Tot vaststelling van Embryonale Mouse Neural Stem Cell Culture Met behulp van de Neurosphere Assay

Het doel van dit videoprotocol is om neurale stamcellen te isoleren en te expanderen uit het embryonale muizenbrein met behulp van de neurosphere-assay. De procedure omvat het oogsten van E 14 muizenembryo's, gevolgd door microdissectie van het brein om de ganglionic eminences te verkrijgen, dissociatie van het geoogste weefsel om een enkelcellesuspensie te verkrijgen, en tot slot het uitplaten van de cellen in een neurosphere-kweek. Hallo, ik ben Hassan Ali van het laboratorium van Dr. Brent Frenells aan het University of Florida Mite Brain Institute.

Vandaag laat ik u zien hoe u een neurosfeer-cultuur opzet vanuit het embryonale muizenbrein met behulp van de neurosfeer-assay. In ons laboratorium gebruiken we deze assay routinematig om neurale stamcellen te isoleren en te expanderen. Laten we beginnen.

Anestheseer een getijde zwangere muis. Voer op dag 14 van de dracht een cervicale dislocatie uit en spoel de buikholte met 70% ethanol. Pak de huid over de buik vast met een grote pincet en knip vervolgens de huid en de onderliggende fascia door met een grote schaar.

Om de buikholte en de uterinehoorns bloot te leggen, verwijdert u de uterinehoorns met de embryo's en brengt u deze over in een conische buis van 50 ml met koud hem. Nadat het uterine weefsel naar de PC twee-zuurkast is overgebracht, verwijdert u het hem uit de buis van 50 ml en spoelt u het weefsel met voldoende volume vers koud hem om verontreinigingen zoals bloed en haar te verwijderen; voer deze wasstap twee tot drie keer uit. Breng het uterine weefsel over naar een Petrischaal van 10 centimeter met koud hem.

Open de uterine horns met kleine gebogen pincetten en een schaar en breng de embryo's over naar een nieuwe schaal met koud hem. Herhaal deze procedure totdat alle embryo's zijn geoogst. Plaats de embryo's vervolgens onder de dissectiemicroscoop.

Scheid de koppen van de embryo's op het niveau van het cervicale ruggenmerg en breng deze over naar een andere petrischaal met koud hem. Houd de kop vast met fijne gebogen pincetten en gebruik microscharen. Maak eerst een horizontale snede boven de neus en snijd vervolgens in de middellijn door vanaf het voorhoofd richting de achterkant van de kop.

Zorg ervoor dat u door de huid en de schedel snijdt zonder de onderliggende hersenen te beschadigen. Verwijder de hersenen uit de schedel door de randen van het gesneden gedeelte met een achterwaartse beweging weg te duwen met de gebogen pincet. Herhaal deze procedure totdat alle hersenen uit de schedels zijn verwijderd.

Houd de hersenen stevig vast met de gebogen pincet zodat de dorsale zijde naar boven is gericht, en knip vervolgens met microschaar door de cortex van elke hemisfeer, vanaf de olfactory bulbs naar de achterzijde van de hemisfeer. Om de ganglionic eminences bloot te leggen, houdt u de hersenen op hun plaats en dissekeert u de volledige ganglionic eminence uit met een pincet onder een hoek van 45 graden, waarna u deze overbrengt naar een andere Petrischaal. De ganglionic eminence is hier duidelijk zichtbaar met zijn mediale en laterale delen.

Als alternatief kunt u de ganglionic eminences dissekeren door het omliggende weefsel met een fijn pincet te verwijderen. U kunt de gehele eminence ook in een mediale en een laterale helft snijden, indien u geïnteresseerd bent in het kweken van cellen uit een van deze regio's.

Herhaal deze procedure totdat alle hersenen zijn gemicro-gesectioneerd. Gebruik één milliliter neuraal stamcelmedium om de weefselstukjes te verzamelen en over te brengen naar een centrifugebuis van 15 milliliter. Laat de weefselklonters in de 15 milliliter buis bezinken om te voorkomen dat er weefsel achterblijft.

Verwijder een deel van het supernatant medium en spoel de bodem van de Petrischaal om eventueel resterend weefsel over te brengen naar de 15 ml buis. Plaats de pipetpunt tegen de bodem van de buis. Pipetteer de suspensie drie tot vier keer op en neer om het weefsel op te breken en zo een enkelcellige suspensie te verkrijgen.

