Name: Methoden voor Patch Clamp capaciteit Recordings uit de Calyx (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 58 s
Description: Leer patch clamp-technieken voor presynaptische opnames aan de calyx of Held in rattenhersenweefsel. Deze methode minimaliseert weefselschade en biedt inzicht in synaptische transmissie en neurofysiologische processen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Patch Clamp Setup: Optiek: De optiek is zeer belangrijk om een goede cel te vinden, en om de positie van het vast te stellen. Probeer een duidelijk beeld van de cellen te krijgen: scherpe randen, soft-kijken cel. Scannen het hele veld om te zoeken naar een goede MNTB belangrijkste cellen met aangehechte kelk. Draai schotel te kijken naar kelken vanuit verschillende invalshoeken. In het begin is het OK om te oefenen op ballon-vormige terminal. Pick-cel aan het oppervlak van slice, of in de 2 e cellaag. Doel van de eerste 1 / 3 van cel met pipet Het identificeren van kelken: Kijk voor een dubbele membraan (zie figuur 1), en draai de plak schotel om het te zien vanuit verschillende invalshoeken om te helpen dat het een kelk te bevestigen. <img src="/files/ftp_upload/old/244_2008_8_22_2/244_Figure-01.png" alt="Figuur 1" width="298" height="159" /> Figuur 1 Diepte van Calyx: Calyx moet worden op het oppervlak of als aan het oppervlak als mogelijk te sluiten. Oppervlak beschikbaar voor het patchen: Gebruik fine-focus knop op microscoop om te bepalen hoe &#39;breed / diep &quot;de kelk is. Zo zal bijvoorbeeld ~ 10% van een hele draai op het scherpstellen geeft je meer dan genoeg oppervlakte om pleister op. Afdichting op een presynaptische cel: Om naar cel aangehecht, op zoek naar een &quot;kleine&quot; vervorming op het celoppervlak te wijten aan pos druk (~ 0.15psi) in de pipet, gebruik manipulator te pipet lopen omhoog, omlaag en over, en zelfs in het oppervlak van de presyn terminal om een ​​goede vervorming te krijgen, laat dan druk-en afzuigen, indien en voor zover nodig. PULSE, data-acquisitie programma: Moet buffer groter maken voor het eerste gebruik, en wanneer nodig door middel van steekproeven capaciteit. Noodzaak om te laden aangepaste macro&#39;s per keer. Vloeistof Junction Potentiële: Presyn recording oplossing is-11mV (negatieve 11mV). Presyn: Cslow = ~ 15 pF Rs comp voor presyn: 10 μsec, 65% (meer compensatie mogelijk w / out oscillaties) Voordat u de opname capaciteit: Test huidige ontspanning (10 mV, 10 msec springen) om te zien of ontspanning monoexponential is, dat wil zeggen, of presyn term kan worden gemodelleerd door een enkele ruimte. Filters: Stel bij 30 kHz en 10 kHz (Bessel-filter 1 en 2 respectievelijk) tijdens ontspanning meten, om er zeker van een snelle component is niet gemist. Tijdens de mini-opnames, Xinsheng gebruikt 10 kHz en 5kHz. LGW vroeg me om slechts 1 set filter gebruiken 30 kHz om ervoor te zorgen dat we kunnen stijgen-time meten van de mini. Bestanden benoemen: 7 cijfers 000mmxx, waar mm maand (of maand en jaar) en de xx is het aantal cellen. Cleaning Solution Lines: Lijnen gereinigd aan het einde van het experiment met 20 ml 0,1 M HCl gevolgd door 200 ml ddH2O. Externe oplossingen worden gerecycled, toerental van de pomp is 20-30 tpm. (Oplossing die terugkeerden van bad kamer stroomt terug in de maatcilinder). Stel drie uitgaande lijnen om voldoende afzuiging te garanderen. Pipetteer presynaptische opname Oplossing: ~ 310 milli osmolaire Presyn oplossing dient te worden ~ 310 mOsm naar R-toegang tot verhoging te voorkomen tijdens experiment. Presyn pipet oplossing is verschillend van postsyn pipet-oplossing (Presyn heeft ATP en GTP voor ex.). TTX-TEA Solution (Ca stroom isoleren): <ul><li> Proberen toe te passen na de sluiting, of zelfs patching, op de cel, zoals TEA in oplossing blokken K-kanalen en depolariseert de cel. Dat is niet goed voor de cel. Om dezelfde reden, zou het niet mogelijk om het plakje opnieuw te gebruiken nadat TTX is toegepast. </li><li> Vergelijk de eerste en de laatste reactie van de cel, of slice om te controleren voor elk effect van langdurige depolarisatie. </li><li> TTX wordt gebruikt bij 1 uM in plaats van 0,5 uM, zodat het effect is sneller. Wilt u minder tijd te wachten na het vervangen van oplossingen. </li></ul> Snijden Slices Vibratome instellingen: <ul><li> 70Hz laterale trillingen </li><li> Amplitude: 1,0 mm </li><li> Voorwaartse snelheid 0.01-0.02 mm / sec tijdens het snijden plakken met kelk, 0,1 anders dikte: 180 pm (~ 150um bij oudere dieren) </li></ul> Slices incuberen bij 37 º C gedurende 1 uur (inclusief snijden tijd), dat wil zeggen, laat in bad 15-20 minuten na het snijden. Pipetten: Presyn: 3.5-4.5 MΩ in het begin, 3.0-3.5 MΩ wanneer meer zelfvertrouwen Gebruik trekker handleiding om in te stellen. Gebruik vertraging functie, want glas is dik (vertraging van 200 of een werk) Glas type: Borosilicate, standaard muur, geen gloeidraad Outer Diameter: 2,0 mm Inner Diameter 1,16 mm Lengte: 7,5 cm

