Methoden voor Patch Clamp capaciteit Recordings uit de Calyx

Hi, mijn naam is Ken Paradiso. Ik werk voor Ling Gang Wu bij het National Institute of Neurological Disorders and Stroke Intramural programma, dat zich bevindt op het NIH in de Bethesda campus. Ik ga je de technieken laten zien voor het caly hebben gehouden presynaptisch opname Patch clamping.

Om de hersenweefsels voor te bereiden, verwijderen we de hersenen van de rat. We plaatsen de hersenen in deze oplossing, die ijskoud zou zijn, lage calciumoplossing, en het zou moeten borrelen met carbogen om ervoor te zorgen dat er te allen tijde een zuurstoftoevoer naar de hersenen is. Het moet ook ijskoud zijn om de DA te minimaliseren om de hoeveelheid schade te minimaliseren.

Dus de hersenen zouden nu in deze oplossing zijn. We zouden het eruit halen, het op de juiste manier snijden zodat het op de blok kan worden geplaatst, gemonteerd op de blok met Sano correlate of crazy glue, maar vul de kamer dan met ijskoud, lage calciumoplossing, laat het borrelen, plaats het op de vibrator en snijd vervolgens plakjes van 180 tot 190 microns dikte met een frequentie van 70 hertz en een voorwaartse snelheid van 0,01 tot 0,02 millimeter per seconde. Dus dat zou 10 tot 20 microns per seconde zijn.

Zodra elke plak is gemaakt, brengen we de plakjes van het ijskoude zoutoplossing over naar deze kamer, die normale calciumoplossing bevat. Dit is dezelfde oplossing waarin we opnemen en deze staat op 37 graden fysiologische temperatuur. We plaatsen de plakjes vervolgens hier voor herstel.

Het blijft hier een half uur tot een uur voordat de fysiologieexperimenten worden uitgevoerd. Dus hier heb ik de hersenen en ik ga het uit de oplossing trekken. Dus dit is een grotere hersenen voor demonstratiedoeleinden.

Dit is van een P 20 rat. We zullen het omdraaien. Het is de hersenstam die we interesseren.

Deze gebied hieronder en de calyx hebben gehouden is precies in dat gebied daar. Dus wat we gaan doen is de rest van de hersenen afsnijden, de hersenstam isoleren en vervolgens de hersenstam voorbereiden voor de snijdkamer. Oké, dus we gaan de rest van de hersenen afsnijden, we isoleren de hersenstam.

Ik ga het omdraaien om te demonstreren waar we zijn. Normaal zouden we het niet zo doen, en we kunnen gewoon dat hele gedeelte eruit gooien. We draaien het weer om, we hebben de hersenstam geïsoleerd en we gaan daar nog een snede maken.

Oké, dat is het. Dat is de hersenstam. Calyx van gehouden is daar precies daar en daar.

Dit is de hersenstam. We zullen het weer een beetje terugduwen. We gaan een kant van de kleine hersenen afsnijden en dat zorgt ervoor dat de hersenstam zijwaarts kan zitten zoals dit.

We doen er een beetje Sano acryllijm in en houden het snel zijwaarts gelegd en vullen het op met koud ijs, koude lage calciumoplossing. Krijg de zuurstoflijn zo snel mogelijk erin. We pakken het nu op en brengen het naar de vibrato.

We brengen het snel in om bij het begin van de hersenen te komen, en zodra we bij het begin van de hersenen zijn, verlagen we de snelheid naar 0,01 millimeter per seconde. Dus het is 10 micro's per seconde. Dus het beweegt met een ongelooflijk langzame snelheid.

Het eerste deel van de hersenen is het deel dat de mtb heeft, wat de mediale Niles van het trapeziumlichaam is. En dat is het deel dat bevat de, oké, dus als ik het in de overdrachtspijp heb, probeer ik het zo dicht mogelijk bij de punt van de pijp te brengen. En daar is de plak van de hersenen en ik breng hem snel over in deze kamer, die een standaardopnameoplossing bevat die normale calciumniveaus en ook een hogere temperatuur heeft.

En dat zal de plakjes toelaten om te herstellen na de snijdprocedures zodat ze klaar zijn voor fysiologieexperimenten. Oké, vanaf hier is het hetzelfde ding keer op keer. De volgende apparatuur die ik ga gebruiken om het patch clamping te doen.

We hebben een vaste traprechte microscoop. De trap is vast, zoals ik al zei, dus de microscoop beweegt eronderheen vanaf een manipulator. We gebruiken een wigs en Newman micro manipulator om de trap te houden, de hoofdtrap van de versterker, we gebruiken een EPC 10 patch clamp versterker van heca.

En wat ik ook had moeten vermelden is dat we DIC met infraroodlicht gebruiken. Dus we hebben een IR camera hier, en alles wat we zien zal te zien zijn op het scherm wanneer we op zoek zijn naar CAEs. De patch clamp versterker wordt bediend door deze software, die Pulse heet, die ook van Heca is, en zal de versterker en alle fysiologieexperimenten besturen.

Resultaten zullen op dit scherm verschijnen. De caly heeft gehouden is een grote presynaptische terminal en omdat het groot is, kunnen we fysiek patchen op de terminal. Dus we kunnen presynaptische opnamen maken en dat is een uniek ding, vooral in het CNS.

Dus dit stelt ons in staat om calciumkanalen te meten die presynaptisch worden geactiveerd. Het ook, we kunnen ook actiepotentiaalactiviteit meten als we de zenuw wilden stimuleren die naar de calyx leidt. Wat we in dit lab doen is een proces meten genaamd exocytose, dat de fusie van blaasjes die neurotransmitter bevatten met het membraan is.

Nu in die blaasjes fuseren met het membraan in het proces genaamd exocytose, voegen ze membraan toe aan het synaptische terminaal, en we kunnen dat meten als een verandering in capaciteit. We krijgen een toename in capaciteit als membraan wordt toegevoegd aan de terminal, dus de experimenten die ik vandaag zal laten zien zijn capaciteitsmetingen, presynaptisch wanneer het membraan wordt verwijderd. Dus je kunt niet zomaar membraan blijven toevoegen, je moet er natuurlijk wat verwijderen.

Dat proces wordt endocytose of membraanopname genoemd. We kunnen dat ook meten en dat zal worden gemeten als een afname in de capaciteitsniveau en we zullen voorbeelden daarvan later laten zien. Nu wat dit ons toelaat is om calciumkanaalactiviteit te