Name: Detectie van Functionele matrix metalloproteinasen door zymografie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-08T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Leer functionele matrix metalloproteinasen detecteren door zymografie met gelatine-gelelektroforese en banddensiteitsanalyse. Deze methode visualiseert MMP-activiteit in celkweeksupernatanten voor onderzoek naar weefselremodellering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag Dr S. Ressler (Departement Moleculaire en Cellulaire Biologie, Baylor College of Medicine) bedanken voor het suggereren van het gebruik van eiwit concentrators om de concentratie van MMP&#39;s te verhogen in cel kweeksupernatanten. Dit project werd ondersteund door subsidies van de mevrouw Clifford Elder White Graham Bijzonder Onderzoeksfonds en de NIH / NIAMS (AR059838) naar CB. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de NIH.

1. Het laden en draaien van de Gel <ol><li> Alle monsters moeten adequaat worden voorbereid om de functie van de enzymen te behouden en direct gebruikt na inzameling of bevroren opgeslagen bij -80 ° C. De monsters mogen geen reductiemiddelen (zoals een β-mercapto-ethanol) of worden gekookt alvorens gel geladen. </li><li> Open het zakje met een gel in een cassette, spoel de cassette met gedeïoniseerd water. <ul><li> Verwijder de beschermende tape van de onderzijde van de cassette en de kam van de bovenkant van de gel. </li><li> Spoel de putjes drie keer met stromend buffer (verdund tot 1X in gedemineraliseerd water). </li><li> Plaats de gel in de Mini-Cell, zodat de kleinere kant van de cassette naar binnen gezichten. Vastklikken met de Gel Tension Wedge. De Mini-Cell maakt het mogelijk om een ​​of twee gels parallel lopen. </li><li> Vul de top (binnen) kamer met 1X loopbuffer boven putten niveau, controleren op eventuele lekkages. In het geval van lekken, verwijder de buffer en de positie van de gel. </li><li> Vul de Tweede Kamer met 1X lopen buffer. </li></ul></li><li> Belasting 10 pi van eiwitten moleculaire merker in een goed. <ul><li> Meng een gelijke hoeveelheid van de gel-loading buffer en van het monster en laden in de putjes van de gel met behulp van gel-loading tips (veranderd tussen elk monster). Deze putten kunnen worden geladen met maximaal 20 pi totaal. </li></ul></li><li> Plaats het deksel op de Mini-Cell en sluit de elektrode snoeren op de voeding. Schakel de voeding op en zet deze om te draaien met 125 V constant gedurende 90 minuten. Controleer de vorming van kleine belletjes op de draad van de Tweede Kamer, met vermelding van de huidige circulatie. </li><li> Bij het uitvoeren van uw eerste gel, de voortgang van de migratie om de 15 minuten, met behulp van de broomfenolblauw opgenomen in de laadbuffer als een indicator. Laat de gel draaien totdat de indicator kleurstof bereikt de onderkant van de gel. </li></ol> 2. Renaturing en Ontwikkeling van de Gel <ol><li> Voor elke gel, bereiding van 100 ml 1X renaturing buffer en 200 ml van de denaturering buffer, zowel in gedeïoniseerd water. </li><li> Wanneer de broomfenolblauw tracking kleurstof de bodem van de gel heeft bereikt, schakelt de stroomvoorziening uit, open de Mini-Cell, en verwijder de gel. Scheid de twee zijden van de cassette het gebruik van de gel mes (of een gewicht van spatel). Snij een hoek om de gel de richting markeren. </li><li> Verwijder voorzichtig de gel uit de cassette en plaats in een container met 100 ml renaturing buffer. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur onder zacht schudden. </li><li> Verwijder de renaturing buffer en voeg 100 ml van de ontwikkeling van buffer naar de gel. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur onder zacht schudden. </li><li> Verwijder de zich ontwikkelende buffer en voeg 100 ml meer van de ontwikkeling van buffer naar de gel. Incubeer overnacht (16-18 uur) bij 37 ° C. </li><li> Verwijder de zich ontwikkelende buffer en spoel drie keer (5 minuten) met gedemineraliseerd water onder zacht schudden bij kamertemperatuur. </li><li> Scan de gel om de exacte positionering van het eiwit standaard banden op te slaan als ze minder of niet zichtbaar zijn na gel kleuring. </li><li> Vlekken op de gel door het toevoegen van 20 ml SimplyBlue Safestain aan de gel. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur onder zacht schudden. </li><li> Verwijder de SimplyBlue SafeStain en de-vlek van de gel in 100 ml of meer gedeïoniseerd water gedurende een uur bij kamertemperatuur onder zacht schudden. </li><li> Voor betere resultaten, te vervangen met vers gedeïoniseerd water en incubeer gedurende een uur of meer bij kamertemperatuur onder zacht schudden. </li></ol> 3. Data Analysis <ol><li> Verwijder voorzichtig de gel uit het water en in een plastic beschermer. </li><li> Scan de gel met een resolutie van 300 dpi of hoger. Sla de afbeelding op in het TIFF-formaat (Figuur 1A). </li><li> Meet band intensiteiten ImageJ (of een andere soortgelijke software). <ul><li> Open het TIFF-bestand in ImageJ (Figuur 1A). </li><li> Visualiseer in zwart en wit door het selecteren van "Image&gt; type&gt; 8-bit" (Figuur 1B). </li><li> Gebruik de rechthoekige selectie gereedschap om de eerste band overzicht, het tekenen van een rechthoek ten minste twee keer hoger is dan breed is (dit is een software-eis). </li><li> Druk op "1" of "Analyze&gt; Gels&gt; Selecteer eerst lane" en de band zal worden geschetst. </li><li> Een nieuwe rechthoek zal verschijnen, verplaatsen naar de volgende band en selecteer "Analyze&gt; Gels&gt; Selecteer volgende baan". Herhaal dit totdat alle bands zijn geselecteerd (Figuur 1B). </li><li> Druk op "3" of "Analyze&gt; Gels&gt; Plot rijstroken" om het profiel plot voor elke band (figuur 1C) te genereren. </li><li> Gebruik de rechte lijn selectie (moet al automatisch worden geselecteerd) te baseren lijnen te trekken, zodat het hoogtepunt van belang is een volledig afgesloten ruimte. </li><li> Selecteer het gereedschap toverstaf en klik in elke piek om deze te selecteren. </li><li> Selecteer "Analyze&gt; Gels&gt; Label pieken" om een ​​tafel te krijgen met het gebied voor elke geselecteerde piek. Deze gegevens kunnen worden uitgezet als zodanig (Figure 1D) of kan worden genormaliseerd om de waarde van een gekozen band. Deze normalisering is vooral belangrijk als bundeling van waarden uit verschillende repliceren gels om statistische significantie van de resultaten bepalen. </li></ul></li></ol> 4. Representatieve resultaten We tonen een gel met 11 putten geladen met andere cel kweeksupernatanten met verschillende hoeveelheden van MMP-2 (Figuur 1A). Directe waarneming van deze gel laat duidelijke verschillen in MMP-2 concentraties van een aantal van de putten. Bijvoorbeeld, is het duidelijk dat putten # 4 en 5 nog veel meer MMP-2 dan ook # 11 of zelfs goed # 10 bevatten. Voor de objectieve kwantificering van bands die we hebben gebruikt densitometrie met de ImageJ software (Figuur 1B-D), bevestigt een ongeveer 4-voudig verschil in MMP-2 bedragen tussen goed # 11 en # putten 4 en 5 en een ongeveer 2-voudig verschil in MMP-2 bedragen tussen goed # 10 en # putten 4 en 5. <img src="/files/ftp_upload/2445/2445fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Detectie van MMP-2 door gelatine zymografie. A, gescande beeld van een gelatine gel. Nou nummers zijn aangegeven op de bovenkant van de gel. B, dezelfde gel als in A weergegeven in zwart-wit voor densitometrie. Elke band werd geselecteerd met een rechthoek in ImageJ. C, Twee voorbeelden van densitometrie profielen voor de gel die in A en B (bands # 4 en # 11). Een rechte lijn werd getrokken aan de basis van elke piek een gesloten ruimte te creëren. D, Standplaats van de piek gebieden voor de gel die in A en B voor (links) en na (rechts) normalisatie om de dichtheid van de band # 1. <img src="/files/ftp_upload/2445/2445fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Dit cijfer laat zien hoe zymografie gebruikt kan worden als een semi-kwantitatieve techniek. We hebben geladen seriële verdunningen (stappen van 1:1 verdunningen) in 7 opeenvolgende putten en gemeten de band dichtheden voor zowel de pro-MMP-2 en MMP-2.