Laat de suspensie vervolgens één minuut bezinken, zodat de niet-geassocieerde klonten neerslaan, en overbreng bijna de gehele celsuspensie naar een andere kolf van 15 ml. Voeg vervolgens één milliliter neuro-stamcelmedium toe aan de resterende klonten en dissocieer deze tot enkelvoudige cellen. Pipetteer de inhoud van de buisjes op.

Centrifugeer de suspensie vervolgens gedurende vijf minuten bij 700 RPM of 110 G. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in één milliliter compleet neuro stamcelmedium. Neem 10 µL van de celsuspensie en meng dit goed met 90 µL trypaanblauw.

Neem vervolgens 10 µL van deze suspensie en breng deze over naar een hemocytometer. Voer een cel telling uit. Breng in totaal 20 ml volledig neuraal stamcelmedium over naar een conische buis van 50 ml om één T 80-fles uit te platen.

Meng vervolgens de celsuspensie en voeg een passende hoeveelheid cellen toe voor een totale dichtheid van 200 000 cellen per milliliter of 4 miljoen cellen per T 80-fles. Voeg EGF toe tot een eindconcentratie van 20 nanogram per milliliter. Meng de cellen in compleet neuraal stamcelmedium met groeifactor en breng de celsuspensie over in T 80-flessen.

Label de kolf en bestudeer de cellen onder de microscoop om er zeker van te zijn dat er sprake is van een single cell suspension zonder weefselklontjes. Plaats de kolf gedurende vijf tot zeven dagen in een incubator bij 37 °C met 5% CO2. Evalueer de kolf na vijf tot zeven dagen onder de microscoop.

Tegen deze tijd zijn de neurosferen gevormd, zouden ze een diameter van 150 tot 200 micron moeten hebben en zijn ze klaar om gesubcultured te worden. Verzamel de inhoud van de kolf in een steriele weefselkweekbuis van geschikte grootte, centrifugeer de buis en verwijder het supernatant. Resuspendeer de sferen in één milliliter voorverwarmde trypsine en plaats de buis gedurende twee minuten in een waterbad van 37 °C.

Voeg vervolgens een gelijk volume trypsineremmer toe en meng goed maar voorzichtig om de trypsineactiviteit te stoppen. Centrifugeer opnieuw en verwijder het supernatant. Resuspendeer de cellen vervolgens in één milliliter volledig neuraal stamcelmedium en voer een celtelling uit zoals eerder beschreven. Om één T 1 75-fles uit te platen, brengt u in totaal 40 ml volledig neuraal stamcelmedium over in een conische buis van 50 ml.

Meng vervolgens de cellen en voeg een passende hoeveelheid cellen toe voor een totale dichtheid van 50.000 cellen per M of 2 miljoen cellen per T 1 75-fles. Voeg daarna EGF toe tot een eindconcentratie van 20 nanogram per mil. Meng de cellen in volledig neuraal stamcelmedium met de groeifactor en breng de celsuspensie over naar een T 1 75-fles.

Label de kolf en plaats deze gedurende vijf tot zeven dagen in een incubator. Dit is een voorbeeld van een primaire E 14 neurale stamcelcultuur. Drie dagen na het uitplaten tonen de pijlen prolifererende clusters van neurale stamcellen.

U kunt ook cellen zien die aan het substraat zijn gehecht en gedifferentieerd zijn. Dit is een voorbeeld van een primaire E 14 neurale stamcelcultuur zeven dagen na het uitplaten. Zoals u ziet, zijn er sferen van diverse grootten.

Er zijn ook cellen aanwezig die gedifferentieerd zijn. De hoeveelheid celresten is veel lager dan bij de primaire neurosfereculturen van volwassenen. Bovendien zijn de sferen niet gecompacteerd en vertonen ze microspikes rond de periferie, wat aangeeft dat de sferen gezond en levensvatbaar zijn.

De sferen mogen niet te groot worden, omdat ze donker van kleur kunnen worden door celdood in het centrum. Grote sferen kunnen bovendien aan het substraat hechten en differentiëren. Dit is een voorbeeld van neurosferen van passage één E 14, vijf dagen na het uitplaten.

Hier zijn opnieuw de micro-spikes te zien aan de periferie van de sferen. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u neurosferen kunt kweken uit ganglionale eminenties van muizen van E 14, volgens dezelfde procedures die hier worden beschreven. U kunt neurosferen ook kweken uit andere hersengebieden, zoals de cortex en het mesencephalon.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw neurosfeer-culturen.