Name: Tot vaststelling van Embryonale Mouse Neural Stem Cell Culture Met behulp van de Neurosphere Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T20:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Leer de neurosphere-assay voor het isoleren en kweken van neurale stamcellen uit embryonale muizenhersenen. Deze methode toont microdissectie van ganglionaire eminences en celkweek voor neurowetenschappelijk onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door financiering van de Overstreet Foundation.

1. Basic Set Up Alvorens Dissection: <ol><li> Geschikt volume van complete NSC medium wordt bereid door het mengen van NeuroCult NSC basismedium en NeuroCult NSC proliferatieverdrag Supplementen op een 09:01 verhouding, respectievelijk. </li><li> Het medium wordt opgewarmd in een 37 ° C waterbad. </li><li> Koude HEPES-gebufferd minimum essentieel medium (HEM) met een hoge concentratie van antibiotica (10%) is voorbereid voor dissectie en wassen doel. Als alternatief kan NSC basaal medium met antibiotica suppletie ook gebruikt worden voor dit doel. </li><li> 25-30 ml koud HEM met antibiotica wordt verdeeld in steriele 50 ml buizen voor het innen van de embryo's. </li><li> Verschillende 10cm plastic petrischaaltjes zijn nodig om de embryo's en de hersenen houden tijdens dissectie en ook om ontleed weefsel vast te houden. </li><li> De chirurgische instrumenten, die nodig zijn om de embryo's (grote schaar, kleine puntige schaar, pincet grote, kleine gebogen tangen) of voor de embryonale hersenen dissectie (kleine tang, gebogen fijne tang, 45 ° gebogen fijne tang, en een klein schaartje) te verwijderen zijn gesteriliseerd met behulp van glaskraal sterilisator bij 250 ° C of andere beschikbare methoden autoclaaf. </li><li> Dissectie microscoop is afgenomen met 70% alcohol en het opzetten van in een laminaire flow of PC2 kap. </li></ol> 2. Oogsten E14 Mouse Hersenen en Micro-dissectie: <ol><li> Een tijd geschatte zwangere muis is verdoofd op dag 14 e van de zwangerschap op basis van een institutionele goedgekeurd dier protocol. </li><li> Cervicale dislocatie wordt uitgevoerd om te zorgen dat de dieren geen pijn en verdriet lijden. </li><li> De verdoofde muis wordt gelegd op zijn rug op een absorberend tissue papier, en de buik wordt gespoeld met 70% ethanol om het gebied te steriliseren. </li><li> De huid over de buik is begrepen het gebruik van een grote tang, en dan de huid en de onderliggende fascia wordt gesneden met grote schaar van de buikholte en de baarmoederhoorns bloot te leggen. </li><li> De baarmoeders worden verwijderd met een kleine tang en schaar en zijn overgebracht naar een 50-ml conische buis-bevattende koud HEM. </li><li> De baarmoeder weefsels worden overgebracht naar de motorkap en vervolgens een of twee keer gespoeld met voldoende volume van verse koude steriele HEM om mogelijke verontreinigingen zoals bloed en haren te verwijderen. </li><li> De baarmoeder weefsel worden vervolgens overgebracht naar een 10cm petrischaal met koud HEM. </li><li> De baarmoeder hoorns worden geopend met behulp van kleine gebogen pincet en een schaar en de embryo's worden overgebracht naar een nieuw 10cm schotel, die koud HEM bevat. </li><li> De hoofden van de embryo's worden gescheiden bij het cervicale ruggenmerg niveau en overgebracht naar een ander Petri schaaltje met koud HEM. </li><li> De petrischaal is overgedragen krachtens een dissectiemicroscoop naar de hersenen uit de schedel. </li><li> De koppen worden gehouden met een fijne gebogen pincet uit de caudale zijde om zo de dorsale zijde van het hoofd rechtop staan. Met behulp van micro-schaar, wordt eerst een horizontale snede gemaakt boven de ogen en daarna voortgezet in de middellijn van het voorhoofd naar de achterkant van het hoofd. Zorg ervoor dat u dwars door de huid en de schedel en niet op de onderliggende hersenschade. </li><li> De hersenen is verwijderd uit de schedel door op de randen van de snede in een achterwaartse beweging met behulp van de gebogen pincet. Deze procedure wordt voortgezet totdat alle hersenen worden verwijderd uit de schedels. </li><li> Het brein is stabiel gebleven met behulp van de gebogen pincet, zodat de dorsale zijde naar boven en dan geconfronteerd met behulp van microscissors een snede is uitgevoerd door de cortex van elke hemisfeer zich uitstrekt van de olfactorische lampen aan de achterkant van de hemisfeer aan het ganglionisch eminenties bloot te leggen. </li><li> Met behulp van de gebogen tang in de ene hand en de 45 ° gebogen pincet in de andere, zijn de cut flappen van de cortex te verspreiden en het ganglionisch eminenties worden ontleed uit. </li><li> De ontleed weefsel wordt geplaatst in een steriele petrischaal 10cm, en deze procedure wordt herhaald totdat alle hersenen zijn micro-ontleed. </li><li> Tissue stukken zijn verzameld met behulp van 1 ml van NSC medium in een 1 ml pipet tip en overgebracht naar een 15 ml centrifugebuis. </li><li> Weefsel wordt vervolgens gedissocieerd grondig, maar