methoden voor patch clamp capaciteit recordings uit de calyx

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

We tonen de basistechnieken voor presynaptische patch clamp opname op de kelk van de Held, een centrale zenuwstelsel zenuwuiteinde. Elektrische opnames van de presynaptische terminal kan de meting van actiepotentialen, calcium kanaal stromen, vesicle fusie (exocytose) en de daaropvolgende membraan opname (endocytose). De fusie van de blaasjes met neurotransmitter zorgt ervoor dat het blaasje membraan te worden toegevoegd aan de celmembraan van de kelk. Deze toename van de hoeveelheid van de celmembraan wordt gemeten als een toename van de capaciteit. De daaropvolgende daling van de capaciteit geeft endocytose, het proces van het membraan opname of verwijdering uit de kelk membraan. Endocytose, is nodig om de structuur van de kelk te behouden en het is ook nodig om blaasjes die zal worden gevuld met neurotransmitter voor de toekomst exocytose gebeurtenissen vormen. Capaciteit opnames op de kelk van de Held hebben het mogelijk gemaakt om rechtstreeks en snel te meten vesiculaire release en de daarna endocytose in een zoogdier CZS zenuwuiteinde. Daarnaast kan de bijbehorende postsynaptische activiteit gelijktijdig worden gemeten met behulp van gepaarde opnames. Dus een compleet beeld van de presynaptische en postsynaptische elektrische activiteit op een centrale zenuwstelsel synaps is haalbaar met deze voorbereiding. Hier worden de methoden voor slice voorbereiding, morfologische kenmerken voor de identificatie van kelken van de Held, basic patch klem technieken en voorbeelden van capaciteit opnames naar exocytose en endocytose te meten gepresenteerd.

Methoden voor Patch Clamp capaciteit Recordings uit de Calyx

Wij demonstreren de basistechnieken voor presynaptische patchclamp-registratie bij de calyx van Held, een zenuwterminal in het centrale zenuwstelsel van zoogdieren. ...

Hallo, mijn naam is Ken Paradiso. Ik werk voor Ling Gang Wu bij het intramurale programma van het National Institute of Neurological Disorders and Stroke, gevestigd op de NIH-campus in Bethesda. Ik ga u de technieken laten zien voor presynaptische opname via patch-clamp in de calyx.Om het hersenweefsel voor te bereiden, verwijderen we de hersenen uit de rat. We plaatsen de hersenen in deze oplossing, een ijskoude calciumarme oplossing, die wordt gebubbelt met carbogeen om ervoor te zorgen dat er te allen tijde een zuurstoftoevoer naar de hersenen is. Bovendien moet de oplossing ijskoud zijn om de hoeveelheid schade te minimaliseren.De hersenen bevinden zich nu in deze oplossing. We halen ze eruit, snijden ze op de juiste manier zodat ze op het blok geplaatst kunnen worden, en monteren ze op het blok met Sano correlate of secondelijm. Vul de kamer vervolgens met ijskoude, calciumarme oplossing, belucht deze, plaats het geheel op de vibratie-unit en snijd vervolgens coupes met een dikte van 180 tot 190 microns bij een mesfrequentie van 70 hertz en een voorwaartse voortstuwingssnelheid van 0,01 tot 0,02 millimeters per seconde. Dat komt neer op 10 tot 20 microns per seconde.Zodra elke

methods-for-patch-clamp-capacitance-recordings-from-the-calyx

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit is bedoeld als een kennismaking met klem opnemen patch van Xenopus laevis oöcyten. Het omvat vitelline membraan verwijderen, de vorming van een gigaohm afdichting (gigaseal), en de optionele conversie van de patch naar buiten-out topologie.

