Microtiter Dish biofilm vorming Assay
30 januari 2011
De test beschrijft een snelle wijze te vroeg biofilmvorming in bacteriën en schimmels te meten. Deze methode maakt gebruik van een microtiterplaat als substraat voor microbiële biofilm en de vorming van biofilm wordt gevisualiseerd met behulp van kristalviolet stam. De test geeft zowel een kwalitatieve of kwantitatieve test voor de vroege biofilmvorming.
Het algemene doel van deze procedure is het tot stand brengen en bestuderen van biofilms in een microtiterplaat. Dit wordt bereikt door eerst een bacteriële cultuur aan een 96-wellsplaat toe te voegen. Vervolgens wordt de cultuur geïncubeerd bij de juiste temperatuur en gedurende de juiste tijd, afhankelijk van de microbe, om de biofilm te kleuren.
Kristalviolet wordt aan elke put met bacteriën toegevoegd, waarna de bacteriën worden gewassen. Ten slotte worden de putten gefotografeerd en worden de bacteriën gekwantificeerd. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de accumulatie en vorming van biofilms in de loop van de tijd aantonen via de meting van kristalviolet.
Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat onderzoekers biofilmvorming in bacteriële en schimmelorganismen snel kunnen beoordelen. De methode kan ook worden geconfigureerd voor genetische high-throughput screenings, of om nieuwe therapeutische verbindingen te identificeren die biofilmvorming remmen. Bereid een overnight-cultuur van vijf milliliter voor van het wildtype Pseudomonas, aerogen, of de mutantstam.
Verdun 10 µL cultuur in LB-medium in één milliliter vers M 63-minimaal medium, aangevuld met magnesium, sulfaat, glucose en cassino-zuren. Breng vervolgens met een pipet 100 µL van de verdunde cultuur over naar afzonderlijke putjes van een 96-wells plaat met ronde bodem. Incubeer de plaat bij 37 °C gedurende vier tot 24 uur om biofilmgroei mogelijk te maken.
Zodra de biofilms zijn gevormd, haal je de plaat uit de incubator en gooi je de supernatants van de cultuur weg door de plaat om te keren en de vloeistof eruit te schudden. Dompel de plaat vervolgens voorzichtig onder in een klein bakje water om eventuele resterende ongebonden cellen of mediumcomponenten af te wassen die achtergrondkleuring kunnen veroorzaken. Schud het water eruit, dep de plaat droog en herhaal de wasbeurt.
Zodra de plaat schoon is, voegt u 125 µL per well toe van een 0,1% kristalviolet-oplossing. Om de cellen te kleuren, wordt de plaat 10 tot 15 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd.
Was de plaat vervolgens drie of vier keer zoals eerder gedemonstreerd. Dep de plaat na de laatste wasbeurt krachtig droog op een stapel papieren handdoeken om overtollig vocht te verwijderen, plaats de plaat ondersteboven en laat deze enkele uren zo drogen. Zodra de plaat droog is, kunnen de wells met een digitale camera worden gefotografeerd om de kwaliteit van de biofilms te beoordelen.
Zoals hier wordt getoond, hebben beweeglijke bacteriën zoals Pseudomonas aerogenes links en Pseudomonas fluorescens rechts de neiging om biofilms te vormen op de locatie van de lucht-vloeistofgrensvlak tijdens de groei van de biofilm. In contrast hiermee vormen Staphylococcus aureus bacteriën, die niet beweeglijk zijn, biofilms op de bodem van de wells. Om de biofilms te kwantificeren, voegt u eerst 125 µL 30% azijnzuur toe aan elke well, inclusief een blanco well die alleen azijnzuur bevat, en incubeert u de plaat bij kamertemperatuur gedurende 10 tot 15 minuten om het kristalviolet dat door de biofilms is vastgehouden te laten oplossen.
Beweeg vervolgens de 125 µL gesolubiliseerde kleurstof van elke put naar een nieuwe vlakbodige 96-wells microtiterplaat. Bepaal met een platenlezer de absorbantie van elke put bij een golflengte van 550 nm. De concentratie kristalviolet in elke put is proportioneel aan het aantal cellen in de biofilm.
Deze grafiek toont een kwantificering van de biofilmvorming en -accumulatie door Pseudomonas fluorescence in de loop van de tijd tijdens incubatie bij 37 °C. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in het uitvoeren van een biofilm-assay in een 96-wells plaat, gebruikt in combinatie met andere methoden zoals microscopie. Dit kan aanzienlijk bijdragen aan ons begrip van biofilmvorming.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze assay beschrijft een snelle methode voor het meten van vroege biofilmvorming bij bacteriën en schimmels met behulp van een microtiterplaat. De biofilm wordt gevisualiseerd met kristalvioletkleuring, waardoor zowel kwalitatieve als kwantitatieve analyse mogelijk is.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Microbiologie
- Biofilmonderzoek
- Assayontwikkeling
Achtergrond
- Biofilms zijn gemeenschappen van micro-organismen die aan oppervlakken hechten.
- Het bestuderen van biofilmvorming is cruciaal voor het begrijpen van het microbiële gedrag.
- Kristalviolet is een veelgebruikte kleurstof om biofilms te visualiseren.
- Deze methode maakt een snelle beoordeling van de biofilmontwikkeling mogelijk.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare assay te ontwikkelen voor vroege biofilmvorming.