voorzichtig door het indrukken van de pipet tip om de bodem van de buis en pipetteren de schorsing op en neer. Op deze manier de klompen worden opgesplitst in afzonderlijke cellen. Pipetteren is uitgevoerd 3-4 keer zodat er een melkachtige als suspensie is ontstaan. Vervolgens wordt de suspensie mag zo genoegen nemen met 1-2 minuten als de niet-gesplitste klonten precipitaten. </li><li> Bijna de gehele celsuspensie wordt overgebracht naar de andere buis en dan nog 1 mL van NSC medium wordt toegevoegd aan de resterende klompen en gedissocieerde naar een cel, zoals beschreven. </li><li> De inhoud van de buizen worden samengevoegd en gecentrifugeerd gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, bij 700rpm (110g). </li><li> Het supernatant wordt gestofzuigd af naar de werkelijke pellet, en de cellen worden opnieuw gesuspendeerd in 1 ml van complete NSC medium. </li><li> Het medium is voorzichtig gepipetteerd op en neer omhebben een homogene enkele celsuspensie. </li><li> 10 pi van de celsuspensie wordt gemengd met 90 pi van trypan blauw om een ​​celgetal te voeren. </li><li> Ten slotte worden de cellen uitgeplaat op de dichtheid van 2x10 5 cellen / ml in volledig NSC medium aangevuld met 20ng / mL epidermale groeifactor (EGF). 5 ml medium wordt gebruikt voor T25, 20 ml voor T75 en 40 ml voor T175 kolven. </li><li> Neurospheres worden gevormd in 5-7 dagen toen geïncubeerd bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO 2. In 6-7 dagen, moeten de bollen te meten tussen de 150 tot 200 micron en zullen klaar zijn om een ​​subcultuur (passage). </li></ol> 3. Passage en uitbreiding van de embryonale NSC: <ol><li> Wanneer de neurospheres klaar zijn voor subcultuur (150-200 micrometer in diameter), is het medium met onderbroken bollen verwijderd van de kolven, geplaatst in een geschikte grootte steriele cultuur buis, en gecentrifugeerd bij 700 tpm (110 g) gedurende 5 min bij kamertemperatuur. </li><li> Het supernatant wordt verwijderd en de sferen zijn geresuspendeerd in 1 ml van 0,05% trypsine-EDTA. </li><li> De celsuspensie wordt vervolgens geïncubeerd in een 37 ° C waterbad gedurende 2-3 minuten, dan een gelijk volume van soja trypsine-remmer wordt gebruikt om de trypsine-activiteit te stoppen. </li><li> De celsuspensie wordt zachtjes gepipetteerd op en neer om ervoor te zorgen dat de trypsine volledig is geïnactiveerd. </li><li> De celsuspensie wordt gecentrifugeerd bij 700 tpm (110 g) gedurende 5 minuten. Vervolgens wordt het supernatant verwijderd en de cellen worden opnieuw gesuspendeerd in 1 ml van complete NSC medium. </li><li> 10 pi van de celsuspensie wordt gemengd met 90 pi van trypan blauw om een ​​celgetal te voeren. </li><li> De cellen worden uitgeplaat bij een concentratie van 5x10 4 cellen / ml in volledig NSC medium aangevuld met 20ng / mL EFG in een geschikte grootte weefselkweek kolf. 5 ml medium wordt gebruikt voor T25, 20 ml voor T75 en 40 ml voor T175 kolven. </li><li> Secundaire neurospheres worden gevormd in 5-7 dagen toen geïncubeerd bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO 2. </li></ol> 4. Representatieve resultaten: Bij primaire embryonale NSC cultuur, zal de meerderheid van de cellen hypertrofische en hechten aan de weefselkweek gerechten op plating. Terwijl de meerderheid van de cellen zal ofwel sterven of te onderscheiden, na 2-3 dagen, proliferatieve cellen te maken kleine clusters van cellen die los van het substraat (figuur 1). Vorming van grote bolvormige aggregaten in de eerste 48-uren van de cultuur moet niet worden verward met de primaire bollen. Totale formatie hangt vooral af van de bedragen van puin en niet-gesplitste weefsel klonten in de cultuur. Echte neurospheres zijn fase helder en meer sferische als grootte toeneemt (Figuur 2). Kleine microspikes verschijnt op de buitenkant van levensvatbare en gezonde bollen (figuur 3). Na 5-7 dagen, moet de sferen rond zijn, maar niet verdicht, en moet tussen de 150 en 200 micrometer in diameter te meten. Als neurospheres kunnen groeien te groot (na 9-10 dagen in cultuur), kunnen ze vormen aggregaten of donker van kleur omdat van celdood in het midden van de bollen (zie video). Grote neurospheres kan uiteindelijk beginnen te differentiëren in situ (vastmaken aan de ondergrond en het migreren van de richting van de periferie). Het is ook moeilijk om grote neurospheres dissociëren en subcultuur ze. <img src="/files/ftp_upload/2457/2457fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Primaire E14 NSC cultuur 3 dagen na de plating. Pijlen geven de prolifererende clusters van NSC. Originele vergroting; 20x <img src="/files/ftp_upload/2457/2457fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Primaire E14 NSC cultuur 7 dagen na plating. Originele vergroting; 10x <img src="/files/ftp_upload/2457/2457fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Passage een E14 neurospheres 5 dagen na plating. Let op de micro-spikes (pijlen) aan de rand van de bollen. Originele Vergroting; 20x