Patch Clamp Opname van ionenkanalen Uitgedrukt in Xenopus Eicellen

Ionische stroom van BK kanalen wordt geregistreerd met behulp van patch-clamp technieken. BK kanalen worden uitgedrukt...

Patch Clamp en perfusie technieken voor het bestuderen van Ion Channels Uitgedrukt in Xenopus Eicellen

Wij bieden een stap-voor-stap protocol voor whole-cell patch clamp opname van calcium release-Activated Calcium (CRAC) stromingen in het perifere bloed mononucleaire cel afkomstige menselijke T-lymfocyten.

Whole-cell opname van calcium release-Activated Calcium (CRAC) Stromingen in menselijke T-lymfocyten

Hier beschrijven we een protocol voor de bereiding van agar-embedded netvlies plakken die geschikt zijn voor elektrofysiologie en Ca2 + beeldvorming. Deze methode laat toe om te studeren lint-type synapsen in het netvlies microcircuits met behulp van directe patch-clamp opnames van enkele presynaptische zenuwuiteinden.

Patch-clamp capaciteitsmetingen en Ca 2 + Imaging bij Single zenuwuiteinden in het netvlies Slices

Dit protocol beschrijft een techniek genaamd whole-cell patch clamp electrophysiology, een methode om elektrische eigenschappen van Mauthner neuronen en andere reticulospinale cellen in zebravisembryo's te bestuderen.

Whole-Cell Patch Clamp Electrophysiology: een methode om elektrische eigenschappen van neuronen te bestuderen

We hebben een intacte hersenen ruggenmerg voorbereiding voor het vastleggen en bewaken elektrische activiteit via patch clamp opname van de Mauthner neuronen en andere reticulospinal cellen in de zebravis embryo's ontwikkeld. Zo zijn wij in staat om prikkelende en remmende synaptische stromen, voltage-gated kanaal activiteit en actiepotentialen opnemen van belangrijke neuronen in een zich ontwikkelende embryo.

Patch Clamp Recordings van embryonale zebravis Mauthner Cells

Hier beschreven is een procedure voor het verkrijgen van lange stukken huidige opname van een ionkanaal met de cel-bijgevoegde patch-clamp techniek. Deze methode maakt het mogelijk voor het observeren, in real time, het patroon van open-close kanaal conformaties dat de biologische signaal ten grondslag liggen. Deze gegevens informeren over kanaal woningen in ongestoord biologische membranen.

Eenkanaals-Cell bevestigd Patch-clamp-opname

Na exocytose wordt het gefuseerde plasmamembraan teruggewonnen via een proces dat bekend staat als endocytose. Dit mechanisme vormt nieuwe synaptische blaasjes voor de volgende ronde van afgifte. Individuele endocytische gebeurtenissen worden vastgelegd en geanalyseerd door middel van cel-gebonden capacitieve opnames in muisbijnierchromaffinecellen.

Methoden voor-Cell bevestigd Capaciteitsmetingen in Muis bijnier Chromaffinecellen Cell

Het huidige protocol beschrijft een efficiënte methode voor de real-time en dynamische acquisitie van voltage-gated kalium (Kv) kanaalstromen in H9c2 cardiomyocyten met behulp van de whole-cell patch-clamp techniek.

Spanningsafhankelijke kaliumstroomregistratie op H9c2-cardiomyocyten via de whole-cell patchklemtechniek

Dit is een gids voor het wijzigen van de vorm van glas micropipetten. In het bijzonder door gebruik te maken van warmte en luchtdruk van de taper is verbreed zonder verhoging van de tip opening, wat leidt tot een lagere weerstand pipet. Dit is essentieel voor het lage geluidsniveau opnamen van kleine cellen te verkrijgen, maar is nuttig in tal van toepassingen.

Druk polijsten pipetten voor verbeterde patch-clamp opnemen

Leer patch clamp-technieken voor presynaptische opnames aan de calyx of Held in rattenhersenweefsel. Deze methode minimaliseert weefselschade en biedt inzicht in synaptische transmissie en neurofysiologische processen.

Methoden voor Patch Clamp capaciteit Recordings uit de Calyx

Meer video's verkennen