- Om de accumulatie van biofilm in de tijd te kwantificeren.
- Om de studie van microbiële interacties in biofilms te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Voeg de bacteriële cultuur toe aan een 96-well microtiterplaat.
- Incubeer de cultuur gedurende de juiste tijd bij de passende temperatuur.
- Voeg kristalviolet toe om de biofilm te kleuren.
- Was de wells en maak foto's om de biofilmvorming te kwantificeren.
Belangrijkste resultaten
- De resultaten tonen de accumulatie van biofilms over tijd.
- Kwantitatieve gegevens kunnen worden verkregen uit kristalviolet-metingen.
- De assay biedt een duidelijke visualisatie van de biofilmvorming.
Conclusies
- Deze methode is effectief voor het bestuderen van vroege biofilmvorming.
- Het kan worden toegepast op diverse bacteriële en schimmelsoorten.
- De assay vergroot het inzicht in de dynamiek van microbiële biofilms.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
De microtiterplaat-assay voor biofilmvorming maakt een snelle high-throughput beoordeling van vroege biofilmontwikkeling mogelijk, wat bijdraagt aan targetvalidatie bij de ontdekking van antimicrobiële middelen. Door biofilmafzetting te kwantificeren via kristalvioletkleuring, levert deze methode reproduceerbare, kwantitatieve gegevens die helpen bij het verminderen van risico's voor therapeutische kandidaten die gericht zijn op microbiële adhesie en persistentie. Deze schaalbare aanpak is toepasbaar op zowel bacteriële als schimmelstelsels, wat vroege screening van biofilm-modulerende verbindingen vergemakkelijkt.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door genen en factoren te identificeren die nodig zijn voor de initiatie van biofilms, zoals adhesinen, pili en cyclisch-di-GMP-routes.
- Operationele waarde: Maakt functionele targetvalidatie mogelijk via loss-of-function screens in microbiële stammen onder gestandaardiseerde condities.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door verbindingen die de vroege biofilmvorming remmen te onderscheiden van verbindingen zonder effect.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde microbiële systemen voor op downstream compound-screening door het vaststellen van reproduceerbare metrieken voor biofilmvorming.
- Operationele waarde: Pakt assay-standaardisatie aan via gestandaardiseerde incubatie-, kleurings- en kwantificatiestappen met gebruik van een 96-wells plaatformaat.
- Schaalbaarheid: Benadrukt de gereedheid voor screening en het hergebruik van het platform voor genetische screens en compound-bibliotheken over meerdere microbiële stammen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele relevantie: Verbindt gegevens over vroege biofilmvorming met fenotypische resistentieprofielen, wat bijdraagt aan de mechanistische risicoreductie van antimicrobiële leadverbindingen.
- Preklinische continuïteit: Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk door in vitro biofilmremming te koppelen aan tolerantie tegen antibiotica en immuuneffectoren.
- Afstemming van biomarkers: Ondersteunt de ontwikkeling van translationele biomarkers via kwantificeerbare output die correleert met biofilm-geassocieerde tolerantiefenotypen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De assay past binnen het continuüm van ontdekking, van targetidentificatie tot lead-optimalisatie, in het bijzonder voor anti-infectieuze programma's die gericht zijn op biofilm-gemedieerde resistentie.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing van microbiële adhesie en biofilmvormingsroutes via genetische en chemische perturbatie.
- Screening: Beschrijft de gereedheid van de assay via gestandaardiseerde biofilmvorming en kristalviolet-kwantificering, wat een betrouwbare evaluatie van verbindingen mogelijk maakt.
- Analytica: Benadrukt kwantitatieve absorbentiemetingen bij 550 nm die vergelijking van de biofilmbiomassa tussen verschillende condities en stammen mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt vroege gegevens over biofilmremming met preklinische relevantie door tolerantiemechanismen te modelleren die worden waargenomen bij chronische infecties.
- Herbruikbaarheid binnen ondernemingen: Positioneert de methode als een herbruikbaar screeningplatform voor antimicrobiële, antifungale en antibiofilmprogramma's over meerdere pathogeenmodellen.
Operationele & Enterprise Impact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen in doelwitvalidatie door een meetbare reductie in biofilmvorming na genetische of farmacologische interventie.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid in 96-wells formaten voor high-throughput toepassingen.
- Strategische waarde: Betere go/no-go beslissingen bij de identificatie van lead-verbindingen door het verminderen van fout-positieven via orthogonale biofilmkwantificering.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen op basis van dosisafhankelijke remming van vroege biofilmvorming.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist microbiologische expertise in steriele technieken, cultuurpreparatie en de omgang met biofilms.
- Afhankelijk van toegang tot platlezers die in staat zijn tot absorptiemetingen bij 550 nm en standaard 96-well microtiterplaten.
- Necessiteert standaardisatie tussen teams van incubatietijden, wasstappen en kleuringsprotocollen om inter-well variabiliteit te minimaliseren.
- Omvat overwegingen voor adaptatie bij uitbreiding naar niet-modelorganismen of schimmels met verschillende adhesie-eigenschappen.
- Bevat praktische beperkingen, zoals het onvermogen om rijpe biofilmarchitectuur of flow-afhankelijke fenotypes te modelleren, zoals vermeld in de bron.