<ol><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>Morshead, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+in+the+adult+mammalian+forebrain%3A+a+relatively+quiescent+subpopulation+of+subependymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells.</a> Neuron. 13, 1071-1082 (1994).</li>
<li>Craig, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+growth+factor+expansion+of+endogenous+subependymal+neural+precursor+cell+populations+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo growth factor expansion of endogenous subependymal neural precursor cell populations in the adult mouse brain.</a> J Neurosci. 16, 2649-2658 (1996).</li>
<li>Golmohammadi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+the+frequency+and+distribution+of+stem+and+progenitor+cells+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain.</a> Stem Cells. 26, 979-987 (2008).</li>
<li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., BA, R. eynolds <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+and+neurospheres--re-evaluating+the+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship.</a> Nat Methods. 2, 333-336 (2005).</li>
<li>Louis, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+neural+stem+and+progenitor+cells+in+the+neural+colony-forming+cell+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay.</a> Stem Cells. 26, 988-996 (2008).</li>
</ol>

De neurosphere assay is de methode van keuze voor de isolatie en de uitbreiding van neurale stamcellen 1-5 vanwege de eenvoud en reproduceerbaarheid. Deze test is een waardevol instrument voor grootschalige opwekking van ongedifferentieerde CNS voorloper cellen, die kunnen worden gebruikt voor zowel in vitro als in vivo studies. Benadrukt moet worden dat neurospheres kunnen worden gegenereerd uit zowel de bonafide neurale stamcellen en meer beperkt voorlopers. Daarom is de berekening van de neurosphe...