<ol><li>Luo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+matrix+metalloproteinases+in+the+morphogenesis+of+the+cerebellar+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">The role of matrix metalloproteinases in the morphogenesis of the cerebellar cortex.</a> Cerebellum. 4, 239-245 (2005).</li>
<li>Pasternak, B., Aspenberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metalloproteinases+and+their+inhibitors+-+diagnostic+and+therapeutic+opportunities+in+orthopedics%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Orthop%22%5BJournal%5D)">Metalloproteinases and their inhibitors - diagnostic and therapeutic opportunities in orthopedics.</a> Acta Orthop. 80, 693-703 (2009).</li>
<li>Kessenbrock, K., Plaks, V., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases%3A+regulators+of+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment.</a> Cell. 141, 52-67 (2010).</li>
<li>Lagente, V., Boichot, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+matrix+metallopreoteinases+in+the+inflammatory+process+of+respiratory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Role of matrix metallopreoteinases in the inflammatory process of respiratory diseases.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 48, 440-444 (2010).</li>
<li>Rodríguez, D., Morrison, C. J., Overall, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metallopreoteinases%3A+what+do+they+not+do%3F+New+substrates+and+biological+roles+identified+by+murine+models+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Matrix metallopreoteinases: what do they not do? New substrates and biological roles identified by murine models and proteomics.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1803, 39-54 (2010).</li>
<li>Bourboulia, D., Stetler-Stevenson, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases+%28MMPs%29+and+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases+%28TIMPs%29%3A+positive+and+negative+regulators+in+tumor+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs): positive and negative regulators in tumor cell adhesion.</a> Semin. Cancer Biol. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Heussen, C., Dowdle, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+analysis+of+plasminogen+activators+in+polyacrylamide+gels+containing+sodium+dodecyl+sulfate+and+copolymerized+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochem%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates.</a> Analytical Biochem. , 102-196 (1980).</li>
<li>Lombard, C., Saulnier, J., Wallach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+of+matrix+metalloproteinases+%28MMPs%29+activities%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Assays of matrix metalloproteinases (MMPs) activities: a review.</a> Biochimie. 87, 265-272 (2005).</li>
<li>Snoek-van Beurden, P. A., Von den Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zymographic+techniques+for+the+analysis+of+matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors.</a> Biotechniques. 38, 73-83 (2005).</li>
<li>Kupai, K., Szucs, G., Cseh, S., Hajdu, I., Csonka, C., Csont, T., Ferdinandy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase+activity+assays%3A+importance+of+zymography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase activity assays: importance of zymography.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 61, 205-209 (2010).</li>
<li>Kleiner, D. E., Stetler-Stevenson, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+zymography%3A+detection+of+pictogram+quantities+of+gelatinases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Quantitative zymography: detection of pictogram quantities of gelatinases.</a> Anal. Biochem. 218, 325-329 (1994).</li>
<li>Yu, W. H., Woessner, J. F. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin-enhanced+zymographic+detection+of+matrilysin+and+collagenases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Heparin-enhanced zymographic detection of matrilysin and collagenases.</a> Anal. Biochem. 293, 38-42 (2001).</li>
</ol>

