseerd protocol met behulp van een 2,3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfofenyl)-5-carboxanilide-2H-tetrazolium (XTT) reductietest wordt hierin beschreven, om de effecten van antilichamen op biofilms gevormd door C. tropicalis te bestuderen. Dit in vitro protocol kan worden gebruikt om het effect van potentiële nieuwe antischimmelverbindingen op de metabole activiteit van Candida-soortencellen in biofilms te controleren.

Een oplosbare tetrazolium-gebaseerde reductietest om het effect van antilichamen op Candida tropicalis biofilms te evalueren

Leer hoe je biofilmen vormt en kwantificeert in een microtiterplaat met kristalvioletkleuring. Deze methode maakt snelle analyse van bacteriële en fungale biofilmvorming mogelijk.

Microtiter Dish biofilm vorming Assay

Meer video's verkennen