* Om HEM te maken, mix 110L pakje MEM and160ml van 1M HEPES en breng het volume tot 8,75 L met gedestilleerd water. Stel de uiteindelijke pH naar 7,4 en op te slaan bij 4 ° C.

tot vaststelling van embryonale mouse neural stem cell culture met behulp van de neurosphere assay

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In zoogdieren, stamcellen fungeert als een bron van ongedifferentieerde cellen naar cel ontstaan ​​en vernieuwing in verschillende weefsels en organen te behouden gedurende de levensduur van het dier. Ze kunnen eventueel vervangen door cellen die verloren zijn gegaan in het verouderingsproces en bij het proces van letsel en ziekte. Het bestaan ​​van neurale stamcellen (NSCs) werd voor het eerst beschreven door Reynolds en Weiss (1992) in de volwassen centrale zenuwstelsel (CZS) met behulp van een nieuw serum-vrije cultuur systeem, de neurosphere assay (NSA). Met behulp van deze test, is het ook mogelijk te isoleren en uit te breiden NSCs uit verschillende regio&#39;s van de embryonale CZS. Deze in vitro uitgebreid NSCs zijn multipotente en kunnen aanleiding geven tot de drie belangrijkste celtypes van het centrale zenuwstelsel. Terwijl de NSA lijkt relatief eenvoudig uit te voeren, de aandacht voor de procedures aangetoond hier is nodig om betrouwbare en consistente resultaten te bereiken. Deze video toont op een praktische NSA te genereren en te NSCs uit te breiden van embryonale dag 14-mouse hersenweefsel en zorgt voor technische details, zodat men kan bereiken reproduceerbaar neurosphere culturen. De procedure omvat het oogsten E14 muizenembryo&#39;s, de hersenen microdissectie het ganglion eminenties, dissociatie van het geoogste weefsel in NSC medium oogst naar een enkele celsuspensie te krijgen, en uiteindelijk plating cellen in NSA cultuur. Na 5-7 dagen in cultuur, zijn de resulterende primaire neurospheres gepasseerd verder uit te breiden het nummer van de NSCs voor toekomstige experimenten.

Deze video toont protocol de toepassing van de neurosphere test voor de isolatie en de uitbreiding van neurale stamcellen van het ganglionisch eminenties van embryonale dag 14-hersenen van muizen.

Tot vaststelling van Embryonale Mouse Neural Stem Cell Culture Met behulp van de Neurosphere Assay

Bij zoogdieren fungeren stamcellen als een bron van ongedifferentieerde cellen om de celgenese en vernieuwing in verschillende weefsels en organen gedurende het leven te handhaven ...

Het doel van dit videoprotocol is om neurale stamcellen te isoleren en te expanderen uit het embryonale muizenbrein met behulp van de neurosphere-assay. De procedure omvat het oogsten van E 14 muizenembryo's, gevolgd door microdissectie van het brein om de ganglionic eminences te verkrijgen, dissociatie van het geoogste weefsel om een enkelcellesuspensie te verkrijgen, en tot slot het uitplaten van de cellen in een neurosphere-kweek. Hallo, ik ben Hassan Ali van het laboratorium van Dr. Brent Frenells aan het University of Florida Mite Brain Institute.Vandaag laat ik u zien hoe u een neurosfeer-cultuur opzet vanuit het embryonale muizenbrein met behulp van de neurosfeer-assay. In ons laboratorium gebruiken we deze assay routinematig om neurale stamcellen te isoleren en te expanderen. Laten we beginnen.Anestheseer een getijde zwangere muis. Voer op dag 14 van de dracht een cervicale dislocatie uit en spoel de buikholte met 70% ethanol. Pak de huid over de buik vast met een grote pincet en knip vervolgens de huid en de onderliggende fascia door met een grote schaar.Om de buikholte en de uterinehoorns bloot te leggen, verwijdert u de uterinehoorns met de embryo's en brengt u deze over

establishing-embryonic-mouse-neural-stem-cell-culture-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Deze video protocol laat de neurosphere assay methode voor het genereren en uit te breiden neurale stamcellen uit een volwassen muis periventriculaire regio, en biedt technische inzichten om ervoor te zorgen kan men reproduceerbare neurosphere culturen te bereiken.

Isolatie en uitbreiding van de volwassen muis neurale stamcellen Met behulp van de Neurosphere Assay

Deze video protocol laat zien hoe om te discrimineren en te goeder trouw neurale stamcellen te sommen in een gemengde populatie van neurale voorloper cellen met behulp van de neurale kolonievormende cell assay.