We hebben aangetoond hoe zymographic analyse van MMP-2 in cel kweeksupernatanten uit te voeren. De hoeveelheid van het monster te laden op een gel moet worden bepaald empirisch afhankelijk van de herkomst en de MMP van belang. Het laden te weinig zal voorkomen dat detectie tijdens het laden te veel kan leiden tot een verzadiging als er maar zo veel substraat een protease kan verteren in het gebied van de band. Indien nodig, kan het monster worden verdund in gedeïoniseerd water vóór het mengen met het laden van buffer of het ontwikkelen van de tijd kan de verlaagd van &#39;s nachts tot 4 uur. Het is ook mogelijk om eiwitten te concentreren in een oplossing met behulp van concentrators (bijv. Millipore catalogus # UFC803024). Als bands blijven nauwelijks zichtbaar zijn, kan het nodig zijn om de gels voor een langere tijd ontwikkelen, zelfs tot 48 uur. Bij de voorbereiding van monsters van weefsel kweeksupernatanten, dient te worden opgemerkt dat foetale runder serum (en andere sera) MMP&#39;s die invloed hebben op de resultaten bevat. Om deze reden, verzamelen we al onze supematanten na cultuur in serum-vrij medium. Het wast beschreven in de paragrafen 2.9 en 2.10 van het protocol nodig zijn om de achtergrond kleuring van verteerde banden te verwijderen. Langere wastijden verwijdert meer achtergrond, maar zal ook dimmen de kleuring van de ondergrond in de gel. Als er langere tijd was nodig zijn, raden we het scannen van de gel om de paar uur om de scan te selecteren met de beste contrast. Deze techniek kan gebruikt worden om andere MMP&#39;s op te sporen. Kan bijvoorbeeld MMP-9 worden gedetecteerd op gelatine gels, en ook in mindere mate MMP-1, MMP-8 en MMP-13 zoals gelatine is niet hun voorkeur substraat. MMP-1 en MMP-13 zijn het beste gedetecteerd op collageen zymografie terwijl caseïne is de beste substraat voor MMP-11 en maakt het ook mogelijk voor de detectie van MMP-1, MMP-3, MMP-7, MMP-12 en MMP-13 9. MMP-7 (matrilysin) en collagenasen (MMP-1 en MMP-13) zijn moeilijk te detecteren wanneer deze zich op een laag niveau in caseïne of gelatine gels. Toevoeging van heparine aan de steekproef op het moment van het laden van gel verbetert de detectiegrens voor MMP-7. Voor MMP-1 en MMP-13, de heparine te worden toegevoegd aan de gel na het elektroforetisch run is al aan de gang 12. Sinds zymografie maatregelen enzymatische activiteit na denaturatie en renaturatie van de enzymen, zal het meten van de activiteit van alle MMP&#39;s in het monster aanwezig. Deze enzymen, pro-enzymen, en enzymen gebonden aan endogene remmers (bijv. TIMP-2). Het is echter mogelijk om het niveau van MMP activering in de monster te bepalen door het vergelijken van de band dichtheid van het actieve enzym en van die van de pro-enzym, dat een iets hoger moleculair gewicht zal hebben. Zymografie is vaak niet voldoende om een ​​MMP te identificeren. Vergelijking van de migratie van een MMP met een bekend molecuulgewicht normen helpt bij de identificatie, maar dient te worden opgemerkt dat sommige van deze normen een reductiemiddel bevat en dat bij gebruik onder niet-reducerende voorwaarden zij zich kunnen wijzen op verschillende moleculaire gewichten 9. Een optie is om een ​​oplosbare recombinant MMP belasting op dezelfde gel als de analysemonsters. MMPs kunnen echter in verband worden gebracht met andere eiwitten, het induceren van een verandering in de schijnbaar moleculair gewicht. Selectieve MMP-remmers kan worden toegevoegd aan de gel (of een deel van een gel gehalveerd) tijdens de incubatie in de ontwikkeling van buffer als farmacologische instrumenten om de identiteit van de MMP van interest.A tweede techniek (Western Blot, immunocytochemie, of ELISA) wordt aanbevolen om helpen bij de identificatie van de MMP van belang. Opgemerkt moet worden dat de detectielimieten voor de westerse Blots vaak veel lager dan die van zymographic gels, wat kan leiden tot fout-negatieve resultaten bij het gebruik van deze techniek.

<table><tbody><tr><td>Xcell SureLock Mini-Cell CE-elektforeseapparaat</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>Voeding (model 302)</td><td>VWR international</td><td>93000-744</td><td></td></tr><tr><td>Novex 10% gelatine-zymogramgels, 1,0 mm, 12 wells</td><td>Invitrogen</td><td>EC61752BOX</td><td></td></tr><tr><td>Blue Juice gel-laadbuffer</td><td>Invitrogen</td><td>10816015</td><td></td></tr><tr><td>Gel-laadpunten</td><td>VWR international</td><td>53509-015</td><td></td></tr><tr><td>Proteïne molecuulgewichtstandaard</td><td>Invitrogen</td><td>LC5800</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tris-Glycine-SDS runbuffer</td><td>Invitrogen</td><td>LC2675</td><td></td></tr><tr><td>Novex zymogram renatureringsbuffer</td><td>Invitrogen</td><td>LC2670</td><td></td></tr><tr><td>Novex zymogram ontwikkelbuffer</td><td>Invitrogen</td><td>LC2671</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>Epson Perfection 4490 fotoscanner</td><td>Amazon</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ-software</td><td>http://rsbweb.nih.gov/ij/</td><td>n/a</td><td>Auteur W. Rasband, NIH/NIMH</td></tr></tbody></table>

detectie van functionele matrix metalloproteinasen door zymografie

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Matrix (MMP&#39;s) zijn zink-bevattende endopeptidasen. Ze breken eiwitten door splitsing van peptidebindingen. Meer dan twintig MMP&#39;s zijn geïdentificeerd en worden gescheiden in zes groepen op basis van hun structuur en substraat specificiteit (collagenases, gelatinasen, membraan [MT-MMP], stromelysins, matrilysins, en anderen). MMP&#39;s spelen een cruciale rol in cel invasie, afbraak van kraakbeen, weefsel remodelleren, wondgenezing, en embryogenese. Daartoe nemen zij deel in zowel de normale processen en in de pathogenese van vele ziekten, zoals reumatoïde artritis, kanker, of chronische obstructieve longziekte 1-6. Hier zullen we ons richten op MMP-2 (gelatinase A, type IV collagenase), een breed uitgedrukt MMP. We zullen laten zien hoe u MMP-2 te detecteren in cel kweeksupernatanten door zymografie, een veel gebruikte, eenvoudige en toch zeer gevoelige techniek voor het eerst beschreven in 1980 door C. Heussen en EB Dowdle 7-10. Deze techniek is semi-kwantitatief, kan dus gebruikt worden om MMP niveaus in proefmonsters bepalen wanneer bekende concentraties van recombinant MMP worden geladen op dezelfde gel 11. Oplossingen die MMPs (bijv. mobiele kweeksupernatanten, urine of serum) worden geladen op een polyacrylamide gel met natriumdodecylsulfaat (SDS, om de eiwitten lineariseren) en gelatine (substraat voor MMP-2). Het monster buffer is bedoeld om te proeven viscositeit te verhogen (tot gel laden te vergemakkelijken), een tracking kleurstof (broomfenolblauw, om te proeven migratie monitor) te bieden, om te voorzien denatureren moleculen (aan eiwitten lineariseren), en de controle van de pH van het monster. Eiwitten worden dan toegestaan ​​om op grond van een elektrische stroom migreren in een actieve buffer ontworpen om een ​​constante migratie tarief te bieden. De afstand van de migratie is omgekeerd gecorreleerd met het molecuulgewicht van het eiwit (kleine eiwitten bewegen sneller door de gel dan de grote eiwitten doen en daarom verder naar beneden de gel migreren). Na de migratie, wordt de gel in een renaturing buffer om eiwitten om hun tertiaire structuur, die noodzakelijk zijn voor enzymatische activiteit te herwinnen. De gel wordt dan geplaatst in een ontwikkelingsland buffer is ontworpen om de protease aan de ondergrond te verteren. De ontwikkelingslanden buffer bevat ook p-aminophenylmercuric acetaat (APMA) om de niet-proteolytische pro-MMP&#39;s te activeren in actieve MMPs. De volgende stap bestaat uit het kleuren van de ondergrond (gelatine in ons voorbeeld). Na het wassen de overtollige kleurstof uit de gel, de gebieden van protease spijsvertering verschijnen als duidelijk bands. Hoe duidelijker de band, hoe geconcentreerder de protease bevat. Band kleuringsintensiteit kan dan worden bepaald door densitometrie, met behulp van een software zoals ImageJ, waardoor sample vergelijking.

Dit protocol beschrijft een activiteit-gebaseerde test voor het opsporen van matrix metalloproteïnasen in kweeksupernatanten of lichaamsvloeistoffen.