Neurale-Colony Forming Cell-test: Een test om Bona Fide neurale stamcellen van Neural Progenitor Cellen Discrimineer

Deze video protocol geeft blijk van een nieuwe methode voor het genereren en daaropvolgende zuivering van neuronale stamcellen uit een hernieuwbare bron van neurale stamcellen (NSC) op basis van hun fysieke (grootte en interne granulariteit) en fluorescerende eigenschappen met behulp van flowcytometrie-technologie.

De Neuroblast test: een test voor de generatie en de verrijking van Neuronale stamcellen uit Onderscheidende factor voor neurale stamcellen Nakomelingen met behulp van flowcytometrie

The video demonstrates the process of isolating and culturing neural stem cells from the mouse brain's subcallosal zone. It involves dissecting tissue, enzymatic dissociation, and culturing them with differentiation factors to develop into mature neural cells.

Isolation and Culturing of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

This video demonstrates a detailed protocol for isolating the lateral ventricle walls from the adult mouse brain and performing enzymatic tissue dissociation to obtain single cells. These cells are then subjected to specific culture conditions that selectively enhance the proliferation of neural stem cells and promote their differentiation into co-cultures of oligodendrocytes and astrocytes.

Obtaining a Mixed Oligodendrocyte and Astrocyte Culture From Adult Mouse Neural Stem Cells

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het gelijktijdig opwekken van neurale precursoren celculturen, hetzij als hechtende monolagen of neurosferen, uit de subventriculaire zone en dentate gyrus van individuele volwassen muizen.

Een muis, twee culturen: Isolatie en Cultuur van adulte neurale stamcellen uit de Twee Neurogeen Zones van individuele muizen

Neurale stamcellen (NSC) verwijzen naar cellen die kunnen zichzelf vernieuwen en differentiëren in de drie neurale geslachten. We beschrijven hier een protocol NSC frequentie te bepalen in een bepaalde celpopulatie via neurosfeer vorming en differentiatie onder klonale omstandigheden.

Opsomming van neurale stamcellen Met behulp van klonen Testen

Hier tonen we de prestaties van een minimale ruggenmerg letsel model in een volwassen muis die de centrale kanaal niche huisvesting endogene neurale stamcellen (NSCs spaart). Laten we zien hoe de bepaling van de neurosphere kan worden gebruikt voor het kwantificeren van activering en migratie van definitieve en primitieve NSCs na verwonding.

Een test van de Neurosphere voor de evaluatie van de activering van de endogene neurale stamcellen in een muismodel van minimale dwarslaesie

Hier introduceren wij een nieuwe microchirurgische techniek voor de isolatie van neurale stamcellen uit de E13 muis embryo ganglionaire eminentie.

Isolatie en cultuur van muis embryonale neurale stamcellen

In dit artikel beschrijven we, in detail, een protocol voor het genereren van neurosfeerculturen uit postnatale muisneurale stamcellen afkomstig van de belangrijkste muisneurogene niches. Neurosferen worden gebruikt om neurale stamcellen te identificeren uit hersenweefsel waardoor de schatting van voorloper celnummers. Bovendien kunnen deze 3D-structuren worden verguld met differentiërende omstandigheden, waardoor neuronen, oligodendrocyten en astrocyten ontstaan, waardoor het cellot kan worden...

Isolatie en uitbreiding van Neurosferen van Postnatale (P1−3) Muis Neurogene Niches

Hier beschrijven we een nucleofectiesysteem dat is ontworpen om de efficiëntie van genafgifte te verbeteren in uitgebreide neurale stamcellen (NSC's) geïsoleerd uit de subventriculaire zone van volwassen muizen. De bevindingen tonen aan dat deze methode de genverstoring in NSC's aanzienlijk verbetert, de effectiviteit van traditionele transfectieprotocollen overtreft en de celoverleving verbetert.

Isolatie, expansie en nucleofectie van neurale stamcellen uit de subventriculaire zone van volwassen muizen

Leer de neurosphere-assay voor het isoleren en kweken van neurale stamcellen uit embryonale muizenhersenen. Deze methode toont microdissectie van ganglionaire eminences en celkweek voor neurowetenschappelijk onderzoek.

Tot vaststelling van Embryonale Mouse Neural Stem Cell Culture Met behulp van de Neurosphere Assay

Meer video's verkennen