Detectie van Functionele matrix metalloproteinasen door zymografie

Matrixmetalloproteïnasen (MMP's) zijn zinkbevattende endopeptidasen. Ze breken eiwitten af door de splitsing van peptidebindingen. Er zijn meer dan twintig MMP's ...

Het algemene doel van deze procedure is het detecteren van functionele matrixmetalloproteïnasen. Dit wordt bereikt door de monsters eerst voor te bereiden door een loadingsbuffer zonder reducerende middelen toe te voegen. Gelatine-zymografie-gel wordt vervolgens geladen met het monster enstroomt totdat de trackingkleurstof het einde van de gel bereikt.Na de elektroforese wordt de gel gedenatureerd, ontwikkeld, gekleurd en ontkleurd. De laatste stap van de procedure is het scannen van de gel voor data-analyse. Uiteindelijk kunnen er resultaten worden verkregen die de activiteit van matrixmetalloproteïnasen in de monsters aantonen via een banddichtheidsanalyse.Hallo, ik kom uit het laboratorium van Dr. Kristin Bitten van de afdeling Moleculaire Fysiologie en Biofysica aan het LER College of Medicine. Vandaag tonen we u een procedure voor het detecteren van matrixmetalloproteïnasen via zymografie. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om matrixmetalloproteïnasen te bestuderen die worden uitgescheiden door gekweekte primaire cellen.Laten we beginnen met de studie. Bereid vóór de start van dit protocol alle matrixmetalloproteïnasen of MMP's adequaat voor om de functie van de enzymen te behouden. De monsters kunnen direct worden gebruikt of worden bewaard bij -80 °C.Hier wordt MMP-2, ook bekend als gelatinase A of type vier collagenase, gebruikt om de visualisatie van MP-activiteit met zymografie aan te tonen. Zodra de MMP-enzymen zijn voorbereid, neem een 10% gelatin zymogram-gelzak met daarin een gel in een cassette. Spoel de cassette af met gedeïoniseerd water.Verwijder de beschermende tape van de onderkant van de cassette en de kam uit de bovenkant van de gel. Spoel de putjes drie keer met tris-glycine SDS-runbuffer.Plaats de gel in een mini-elektroforeseapparaat, waarbij u erop let dat de kortere zijde van de cassette naar binnen is gericht. Zet de gel vast met de geltspanningswig. Vul de bovenste kamer van het apparaat met tris-glycine SDS-loopbuffer tot boven het niveau van de wells en controleer op lekkages.Vul ook de onderste kamer van de gel-elektroforese-opstelling met loopbuffer. Laad vervolgens 10 µL proteïne-moleculaire marker. Meng een gelijke hoeveelheid van het monster met een gel-laadbuffer die geen reducerende middelen bevat.In tegenstelling tot een reguliere SDS-PAGE worden de monsters niet gekookt, maar direct in de wells van de gel geladen. Met behulp van gel-laadpunten kunnen deze wells een volume tot 20 µL bevatten. Plaats het deksel op de minicel en sluit de elektrodekabels aan op de stroomvoorziening.Schakel de voeding in en stel de gel in om gedurende 90 minuten constant op 125 volt te lopen. Controleer bij de eerste gel de vorming van kleine belletjes op de draad van de onderste kamer, wat duidt op stroomcirculatie. Volg de voortgang van de migratie elke 15 minuten met behulp van het bromfenolblauw in de laadbuffer als indicator voor elke gel.Bereid 100 milliliter van een eenvoudige xmo gram Rena-buffer en 200 milliliter van een xmo gram ontwikkelbuffer, beide in gedeïoniseerd water. Wanneer de bromofenolblauw-trackingkleurstof de onderkant van de gel bereikt, schakelt u de voeding uit. Open de mini-cel en verwijder de gel.Scheid de twee zijden van de cassette. Snijd met een gelermes een hoekje weg om de richting van de gel te markeren. Verwijder de gel voorzichtig uit de cassette en plaats deze in een container met 100 milliliters Rena Buffer.Incubeer de gel gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur onder zachte agitatie, verwijder de Rena-buffer en voeg 100 milliliters ontwikkelbuffer toe aan de gel. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur onder zachte agitatie. Verwijder vervolgens de ontwikkelbuffer en voeg nog eens 100 milliliters verse ontwikkelbuffer toe aan de gel.Incubeer de gel een nacht bij 37 °C. Verwijder na de incubatie de ontwikkelbuffer en was de gel door deze te incuberen in gedeïoniseerd water met een zachte agitatie. Herhaal deze wasstap twee keer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.Plaats de gel op een plastic insteekhoes en verwijder luchtbellen. Scan de gel vervolgens met een fotoscanner om de exacte positie van de banden van de eiwitstandaard op te slaan, aangezien deze na het kleuren van de gel nauwelijks meer zichtbaar zullen zijn.Kleur de gel door 20 milliliters simply blue safe stain aan de gel toe te voegen. Incubeer de gel gedurende één uur bij kamertemperatuur. Verwijder onder zachte agitatie de simply blue safe stain en ontkleur de gel in 100 milliliters gedeïoniseerd water bij kamertemperatuur onder zachte agitatie.Vervang het water na één uur door vers gedeïoniseerd water en laat de gel nog ten minste één uur incuberen. Om de gegevens via cytometrie te analyseren, dient de gel eerst voorzichtig uit het water te worden gehaald en in een plastic insteekhoes te worden geplaatst. Scan de gel vervolgens met een fotoscanner met een resolutie van 300 dots per inch of hoger.Sla de afbeelding op in TIFF-formaat. Open het TIFF-bestand in Image J of vergelijkbare kwantificatiesoftware om de bandintensiteiten te meten. Visualiseer de afbeelding in zwart-wit door het beeldtype eight bit te selecteren.Gebruik het rechthoekige selectie-instrument om de eerste band te omkaderen door een rechthoek te tekenen die minstens twee keer zo hoog als breed is. Selecteer 'analyze gels'. Selecteer 'first lane', waarna de band zal worden geselecteerd.Er verschijnt vervolgens een nieuw rechthoekje. Versleep dit naar de volgende band en selecteer Analyze gels, select next lane. Herhaal dit proces totdat alle banden zijn geselecteerd.Selecteer de optie 'analyze gels plot lanes' om het profieldiagram voor elke band te genereren. Gebruik de selectie met de rechte lijn om basislijnen te trekken, zodat de piek van belang een volledig omsloten gebied vormt. Selecteer de toverstaf en klik binnen elke piek om deze te selecteren.Selecteer 'analyze gels' en 'label peaks' om een tabel te verkrijgen met het oppervlak van elke geselecteerde piek. Deze gegevens kunnen zo worden uitgezet of kunnen worden genormaliseerd naar de waarde van een gekozen band. Deze normalisatie is vooral belangrijk wanneer waarden van meerdere replica-gels worden samengevoegd om de statistische significantie van de resultaten te bepalen.Elke put van de gel die hier wordt getoond, is gevuld met een verschillende celcultuur. Supernatans met verschillende hoeveelheden MMP2. Directe observatie van deze gel toont duidelijke verschillen in MMP2-concentraties tussen sommige van de putten.Bijvoorbeeld is duidelijk dat zowel putje vier als vijf veel meer MMP 2 bevatten dan putjes 10 en 11 voor de objectieve kwantificering van banden. Densitometrie werd uitgevoerd met de Image J-software. Deze software onthulde een ongeveer viervoudig verschil in mmp.Twee hoeveelheden tussen, nou, put 11 en put vier en vijf. Op dezelfde manier werd een tweevoudig verschil in MMP2-hoeveelheden waargenomen tussen put 10 en put vier en vijf. We laten u hiermee zien hoe functionele metrieken kunnen worden gedetecteerd.Metaal persis door xog. Wanneer u deze procedure uitvoert, is het belangrijk om te onthouden dat u uw monster niet mag koken. Anders kunt u geen banden op uw gel zien.Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experiment.

detection-of-functional-matrix-metalloproteinases-by-zymography

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In dit artikel beschrijven we het gebruik van magnetische pincet om het effect van geweld op enzymatische proteolyse studeren aan de enkel molecuul niveau in een zeer parallelizable manier.

Multiplexed Single-molecule force Proteolyse metingen met behulp van magnetisch pincet

In this video, we perform zymography, an electrophoretic technique, to analyze the proteolytic activity within biological samples.

Fluorescent Peptide Zymography: A Modified Technique to Detect Protease Activity Using Fluorogenic Substrates in Zymogram Gels

This video demonstrates the zymography gel electrophoresis technique to assess the activity of matrix metalloproteinases (MMPs) present in cell culture supernatant. The active MMPs degrade the MMP-specific substrate embedded in a polyacrylamide gel, which appears as clear bands against a dark stained background following staining.

Zymography Gel Electrophoresis: An Electrophoretic Technique to Detect Matrix Metalloproteinases by Assessing the Enzymatic Activity

Nauwkeurige massa meting betekent een belangrijke stap tijdens het onderzoek van eiwitten. Matrix-geassisteerde laser desorptie / ionisatie (MALDI) massaspectrometrie (MS) kan worden gebruikt voor deze vaststelling en van zijn belangrijkste voordeel is de tolerantie voor zouten, detergentia en verontreinigingen. Hier tonen we een toegankelijke benadering voor de analyse van eiwitten groter dan 100 kDa door MALDI-MS.

Matrix-laserdesorptie / ionisatie Time of Flight (MALDI-TOF) massaspectrometrische analyse van intacte eiwitten groter dan 100 kDa

Dit protocol beschrijft hoe u een 2D gemengde matrix voorbereidt, bestaande uit gelatine en collageen I, en een 3D collageen I plug om lineaire invadosomen te bestuderen. Deze protocollen staan ​​voor de studie van lineaire invadosoomvorming, matrixdegradatieactiviteit en de invasiemogelijkheden van primaire cellen en kankercellijnen.

2D en 3D matrices om Lineaire Invadosome Formatie en Activiteit te bestuderen

Hier presenteren we een protocol bij het bepalen van protease specificiteit in ruwe muis weefsel extracten met behulp van spectrometrie van de MALDI-TOF.

De vaststelling van specificiteit uit Protease in muis weefsel extracten met behulp van de Spectrometrie van de massa van de MALDI-TOF: manipuleren van de PH veroorzaken specificiteit wijzigingen

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor een gewijzigde zymographic techniek waarin fluorescerende peptides worden gebruikt als het afbreekbaar substraat in plaats van de inheemse proteïnen. Elektroforese van biologische monsters in fluorescerende peptide zymograms maakt detectie van een breder scala van proteasen dan vorige zymographic technieken.

Opsporen van Protease-activiteit door fluorescerende Peptide Zymography

Hier, een protocol wordt gepresenteerd voor het inkapselen van en het kweken van cellen in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels matiemaatschappij met een fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-afbreekbaar peptide. Cellulaire MMP en metabole activiteit wordt gemeten rechtstreeks vanaf de hydrogel culturen met behulp van een standaard microplate-lezer.

Meten mondiale cellulaire Matrix Metalloproteinase en metabole activiteit in 3D Hydrogels

His-tag zuivering, dialyse en activering worden gebruikt om de opbrengst van oplosbare, actieve matrix metalloproteinase-3 katalytische domein eiwitexpressie in bacteriën te verhogen. Eiwitfracties worden geanalyseerd via SDS-PAGE gels.

Bacteriële expressie en zuivering van humane matrix metalloproteinase-3 met behulp van affiniteitschromatografie

Proteïnasen zijn van vitaal belang voor bacteriële pathogenese, waardoor invasie en immuunontwijking mogelijk worden. Extractie in één stap van cytoplasmatische en membraaneiwitten van bacteriën in hun actieve vorm is schrijnend. Dit video-artikel demonstreert de extractie van volledige cellulaire eiwitten van Leptospira voor zymografie-analyse om gelatinasen te detecteren en te karakteriseren.

Extractie in één stap en zymografische analyse van bacteriële gelatinasen

Leer functionele matrix metalloproteinasen detecteren door zymografie met gelatine-gelelektroforese en banddensiteitsanalyse. Deze methode visualiseert MMP-activiteit in celkweeksupernatanten voor onderzoek naar weefselremodellering.

Detectie van Functionele matrix metalloproteinasen door zymografie

Meer video's verkennen